שיטת UPLC-UV משופרת לכימות ויטמין C בזני חסה(לקטוקה סאטיבה L.) וקרובי משפחה פראיים(Lactuca spp.)

ויטמין C הוא אינדיקציה לערך התזונתי של פירות וירקות. אנחנו צריכים שיטה קלה ואמינה לכמת אותו, במיוחד חסה, הירק עלים הנצרך ביותר ברחבי העולם. שיטה זו מונעת השפלה של ויטמין C, ומספקת מיצוי משופר וכמות מהיר ואמין של חומצות אסקורביות ודהידרוסקרביות, הודות לדיוק ולרגישות שלו.

שיטה זו יכולה לשמש בטכנולוגיית מזון כדי ליצור תוויות עובדות תזונתיות, ברפואה כדי ללמוד השפעות מזון על בריאות ועל הרבייה של צמחים, כדי להגדיל את התוכן ויטמין C במינים שונים. הדגמת ההליך עם Ines מדינה לוזאנו, יהיה חוזה אנג'ל Aranjuelo ו Arantzazu Castellanos, שני אנליסטים מהמעבדה שלי. כדי להכין את דגימות הצמח, לקצור לפחות אחד חיצוני עלה פנימי אחד לכל צמח מיד להקפיא את העלים בחנקן נוזלי, לפני הצבת אותם מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון.

כדי lyophilize דגימות הצמח הקפוא, מניחים את צינורות מדגם לא מנוצל על המגשים בתוך תא מייבש ההקפאה של lyophilizer, ולתכנת את lyophilizer כפי שצוין. לשמור על טמפרטורת מעבה במינוס 80.2 מעלות צלזיוס, ואת קבוע ואקום ב 112 כאשר החומר יבש לחלוטין, להוסיף כדורי נירוסטה בקוטר 10 מילימטר לדגימות ליופילים, ב 20 צינורות פוליפרופילן מיליליטר. ולהשתמש Vortexer רב צינור, בזמן המתאים ובעוצמה, כדי לטחון את הדגימות לתוך אבק דק.

כדי להכין פתרונות מלאי ודילול של חומצה אסקורבית, שקלו בדיוק 10 מיליגרם של תקן חומצה אסקורבית באיזון מדויק. וב-90 מיליליטר של שלב נייד לדגימה. השתמשו בערבב מגנטי כדי להמיס את הדגימה, ולהשתמש בבקבוק נפחי כדי למדוד במדויק 100 מיליליטר של הפתרון שנוצר.

הוספת מים אולטרה-חמים נוספים, חומציים ב-pH 2 עם חומצה פורמית, לפי הצורך. לאחר מכן הכינו חמישה דילולים מהמלאי, כדי להשיג עקומת כיול. עובדים תחת עוצמת אור נמוכה, מוסיפים 50 מיליגרם של דגימת קרקע ליופילית וחמישה מיליליטר של ממס מיצוי, לצינור צנטריפוגה פוליפרופילן 15 מיליליטר ומערבולת הפתרון במשך חמש שניות.

לאחר טלטול המדגם במשך 10 דקות על שייקר מסלולית ב 2000 מהפכות לדקה, להעביר את הצינור לאמבט קולי במשך 10 דקות, בטמפרטורת החדר ולאסוף את המדגם על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן מסננים את העל-טבעי באמצעות מסנן תאית מחדש של 0.22 מיקרון, לתוך בקבוקון ענבר של חמישה מיליליטר, כדי לחלץ הן את החומצות האסקרביות והן את החומצות הדהידרוסקורביות בתמצית אחת. כדי להכין את הדילול לקביעת ריכוז החומצה האסקרבית בדגימות העלים, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תמצית אחת, ו-800 מיקרוליטרים של מים אולטרה-חמים לבקבוקון כרומטוגרפיה נוזלי ענבר של שני מיליליטר, וסגרו את הבקבוקון עם תקע PTFE/סיליקון.

עבור מיצוי חומצה אסקורבית הכוללת, להעביר 200 microliters של תמצית אחד, לתוך בקבוקון כרומטוגרפיה נוזלי ענבר שני מיליליטר, ולהוסיף 200 microliters של פתרון הפחתת הבקבוקון. סגור את הבקבוקון עם תקע ומערבולת הפתרון במשך חמש שניות. לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנת מפני אור, השתמש 200 microliters של 0.4 חומצה גופרתית Molar, כדי לעצור את התגובה כדי לייצב את החומצה אסקורבית, ל- pH חומצי.

כדי להכין את הדילול לקביעת ריכוז החומצה האסקרבית הכולל בדגימות, להוסיף 400 microliters של מים אולטרה חוץ, כדי תמצית חומצה אסקורבית הכוללת שתיים. סגור את הבקבוקון עם תקע. לפחות שעה לפני תחילת הניסוי, ודא שכל פתרונות העבודה נטענו למערכת UPLC והפעל את שלושת מודולי UPLC.

לאחר סיום תהליך הכיול הפנימי, פתח את התוכנה וטען את התוכנית האינסטרומנטלית. לאחר שהתוכנה נטענת לחץ על מנהל ממס Quaternary ולחץ על לחצן העכבר הימני כדי לבחור מסוף הפעלה, כדי לגשת למסוף הניהול של UPLC. לחץ על מערכת, בקרה והפעלה, כדי להמשיך הכנה וייצוב של מכשיר UPLC, ולחץ על ממסים ראשוניים, QSM, לבדוק A, B, C, D, שטיפת חותם ומשך של פריים, יותר מחמש דקות, כדי לטהר את כל קווי UPLC, לפחות חמש דקות.

לחץ על SM, לבדוק לשטוף ממס גדול מ 45 שניות. בדוק לטהר ממס, ו 35 מחזורים כדי לטהר ולנקות את המזרק. כדי לצייד את UPLC לתנאי פעולת שירות, בדוק את שיווי המשקל לשיטה ול- QSM והגדר את הזרימה ל- 0.3 מיליליטר לדקה.

ממס A עד 2%ממס B עד 0%ממס C 98%ו- D ממס עד 0% עדיין ב- Equilibrate לשיטה ו- SM והגדר את המדגם ל- 5 מעלות צלזיוס, ואת העמודה ל- 30 מעלות צלזיוס. עדיין ב'שיווי משקל לפעולות שירות' ו'אחר', בחרו 'מנורה ב' ולחצו על 'התחל'. אפשר לציוד להתייצב לפחות שעה.

כדי לאמת את היציבות, לחץ על הפעל מערכת מסוף ו- QSM ובחר לחץ מערכת QSM, רק כדי לבדוק את הלחץ בעמודה. אם אין מגמות הניתנות לזיהוי בשינויי הלחץ, וערך הדלתא הוא פחות מ -10 פאונד לאינץ 'מרובע של לחץ, במסך ההתחלה המהירה, מלא את המטריצה בשמות התקנים והדגימות שיש לנתח. כדי לקבוע את ריכוז החומצה האסקרבית בתקנים, להזריק חמישה microliters של כל דילול לתוך מכשיר UPLC, ולבצע את הכרומטוגרפיה, החל מדולל ביותר, כדי הפתרון המרוכז ביותר כפי שצוין בטבלה.

כדי לקבוע את החומצה האסקוריבית ואת ריכוז החומצה האקורבית הכולל בדגימות העלים, להזריק חמישה microliters של תמצית מדולל אחד ולחלץ שניים בהתאמה, לתוך מכשיר UPLC לניתוח כרומטוגרפי. כדי לחשב את החומצה אסקורבית ואת ריכוזי חומצה אסקורבית הכוללת, בתוכנה לחץ Quickstart, עיון פרויקט, ערוצים, שם התקן או המדגם ואת ערוץ מחשב כף יד אחד, 245 ננומטר ב 1.2 ננומטר. כדי לפתוח את הכרומטוגרמות הסטנדרטיות והדוגמאות, לחץ על נקודת ההתחלה של הכרומטוגרמה וגרור אותה לנקודת הסיום, כדי לשלב את השיא המתאים בסטנדרטים ובדגימות.

לאחר מכן השתמש בנתונים מהדילולים הסטנדרטיים של חומצה אסקורבית, כדי לבנות עקומת כיול, כדי לייצג את ערכי הספיגה שנקבעו כרומטוגרפית ולאינטרפולציה של ערכי הספיגה של המדגם, כדי להשיג את החומצה האסקוריבית ואת ריכוז החומצה האסקרבית הכולל, על פי הנוסחה. כימות ויטמין C במטריצות Lactuca, דורש פיתוח של גישה כרומטוגרפית שיכולה להבטיח תוצאות אמינות. כאן, ניתן לראות כרומטוגרמה הנובעת מפרוטוקול לא ממוטב המציג ופסגת חומצה אסקורבית, יחד עם כתף כורה לא מזוהה.

עם זאת, לאחר שיפור החילוץ ואת התנאים הכרומטוגרפיים, שיא חומצה אסקורבית נפתרה ללא הפרעות של תרכובות לא ידועות ניתן להשיג. בנוסף, השימוש בציוד אולטרה סגול של UPLC, במקום HPLC אולטרה סגול, מפחית את זמני השמירה וההפעלה. הפרעות בפסגות חומצה אסקורבית, גורמות באופן עקבי להמעיט בערכו של תוכן ויטמין C, עקב הפרדה לא מספקת במהלך התהליך הכרומטוגרפי.

כאשר אזורי השיא החופפים משולבים בירידה אנכית בנקודה העמוקה ביותר ביניהם. יתר על כן, השימוש בפרוטוקול לא אופטימיזציה מונע את החילוץ של כל מסקנה שימושית, מן התוצאות. כמו כל הדגימות נראה שיש תוכן ויטמין C דומה, בכל אחת מהצורות שלה.

לעומת זאת, השימוש בפרוטוקול הממוטב מאפשר זיהוי של הבדלים מובהקים סטטיסטית בין סוגי הדגימות השונים. הקפד לאסוף דגימות מרובות, כדי לשמר את הדגימות כראוי, כדי למזער את החשיפה של המדגם לסוכני חמצון ולכומת את שתי הצורות של ויטמין C.The התוכן הכולל ויטמין C ניתן לכמת לא רק בכל מיני צמחים, אלא גם, בכל פרי בכל פרי וירקות, או אפילו מזון מעובד עם שינויים בטכניקה מעטים.