Name: בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: למדו פרוטוקול להבדלה של תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים בשיטת הטיפה התלויה. השיטה כוללת ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנציה וציטומטריית זרימה לחקר התפתחות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מ- NIH (1R35GM133496-01) ל- Z. Gao. ברצוננו להודות לד"ר ריאן הובס על הסיוע בחתך. אנו מודים למתקני הליבה של מכללת פן סטייט לרפואה, כולל מדעי הגנום וביואינפורמטיקה, הדמיית מיקרוסקופיה אור מתקדמת, ואת Cytometry הזרימה. אנו מודים גם לד"ר יוקה אימאמורה על הסיוע בניתוח RNA-seq.

1. תרבות mESC
<ol><li>יש לצפות צלחת 10 ס"מ שטופלו בתרבית הרקמות עם 0.1% ג'לטין ולאפשר לג'לטין להתקבע לפחות 15-30 דקות לפני שהוא שואף החוצה.</li>
	<li>זרע γ עכבר עוברי (MEFs) יום אחד לפני פולחן mESCs במדיום mESC מחומם מראש (המדיום הנשר (DMEM) של Dulbecco עם 15% סרום בקר עוברי (FBS), חומצות אמינו לא חיוניות, β-mercaptoethanol, L-גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, נתרן פירובט, LIF, PD0325901 (PD) ו Chir99021 (CH)).</li>
	<li>אפשרו ל-MEFs המוקרנים γ להתיישב ולהצמיד למשטח הלוח לפני שאתם פולחים תאי E14.</li>
	<li>להפשיר E14 ESCs באמבט מים 37 °C ולהעביר במהירות את התאים בצינור חרוט 15 ס"מ עם בינוני mESC חם. גלולה את התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>resuspend התאים ב 10 מ"ל של בינוני mESC צלחת התאים על צלחת התרבות המכילה את MEFs המוקרן γ זרע קודם לכן. לדגור על תרבית התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% CO2.</li>
	<li>עבור תרבות passaging, לשאוף e המדיום לשטוף את הצלחת עם PBS סטרילי 1x. מוסיפים מספיק 0.05% טריפסין כדי לכסות את משטח הצלחת ודגור ב 37 °C (3 דקות).</li>
	<li>לנטרל את טריפסין עם בינוני mESC ו pipette כדי ליצור השעיה של תא יחיד. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>לספור את התאים עם hemocytometer או מונה התא ולזרוע על 5.0 x 105 תאים בצלחת תרבית 10 ס"מ.</li>
	<li>Resuspend התאים ב 10 מ"ל של בינוני mESC, צלחת התאים על צלחת תרבית רקמות מצופה ג'לטין ותרביות דגירה כפי שתואר קודם לכן. הערה: מומלץ להעביר mESCs כל יומיים כדי למנוע מהתאים להבדיל במושבות שלהם. פנול אדום בפונקציות בינוניות אך ורק כמו מחוון pH ובהתאם לצפיפות התא, זה יכול להפוך צהבהב (חומצי יותר), מוקדם יותר מ 2 ימים. לפיכך, ייתכן שיהיה צורך לשנות את המדיום כל יום. ה-MEFs המוקרנים γ בסופו של דבר ימותו אחרי כמה קטעים.</li>
</ol>2. EB, NPC, ובידול נוירונים
<ol><li>בצע פרוטוקול העברת תרבית שהוזכר קודם לכן וספור את התאים (שלבים 1.7-1.10).</li>
	<li>שיטת טיפה תלויה (יום 0)<ol>
<li>עבור צלחת תרבית תאים 10 ס"מ, לספור בערך 2.5 x 104 תאים שבהם 5.0 x 102 תאים יושעו 20 μL הבחנה בינונית (DMEM עם 15% FBS, חומצות אמינו לא חיוניות, β-mercaptoethanol, L-גלוטמין, פניצילין / סטרפטומיצין, ונתרן pyruvate). בערך חמישים 20 טיפות μL המכילות את התאים ניתן צלחת אחת 10 ס"מ.</li>
		<li>Aliquot המספר המתאים של תאים, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 200 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
		<li>resuspend התאים בנפח המתאים של מדיום בידול עבור צפיפות תא של 5.0 x 102 תאים לכל 20 μL (למשל, 2.5 x 104 תאים ב 1 מ"ל של בינוני בידול).</li>
		<li>באמצעות מיקרופיפט או פיפטה מהדרת, מניחים 20 טיפות μL של השעיית התא על המכסה של צלחת תרבית הרקמות. ודא כי טיפות אינן קרובות מדי זה לזה כדי למנוע מהם להתמזג. הערה: הטיפות יכולות להיות מצופות על צלחת קובץ מצורף שטופלו בתרבית הרקמות או צלחת השעיה מכיוון שהן יונחו על המכסה ולא על הצלחת עצמה. לקבלת גישה ריאלית וסטרילית יותר, צלחת את הטיפות על צלחת תרבית רקמות מצורף ולהעביר אותם לצלחת השעיה כמתואר להלן.</li>
		<li>ממלאים את הצלחת ב-5-10 מ"ל של 1x PBS ומחזירים בזהירות את המכסה לצלחת. לדגור על התרבות באינקובטור 37 °C (37 °F). הערה: PBS מתווסף לצלחת התרבות כדי למנוע את הטיפות להתייבש.</li>
	</ol></li>
	<li>ביום 2, להשתמש micropipette כדי לאסוף את הטיפות מהמכסה ומניחים אותם בצלחת השעיה תרבית תא 10 ס"מ מלא 10 מ"ל של מדיום בידול. לדגור את התרבות על שייקר מסלולי רועד במהירות נמוכה באינקובטור.</li>
	<li>ביום 4, כדי לקצור את EBs, לאסוף את התאים, צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant. הערה: EBs ניתן גם לשטוף עם 1x PBS בהתאם לדרישות של ניסויים הבאים.</li>
	<li>כדי להמשיך את ההליך ולעורר את בידול EB לתאי אב עצביים (NPCs), להכין את מדיום הבידול עם 5 מיקרומטר חומצה רטינואית (RA).</li>
	<li>הסר את המדיום הישן על ידי גלולה EBs ב 100 x g במשך 3 דקות או לאפשר EBs להתיישב לפני שאיפה את המדיום הישן. הוסף 10 מ"ל של מדיום הבידול המכיל 5 μM RA ללוח התרבות.</li>
	<li>ביום 6, להחליף לפחות מחצית המדיום עם מדיום טרי המכיל 5 μM RA על ידי הטיית הצלחת וצינור החוצה המדיום כמתואר לעיל. הערה: מומלץ להחליף לפחות מחצית מהמדיום במדיום רענן המכיל RA בימים 5 ו -7. שימו לב למדד האדום פנול; אם זה הופך צהבהב, עדיף להחליף את כל המדיום.</li>
	<li>ביום 8, לקצור את NPCs על ידי איסוף התאים, centrifuging ב 200 x g במשך 3 דקות, והסרת supernatant. הערה: NPCs ניתן גם לשטוף עם PBS 1x בהתאם לצרכים של ניסויים הבאים. במידת הצורך, NPC יכול להיות קפוא ולהפשיר שוב לתרבות וניתוח מאוחרים יותר. אם NPC הם להיות תרבותי, accutase יכול לשמש גם כחלופה טריפסין.</li>
	<li>כדי להמשיך את ההליך ולהבדיל NPCs לנוירונים, לאסוף NPCs בצינור חרוט 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה, לנתק אותם עם טריפסין ולדגירה אותם ב 37 °C (3 דקות). Pipette NPCs כדי להבטיח כי כל אגרגטים NPC מנותקים ולנטרל את טריפסין עם המדיום.</li>
	<li>לסנן את התאים עם מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר ולספור את התאים לפני ציפוי אותם בצפיפות של 1.5 x 105/cm2 בינוני N2 (DMEM / F12 בינוני + 3 מ"ג / מ"ל גלוקוז + 3 מ"ג / מ"ל שור עשיר בשומנים אלבומין בסרום (LBSA) + תוספת 1:100 N2 + 10 ננוגרם / מ"ל bFGF + 50 U / mL עט / סטרפטוקומין + 1 mM L-גלוטמין) על צלחת שטופלו תרבית רקמות לניסויי PCR וכתם מערביים הבאים; או על תא תרבית רקמות לניסויים אימונופלואורסצנטיים.</li>
	<li>ביום 9, להחליף את המדיום הישן עם מדיום N2 טרי.</li>
	<li>ביום 10, לעבור את N2 בינוני עם N2/B27 בינוני (50% DMEM / F12 ו 50% בזלת עצבית, 3 מ"ג / מ"ל LBA, 1:200 תוספת N2, תוספת 1:100 B27, 50 U / mL עט / סטרפטופון, ו 1 מ"מ L-גלוטמין).</li>
	<li>בימים 11-12, לקצור את הנוירונים כדלקמן. לשטוף את התאים עם 1x PBS, להוסיף טריפסין, ודגרה את התרבות באינקובטור 37 °C במשך 3 דקות לפני נטרול טריפסין עם בינוני צנטריפוגה ב 200 x g במשך 3 דקות.</li>
</ol>3. אפיון של mESCs ותאים מובחנים
<ol><li>אלקליין פוספטאז (AP) אסייד 
	<ol>
<li>השתמש בערכה להערכת פעילות הפוספטאז האלקליין (ראה טבלת החומרים).</li>
		<li>הסר את המדיום מצלחת התרבות ושטוף את ה- ESCs עם PBS 1x.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של פתרון התיקון (מורכב פורמלדהיד ומתנול) המסופק עם הערכה לצלחת ודגר אותה בטמפרטורת החדר במשך 2-5 דקות. הערה: דגירה יתר בפתרון התיקון עלולה לסכן את פעילות AP.</li>
		<li>הסר את פתרון התיקון, לשטוף את ESCs עם 1x PBS ולהשאיר כמות מסוימת של PBS בצלחת. הערה: שמור על ה- ESCs לחים ב- PBS כדי לא לסכן את פעילות AP.</li>
		<li>הכן את פתרון AP על-ידי ערבוב פתרונות המצע A, B ו- C ביחס של 1:1:1. מערבבים תחילה את הפתרונות A ו- B ודגרים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 2 דקות לפני הוספת תמיסה C.</li>
		<li>הסר את PBS 1x והוסף את פתרון AP שהוכן קודם לכן.</li>
		<li>לדגור על ESCs במשך כ 15 דקות בחושך על ידי עטיפת צלחת התרבות עם רדיד אלומיניום או ביצוע שלב 3.5 בחדר חשוך.</li>
		<li>נטר את התגובה והסר את פתרון התגובה כאשר הפתרון הופך בהיר כדי למנוע כתמים לא ספציפיים.</li>
		<li>לשטוף את ESCs פעמיים עם PBS 1x.</li>
		<li>מנעו את הייבוש של הדגימה על-ידי כיסוי ה-ESCs באמצעות PBS 1x או הרכבה בינונית. הערה: כתם אדום או סגול יופיע עבור ביטוי AP. ניתן לאחסן את הצלחת במקרר של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>RT-qPCR 
	<ol>
<li>לאסוף תאים בשלבים שונים על-ידי ביצוע שלבים 1.6-1.7 ו- 2.4 עבור ESCs ו- EBs ו- NPC, בהתאמה.</li>
		<li>לבודד RNA באמצעות RNA, DNA, פתרון מיצוי חלבון (ראה טבלה של חומרים).</li>
		<li>צור cDNA עם ערכת תמלול הפוכה (ראה טבלת החומרים) ופעל לפי מדריך היצרן.</li>
	</ol></li>
	<li>קיבוע והטבעה 
	<ol>
<li>קציר EBs ו- NPCs כמתואר לעיל (שלב 2.6) ולתקן אותם עם 4% פתרון paraformaldehyde (PFA) ב 1x PBS במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הסר PFA ולשטוף את המדגם עם 1x PBS במשך 5 דקות.</li>
		<li>מקם את המדגם בדילול טורי של 1x PBS, 10%-, 20%-, ו 30%-סוכרוז פתרונות ב 25\u201228 °C שבו המדגם מועבר לפתרון הבא לאחר 30 דקות של דגירה. הערה: ניתן לאחסן את המדגם בתמיסת סוכרוז 30% ב- 4 °C (70 °F) לפני שתמשיך בשלב ההטבעה.</li>
		<li>מרטיבים את קצה הפיפטה עם תמיסת סוכרוז לפני שמניחים את המדגם (מבלי לערום אותם) במרכז תבנית הקריו ומכניסים את הנוזל העודף. הערה: נייר סינון יכול לשמש גם כדי להסיר את הפתרון העודף. הרטבת קצה הפיפטה עם פתרון סוכרוז חשובה כדי למנוע את EBs ו- NPCs מלהידבק לקירות הקצה.</li>
		<li>בזהירות להוסיף טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) פתרון לתבנית מבלי resuspending הדגימות ולהסיר בועות עודף עם pipette.</li>
		<li>מניחים את התבנית עם המדגם על מערבל מעבדה במהירות נמוכה כדי להתסיס קלות את המדגם במשך 15 דקות. פעולה זו מסייעת ליישב את ה- EBs וה- NPC לתחתית אם הם תלויים מחדש בפתרון OCT.</li>
		<li>להקפיא במהירות את המדגם על ידי הצבת התבנית בחנקן נוזלי או על קרח יבש. הערה: ניתן לאחסן דגימות במקפיא של -70 °C לפני שתמשיך לשלב הבא.</li>
	</ol></li>
	<li>קריוזקציה 
	<ol>
<li>הגדר את cryostat להתקרר -20 כדי -18 °C (50 °F) לפני העברת המדגם למכשיר.</li>
		<li>לנתק את בלוק OCT קפוא מן התבנית ולאבטח אותו על המחזיק עם פתרון OCT קטן הניח על פני השטח של המחזיק.</li>
		<li>ישר את בלוק OCT כך שה- EBs וה- NPC יהיה הקרוב ביותר ללהב כדי להבטיח שהדגימה לא תאבד במהלך ניתוח.</li>
		<li>בזהירות סעיף 10 מיקרומטר של הבלוק ולשים לב לפרוסות המכילות את המדגם.</li>
		<li>הניחו במהירות את פרוסת OCT המכילה את הדגימה על מגלשת הזכוכית המטביעה רקמות ואפשרו לפרוסות OCT להתייבש באוויר למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הערה: ניתן לאחסן את הדגימות ב- -70 °C (70 °F) לשימוש מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>אימונופלואורסצנטיות (IF) 
	<ol>
<li>בלוק מקטעי OCT או תאי תרבות המכילים נוירונים בסרום חמור רגיל 10% / 0.1% Triton X-100 ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לדגור את הדגימות בנוגדן ראשוני מדולל בסרום חמור רגיל 5% / 0.05% Triton X-100 ב 1x PBS לילה ב 4 °C (5 °F).</li>
		<li>לשטוף דגימות ב 1x PBS / 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף.</li>
		<li>לדגור על הדגימות עם נוגדן משני מדולל בסרום חמור רגיל 5% / 0.05% טריטון X-100 ב 1x PBS עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף דגימות 1x PBS / 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים במשך 5 דקות כל לשטוף ואז לדגור על הדגימות 1 מיקרוגרם / mL DAPI.</li>
		<li>הר את הדגימות עם כיסוי וכמה בינוני הרכבה ולאפשר לו להתייבש.</li>
		<li>שימו לב לדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח RNA-seq 
	<ol>
<li>לאסוף את התאים בשלבים שונים ולבצע מיצוי RNA (ראה שלב 3.2).</li>
		<li>הכן את ספריות cDNA, בצע רצף עמוק וניתוח נתונים בהתאם לפרוטוקול המתואר בוונג ואח'8.</li>
		<li>בצע את ניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) באמצעות חבילת R, clusterProfiler.</li>
	</ol></li>
	<li>ציטומטריית זרימה 
	<ol>
<li>אסוף ESCs על-ידי ביצוע השלבים 1.6-1.7 וקבע מחדש את התאים במצב בינוני. אסוף את ה- EBs וה- NPC על-ידי ביצוע השלב 2.4 והידוק מחדש של התאים במצב בינוני.</li>
		<li>לסנן את השעיית התא באמצעות מסננת תא ניילון 40 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 15 מ"ל.</li>
		<li>מדוד את אות GFP של הדגימות באמצעות cytometer הזרימה (מבוצע על ידי מתקן הליבה של המוסד).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kaufman, M. H., Evans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li>
<li>Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+pluripotent+cell+line+from+early+mouse+embryos+cultured+in+medium+conditioned+by+teratocarcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).</li>
<li>Czechanski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+characterization+of+mouse+embryonic+stem+cells+from+permissive+and+nonpermissive+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains.</a> Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).</li>
<li>Sugaya, K., Vaidya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+for+Neurodegenerative+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Exosomes%2C+Stem+Cells+and+MicroRNA%3A+Aging%2C+Cancer+and+Age+Related+Disorders%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases.</a> Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).</li>
<li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).</li>
<li>McKee, C., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in stem cell culture.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).</li>
<li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WDR68+is+essential+for+the+transcriptional+activation+of+the+PRC1-AUTS2+complex+and+neuronal+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).</li>
<li>Visan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+as+a+tool+to+assess+developmental+neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroToxicology%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro.</a> NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+So%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochemical So. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Park, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Feeder+Cell+Types+on+Culture+of+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+In+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%26+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro.</a> Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).</li>
<li>Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+leukemia+inhibitory+factor+for+establishing+and+maintaining+embryonic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).</li>
<li>Onishi, K., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIF+signaling+in+stem+cells+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">LIF signaling in stem cells and development.</a> Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).</li>
<li>Smith, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pluripotential+embryonic+stem+cell+differentiation+by+purified+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.</a> Nature. 336, 688-690 (1988).</li>
<li>Williams, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+inhibitory+factor+maintains+the+developmental+potential+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells.</a> Nature. 336, 684-687 (1988).</li>
<li>Ghimire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+naive%2C+primed+and+ground+state+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells+originating+from+the+same+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li>
<li>Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+for+Forming+Embryoid+Body+from+Mouse+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).</li>
<li>Wang, X., Yang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+%28mES%29+cells+using+the+hanging+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).</li>
<li>Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Retinoic+Acid+in+the+Differentiation+of+Embryonal+Carcinoma+and+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Vitamins+and+Hormones%22%5BJournal%5D)">Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells.</a> Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).</li>
<li>Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox1+marks+an+activated+neural+stem%2Fprogenitor+cell+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus.</a> Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+Re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Bahmad, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akt%2FmTOR+pathway+in+cancer+stem%2Fprogenitor+cells+is+a+potential+therapeutic+target+for+glioblastoma+and+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma.</a> Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).</li>
<li>Bastiaens, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+a+MEMS-Based+3D+Cell+Culture+System+for+in+vitro+Neuro-Electrophysiological+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Mechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings.</a> Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).</li>
<li>Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-layer%3A+The+case+for+3D+bioprinting+neurons+to+create+patient-specific+epilepsy+models%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models.</a> Materials. 12 (19), (2019).</li>
<li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li>
<li>Joshi, P., Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+imaging+%28HCI%29+on+miniaturized+three-dimensional+%283D%29+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures.</a> Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

השיטה לבידול עצבי של תאי גזע עובריים של עכבר הוקמה במשך עשרות שנים והחוקרים המשיכו לשנות את הפרוטוקולים הקודמים או ליצור חדשים למטרות שונות7,10,11. השתמשנו בסדרה של בדיקות כדי לנתח באופן מקיף את היעילות וההתקדמות של שלבי הבידול של mESCs לנוירונים, אשר עשוי לשמש בניתוח של בידול שושלת אחרים של עכבר או ESCs אנושיים. יתר על כן, הגישות שלנו הוכיחו להיות כלים שימושיים כדי להעריך את ההשפעה של גנים ספציפיים או מסלולים על הבחנה עצבית במב...

מאז ההפקה הראשונה שלהם מן מסת התא הפנימי של blastocysts העכבר המתפתח1,2, תאי גזע עובריים עכבר (mESC) שימשו ככלים רבי עוצמה כדי ללמוד התחדשות עצמית של תאי גזע ובידול3. יתר על כן, לימוד בידול mESC מוביל להבנה עצומה של מנגנונים מולקולריים שעשויים לשפר את היעילות והבטיחות בטיפול מבוסס תאי גזע בטיפול במחלות כגון הפרעות ניווניות4. בהשוואה למודלים של בעלי חיים, מערכת במבחנה זו מספקת יתרונות רבים, כולל פשטות בפועל והערכה, עלות נמוכה בשמירה על קווי תאים בניגוד לבעלי חיים, וקלות יחסית במניפולציות גנטיות. עם זאת, היעילות והאיכות של סוגי תאים מובחנים מושפעים לעתים קרובות מקווים שונים של mESCs, כמו גם משיטות הבידול5,6. כמו כן, הבדיקות המסורתיות להערכת יעילות הבידול מסתמכות על בדיקה איכותית של גנים נבחרים של סמן חסרי חוסן ולכן הם אינם מצליחים לתפוס שינויים גלובליים בביטוי הגנים.
כאן אנו שואפים להשתמש בסוללה של התקפות להערכה שיטתית של ההבחנה העצבית. באמצעות ניתוחי הפריה במבחנה מסורתיים על סמנים נבחרים ו- RNA-seq, אנו מקימים פלטפורמה למדידת יעילות הבידול, כמו גם את השינויים התמלוליים במהלך תהליך זה. בהתבסס על פרוטוקול שהוקם בעבר7, יצרנו גופים עובריים (EBs) באמצעות טכניקת טיפה תלויה, ואחריו אינדוקציה באמצעות כמות על-פיזיולוגית של חומצה רטינואית (RA) כדי ליצור תאי אב עצביים (NPCs), אשר לאחר מכן הובדלו נוירונים עם מדיום אינדוקציה עצבית. כדי לבחון את היעילות של הבידול, בנוסף לבדיקות RT-qPCR ואימונופלואורסצנטיות (IF) מסורתיות, ביצענו רנ"א-סק וציטומטריית זרימה. ניתוחים אלה מספקים מדידה מקיפה של התקדמות הבידול הספציפי לשלב.

<table><tbody><tr><td>0.05% טריפסין + 0.53 מ"מ EDTA 1X</td><td>קורנינג</td><td>25-052-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.1% ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G1890-100G</td><td>מוכן במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>מדולל ב-1X PBS</td></tr><tr><td>40-&mu; מסננת תאים m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Albumax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11020021</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 עז נגד עכבר IgG (H+L)</td> <td>נוגדן Invitrogen</td><td>A11001</td><td>דולל בשעה 1:500 עבור</td></tr><tr><td>ערכת צביעת פוספטאז אלקליין IF II</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td></td></tr><tr><td>AzuraQuant ירוק מהיר qPCR Mix LoRox</td><td>Azura Genomics</td><td>AZ-2105</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto</td><td>BD</td><td>657338</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>11123149001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer ערכת DNA ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Chir99021</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>13122</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>C298-500</td><td>פישר כימי</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>R37606</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>קורנינג</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>בינוני תרמו פישר 11320033</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מאגר EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>111000200</td><td>פארמקו</td><td>מדולל במים דה-יונים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה Biologicals</td><td>S10250</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Plus מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500 מערכת ריצוף</td><td>Illumina</td><td>SY-401-2501</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>BDH1133-4LG</td><td>BDH VWR אנליטי</td><td>מדולל במים דה-יונים</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>נאסף מ-MEF supernatant</td></tr><tr><td>m18srRNA פריימרים</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCTCAAACCATCAA-3'MEM</td></tr> <tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>קורנינג</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>mNanog פריימרים</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTTCAAGCACT-3'</td></tr><tr><td>mNes פריימרים</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1</td></tr> <tr><td>פריימרים</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4</td></tr> <tr><td>פריימרים</td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- פריימרים CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6</td></tr> <tr><td></td><td>IDTDNA</td><td>N/A</td><td>5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' תוסף 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2</td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>הנוגדן העיקרי</td><td>של Nestin Millipore</td><td>MAB5326</td><td>הנוגדן דולל בשעה 1:200 עבור IF</td></tr><tr><td>Neural Basal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>21103049 נוגדן ראשוני נוירופילמנט</td><td>DSHB</td><td>2H3</td><td></td></tr><tr><td>NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library ערכת הכנה</td><td>BioO Scientific</td><td>NOVA-5138-07</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13034</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>קורנינג</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מוכן במים נטולי יונים</td></tr><tr><td>- אשלגן כלורי</td><td>P217-500G</td><td>VWR-</td><td></td></tr> <tr><td>אשלגן פוספט חד בסיסי נטול מים</td><td>0781-500G</td><td>VWR-</td><td></td></tr> <tr><td>נתרן כלורי</td><td>BP358-10</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td></td></tr><tr><td>- נתרן פוספט, דו-בסיסי, הפטהידראט</td><td>SX0715-1</td><td>מיליפור</td><td></td></tr><tr><td>פריימר הקסמר אקראי</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>סיגמא</td><td>R2625</td><td>מוכן ב-DMSO</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>קורנינג</td><td>25-000-Cl</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>84097</td><td>מדולל ב-1X PBS</td></tr><tr><td>SuperScript III Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064022</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. תרכובת</td><td>סאקורה</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ריאגנט בידוד TriPure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11667165001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Rapid</td><td>Illumina</td><td>20020616</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP176-100</td><td></td></tr></tbody></table>

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

אנו מתארים את ההליך שלב אחר שלב לפולחן והבחנה של תאי גזע עובריים של עכברים לשושלות עצביות, ואחריו סדרה של גישות לאפיון התאים המובחנים. תאי הגזע העובריים של עכבר E14 שימשו ליצירת גופים עובריים באמצעות שיטת טיפת התלוי, ולאחר מכן הושרו כדי להבדיל לתאי אב עצביים על ידי חומצה רטינואית, ולבסוף נבדלו לנוירונים. תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך כמותי (RT-qPCR) וניסויים אימונופלואורסצנטיים גילו כי האבות העצביים והנוירונים מציגים סמנים מתאימים (קטין לאבות עצביים ו neurofilament עבור נוירונים) ביום 8 ו -12 לאחר בידול, בהתאמה. ניסויי ציטומטריית זרימה על קו E14 המבטאים כתב GFP מונחה מקדם Sox1 הראו כי כ -60% מהתאים ביום 8 הם חיוביים GFP, המציין את ההבחנה המוצלחת של תאי אב עצביים בשלב זה. לבסוף, נעשה שימוש בניתוח RNA-seq כדי לפרופיל השינויים התמלוליים הכלליים. שיטות אלה שימושיות לניתוח מעורבותם של גנים ומסלולים ספציפיים בוויסות המעבר לזהות התא במהלך בידול עצבי.

כייצוג של השיטה שלנו, ביצענו ניסוי בידול EB, NPC, נוירונים על תאי E14. תאי E14 היו בתרבית על MEFs המוקרנים γ (איור 1A) עד שאוכלוסיית MEF המוקרנת γ מדוללת. אישרנו את הפלוריפוטנס של תאי E14 על ידי ביצוע כתמי פוספטאז אלקליין (AP)(איור 1B)ומאוחר יותר RT-qPCR (ראה להלן) עבור סמני ננוג ואוקטובר 4. תאי ה-E14 נטולי ה-MEF המוקרנים γ הושרו לאחר מכן לצורך בידול באמצעות הפרוטוקול המתואר באיור 2A. בקצרה, טיפות מדיה בידול של 20...

אנו מתארים את ההליך של הבחנה במבחנה של תאי גזע עובריים עכבר לתאים עצביים באמצעות שיטת טיפה תלויה. יתר על כן, אנו מבצעים ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנטיות, RNA-seq, וציטומטריית זרימה.

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

בנוסף לפרוטוקול להתמיינות תאי גזע עובריים של עכברים לתאי עצב, אנו מראים גם סדרה של ניסויים שיכולים לנתח באופן מקיף את תהליך ההתמיינות. טכניקות אלו רלוונטיות להתפתחות עוברית אקטודרמלית מוקדמת, ומספקות לחוקרים אפשרויות לנתח התמיינות תאי עצב. כאשר מנסים הליך זה, חיוני להתחיל עם תאי גזע במצב אופטימלי.מכאן שחשוב שה-EBs, MPCs והנוירונים יתורבו במדיה רעננה ואופטימלית. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה חשובה, מכיוון שהוא מכיל פרטים קטנים שיכולים להשפיע על הצלחתו ויעילותו, במיוחד על חלק הבידול. התחל בהקמת תרבית תאי טיפה תלויה.עבור צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטר, התאם את הריכוז ל-500 תאים לכל 20 מיקרוליטר של מדיום התמיינות. הכן מספיק מתלה תאים ל -50 טיפות של 20 מיקרוליטר. השתמש במיקרו-פיפטה או פיפטה משחזרת כדי להניח טיפות של 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים על המכסה של צלחת תרבית רקמה, וודא שהטיפות אינן קרובות מדי זו לזו, כדי למנוע מהן להתמזג.מלאו את הצלחת בחמישה עד 10 מיליליטר PBS והחזירו בזהירות את המכסה לצלחת. דגרו את התרבות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר יומיים, אספו את הטיפות מהמכסה, והניחו אותן בצלחת מתלה תרבית תאים בגודל 10 סנטימטר מלאה ב-10 מיליליטר של מדיום התמיינות, ואז הניחו את הצלחת על שייקר מסלולי המוגדר למהירות נמוכה בחממה.לאחר יומיים נוספים יש לצנטריפוגה של התאים בעוצמה של 200 פעמים G למשך שלוש דקות, ולהסיר את הסופרנטנט. כדי לגרום להתמיינות גוף עוברי לתאי אב עצביים, השעו מחדש את התאים במדיום התמיינות עם חומצה רטינואית בעלת חמישה מיקרו-מולרים. דגרו את הצלחת למשך יומיים, ואז החליפו את המחצית הקטנה ביותר של המדיום במדיום טרי, על ידי הטיית הצלחת והוצאתה החוצה.אספו את התאים יומיים לאחר מכן על ידי צנטריפוגה שלהם ב-200 פעמים G למשך שלוש דקות, והוצאתם את הסופרנטנט. תקן את הגופים העובריים ותאי האב העצביים עם 4% PFA ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את ה- PFA ושטוף את התאים ב- PBS למשך חמש דקות.דגרו את התאים באופן סדרתי בתמיסות סוכרוז PBS 10, 20 ו-30%, בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס, כאשר כל דגירה נמשכת 30 דקות או יותר עד שהתאים מתיישבים בתחתית הצינור. והשתמש בו כדי להעביר את הדגימה למרכז Cryomold, ולהוציא את עודפי הנוזל. הוסף בזהירות טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תמיסת OCT לתבנית, מבלי להשעות מחדש את הדגימה, ולאחר מכן הסר בועות מוגזמות בעזרת פיפטה.הניחו את התבנית עם הדגימה על מערבל מעבדה במהירות נמוכה למשך 15 דקות, מה שייישב את הגופים העובריים ותאי האב העצביים לתחתית תמיסת ה-OCT. לאחר מכן הקפיאו במהירות את הדגימה על ידי הנחת התבנית בחנקן נוזלי. חסום קטעי OCT או תאי תרבית המכילים נוירונים בסרום חמור רגיל של 10%, ו-0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.לאחר מכן דגרו את הדגימות בנוגדנים ראשוניים, מדוללים בסרום חמור רגיל של 5%, ו-0.05% טריטון X-100 ב-PBS, בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, דגימות כביסה ב-PBS עם 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל כביסה. דגרו אותם עם נוגדן משני, מדולל בסרום חמור רגיל של 5%, ו-0.05% טריטון X-100 ב-PBS, למשך שעה בטמפרטורת החדר.חזור על השטיפות ב-Triton X-100 ו-PBS, ולאחר מכן דגר את הדגימה במיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI. הרכיבו את הדגימה עם החלקת כיסוי ואמצעי הרכבה כלשהו, הניחו לה להתייבש וצלמו אותה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לבצע התמיינות נוירונים, תאי E14 תורבבו על פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרני גמא עד שאוכלוסיית הפיברובלסטים דוללה.הפלוריפוטנטיות של תאי E14 אושרה עם צביעת פוספטאז אלקליין. לאחר התמיינות, לגופים עובריים הייתה צורה עגולה שגדלה בהתמדה. ביום העשירי, לתאי אב עצביים שהתמיינו לתאי עצב, הייתה צורת תא מוארכת.ניסויים אימונופלואורסצנטיים בוצעו על תאי אב עצביים ביום השמיני, ועל נוירונים ביום ה-12. צביעה חיובית נצפתה עבור קינון בתאי אב עצביים, ועבור נוירופילמנט בנוירונים. קו תאי גזע עובריים של עכבר המבטא מדווח GFP מונע על ידי מקדם Sox1 התמיין, ובוצעה ציטומטריית זרימה על תאי הגזע העובריים ותאי האב העצביים.נמצא כי 58.7% מכלל התאים בשלב ה-NPC הם חיוביים ל-GFP, בעוד ש-0% חיוביים ל-GFP בשלב ה-ESC. ניסויי רצף RNA בוצעו על תאי גזע עובריים E14, גופים עובריים ותאי אב עצביים. הגנים במפת החום של רצף ה-RNA מוינו על סמך רמות הביטוי שלהם.ניתוח אונטולוגיה גנטית של ארבעת אשכולות הגנים הראה שהם תואמים לפונקציות או מסלולים תאיים מובחנים. בעת ביצוע פרוטוקול זה, EBS אמור להופיע כגושי תאים כדוריים ומושחרים. כדי להבטיח ש-EBS יגדל עם כזה, החלף את המדיום ביום הראשון, אם המדיום מתחיל להיות צהבהב.אותה גישה חשובה לתרבית MPC, מכיוון שגם EBs וגם MPCs נמצאים בשלב קריטי של התפתחות עוברית מוקדמת. ניתן לבצע בדיקות גנומיות פונקציונליות אחרות, כגון ChIPseek ומבחני לכידת אישור כרומטין מהשלבים השונים של התמיינות נוירונים, כדי להבין את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים. שילוב על ידי בדיקות גנומיות כימיות ופונקציונליות בתהליך התמיינות הנוירונים, מאפשר לחוקרים לתאר טוב יותר את המנגנונים המולקולריים של התפתחות עוברית מוקדמת.

differentiation-characterization-neural-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים בסיס מולקולות קטנות פרוטוקול התמיינות תאים העכבר גזע עובריים לתאי מבשר oligodendrocyte (OPCs). פרוטוקול זה יוצר Olig2 NG2 + + OPCs עם יעילות גבוהה של 30 ימים של בידול. כמו כן, אנו מתארים שיטה להפקת "מתחזקים" בצורה OPCs שיכולים אש הפוטנציאלים לפעולה.

התמיינות של תאים עובריים לתוך מבשרי Oligodendrocyte

פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים, או תאי גזע עובריים אנושיים, ישירות לתאי אב עצביים ללא שימוש בתאי הזנה או בשלבי ביניים כלשהם. עיכוב סלקטיבי של חלבון מורפוגנטי עצם או BMP והפיכת גורם גדילה-בטא, או TGF-β, מסלולי איתות מוביל להתמיינות תאי גזע עובריים עובריים עצביים לתאי אב עצביים, או NPCs.

התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לאבות עצביים

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת תאי אב עצביים (NPCs) במבחנה מתאי גזע עובריים של עכברים (mESCs). mESCs מתורבתים בתרחיף ליצירת גופים עובריים (EBs), אשר מונחים לאחר מכן להתמיין NPCs באמצעות טיפול בחומצה רטינואית בתרבית דבקה.

טכניקה ליצירת תאי אב עצביים מתאי גזע עובריים של עכברים

הסרטון הציג שיטה לתרבית תאים למיון תאי אב עצביים לנוירונים. על ידי דגירה של תאים בתווך עשיר בחומרים מזינים בתוספת גורמי גדילה, תאי האב התבגרו לנוירונים עם אקסונים ודנדריטים מפותחים. חומר מייצב הבטיח את קיום התא והגן מפני נזקי חמצון לאורך כל תהליך ההתמיינות.

התמיינות של תאי אב עצביים לתאי עצב

פרוטוקול זה מתאר בפירוט את השיטה ליצירת אבות עצביים מתאי גזע עובריים בשיטה חד-שכבתית נטולת סרום. ניתן להשתמש באבות אלה כדי לגזור סוגי תאים עצביים בוגרים או לחקור את תהליך המפרט העצבי והם ניתנים לקנה מידה של פורמט מרובה בארות עבור סינון מורכב.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

אנו מתארים שיטה לשימוש בתאי גזע עובריים בעכברים ליצירה שניים או שלושה גופי embryoid ממדים. לאחר מכן נסביר כיצד להשרות התמיינות עצבית של תאי הגוף Embryoid ידי חומצה רטינואית, וכיצד לנתח מצב הבידול שלהם על ידי immunofluorescence סמן תא אב ו immunoblotting.

ניתוח של החומצה הרטינואית המושרה בידול עצבית של תאי גזע עובריים עכבר בשניים ובשלושה-ממדי גופים Embryoid

פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת interneuron קורטיקלית אבות ו מבשרי פוסט-mitotic interneuron של תאי גזע עובריים בעכבר בשיטה שונה embryoid גוף-כדי-טפט. אלה אבות/מבשרי יכולים להיות בשימוש במבחנה או fluorescently מיון מושתלים לתוך קליפת neonatal ללמוד קביעת גורל, או שימוש ביישומים טיפולית.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

כאן, אנחנו מציגים בטכניקה המיקרוכירורגית הרומן על בידודו של תאי גזע עצביים מ E13 העכבר עובר ganglionic קדושתו.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור של התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים והבידול שלהם לתוך תאים מחולל קדמון. הפרוטוקול הוא פשוט, חסון, מדרגי, ומתאים לסינון סמים וליישומים רפואת התחדשות.

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

כאן, הקמנו שיטה זולה וקלה לתפעול המכוונת בידול מהיר ויעיל מתאי גזע עובריים לנוירונים. שיטה זו מתאימה לפופולאריזציה בקרב מעבדות ויכולה להיות כלי שימושי למחקר נוירולוגי.

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

למדו פרוטוקול להבדלה של תאי גזע עובריים של עכבר לנוירונים בשיטת הטיפה התלויה. השיטה כוללת ניתוח פנוטיפי מקיף באמצעות RT-qPCR, אימונופלואורסצנציה וציטומטריית זרימה לחקר התפתחות עצבית.

בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

גלה סרטונים נוספים