בידול ואפיון של אבות עצביים ונוירונים מתאי גזע עובריים של עכבר

בנוסף לפרוטוקול להתמיינות תאי גזע עובריים של עכברים לתאי עצב, אנו מראים גם סדרה של ניסויים שיכולים לנתח באופן מקיף את תהליך ההתמיינות. טכניקות אלו רלוונטיות להתפתחות עוברית אקטודרמלית מוקדמת, ומספקות לחוקרים אפשרויות לנתח התמיינות תאי עצב. כאשר מנסים הליך זה, חיוני להתחיל עם תאי גזע במצב אופטימלי.

מכאן שחשוב שה-EBs, MPCs והנוירונים יתורבו במדיה רעננה ואופטימלית. הדגמה חזותית של פרוטוקול זה חשובה, מכיוון שהוא מכיל פרטים קטנים שיכולים להשפיע על הצלחתו ויעילותו, במיוחד על חלק הבידול. התחל בהקמת תרבית תאי טיפה תלויה.

עבור צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטר, התאם את הריכוז ל-500 תאים לכל 20 מיקרוליטר של מדיום התמיינות. הכן מספיק מתלה תאים ל -50 טיפות של 20 מיקרוליטר. השתמש במיקרו-פיפטה או פיפטה משחזרת כדי להניח טיפות של 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים על המכסה של צלחת תרבית רקמה, וודא שהטיפות אינן קרובות מדי זו לזו, כדי למנוע מהן להתמזג.

מלאו את הצלחת בחמישה עד 10 מיליליטר PBS והחזירו בזהירות את המכסה לצלחת. דגרו את התרבות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר יומיים, אספו את הטיפות מהמכסה, והניחו אותן בצלחת מתלה תרבית תאים בגודל 10 סנטימטר מלאה ב-10 מיליליטר של מדיום התמיינות, ואז הניחו את הצלחת על שייקר מסלולי המוגדר למהירות נמוכה בחממה.

לאחר יומיים נוספים יש לצנטריפוגה של התאים בעוצמה של 200 פעמים G למשך שלוש דקות, ולהסיר את הסופרנטנט. כדי לגרום להתמיינות גוף עוברי לתאי אב עצביים, השעו מחדש את התאים במדיום התמיינות עם חומצה רטינואית בעלת חמישה מיקרו-מולרים. דגרו את הצלחת למשך יומיים, ואז החליפו את המחצית הקטנה ביותר של המדיום במדיום טרי, על ידי הטיית הצלחת והוצאתה החוצה.

אספו את התאים יומיים לאחר מכן על ידי צנטריפוגה שלהם ב-200 פעמים G למשך שלוש דקות, והוצאתם את הסופרנטנט. תקן את הגופים העובריים ותאי האב העצביים עם 4% PFA ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את ה- PFA ושטוף את התאים ב- PBS למשך חמש דקות.

דגרו את התאים באופן סדרתי בתמיסות סוכרוז PBS 10, 20 ו-30%, בטמפרטורה של 25 עד 28 מעלות צלזיוס, כאשר כל דגירה נמשכת 30 דקות או יותר עד שהתאים מתיישבים בתחתית הצינור. והשתמש בו כדי להעביר את הדגימה למרכז Cryomold, ולהוציא את עודפי הנוזל. הוסף בזהירות טמפרטורת חיתוך אופטימלית או תמיסת OCT לתבנית, מבלי להשעות מחדש את הדגימה, ולאחר מכן הסר בועות מוגזמות בעזרת פיפטה.

הניחו את התבנית עם הדגימה על מערבל מעבדה במהירות נמוכה למשך 15 דקות, מה שייישב את הגופים העובריים ותאי האב העצביים לתחתית תמיסת ה-OCT. לאחר מכן הקפיאו במהירות את הדגימה על ידי הנחת התבנית בחנקן נוזלי. חסום קטעי OCT או תאי תרבית המכילים נוירונים בסרום חמור רגיל של 10%, ו-0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן דגרו את הדגימות בנוגדנים ראשוניים, מדוללים בסרום חמור רגיל של 5%, ו-0.05% טריטון X-100 ב-PBS, בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, דגימות כביסה ב-PBS עם 0.1% Triton X-100 שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל כביסה. דגרו אותם עם נוגדן משני, מדולל בסרום חמור רגיל של 5%, ו-0.05% טריטון X-100 ב-PBS, למשך שעה בטמפרטורת החדר.

חזור על השטיפות ב-Triton X-100 ו-PBS, ולאחר מכן דגר את הדגימה במיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI. הרכיבו את הדגימה עם החלקת כיסוי ואמצעי הרכבה כלשהו, הניחו לה להתייבש וצלמו אותה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לבצע התמיינות נוירונים, תאי E14 תורבבו על פיברובלסטים עובריים של עכברים מוקרני גמא עד שאוכלוסיית הפיברובלסטים דוללה.

הפלוריפוטנטיות של תאי E14 אושרה עם צביעת פוספטאז אלקליין. לאחר התמיינות, לגופים עובריים הייתה צורה עגולה שגדלה בהתמדה. ביום העשירי, לתאי אב עצביים שהתמיינו לתאי עצב, הייתה צורת תא מוארכת.

ניסויים אימונופלואורסצנטיים בוצעו על תאי אב עצביים ביום השמיני, ועל נוירונים ביום ה-12. צביעה חיובית נצפתה עבור קינון בתאי אב עצביים, ועבור נוירופילמנט בנוירונים. קו תאי גזע עובריים של עכבר המבטא מדווח GFP מונע על ידי מקדם Sox1 התמיין, ובוצעה ציטומטריית זרימה על תאי הגזע העובריים ותאי האב העצביים.

נמצא כי 58.7% מכלל התאים בשלב ה-NPC הם חיוביים ל-GFP, בעוד ש-0% חיוביים ל-GFP בשלב ה-ESC. ניסויי רצף RNA בוצעו על תאי גזע עובריים E14, גופים עובריים ותאי אב עצביים. הגנים במפת החום של רצף ה-RNA מוינו על סמך רמות הביטוי שלהם.

ניתוח אונטולוגיה גנטית של ארבעת אשכולות הגנים הראה שהם תואמים לפונקציות או מסלולים תאיים מובחנים. בעת ביצוע פרוטוקול זה, EBS אמור להופיע כגושי תאים כדוריים ומושחרים. כדי להבטיח ש-EBS יגדל עם כזה, החלף את המדיום ביום הראשון, אם המדיום מתחיל להיות צהבהב.

אותה גישה חשובה לתרבית MPC, מכיוון שגם EBs וגם MPCs נמצאים בשלב קריטי של התפתחות עוברית מוקדמת. ניתן לבצע בדיקות גנומיות פונקציונליות אחרות, כגון ChIPseek ומבחני לכידת אישור כרומטין מהשלבים השונים של התמיינות נוירונים, כדי להבין את התהליכים הביולוגיים הבסיסיים. שילוב על ידי בדיקות גנומיות כימיות ופונקציונליות בתהליך התמיינות הנוירונים, מאפשר לחוקרים לתאר טוב יותר את המנגנונים המולקולריים של התפתחות עוברית מוקדמת.