הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

טירוזין פוספטזה SHP2, הוא מתווך מפתח של איתות הסלולר, קידום הישרדות התא והתפשטות. הצוות שלי מתמקד במציאת מעכבי SHP2 מולקולה קטנה לטיפול בסרטן. הטכניקה שלנו מספקת שיטה מהירה ורבת עוצמה כדי להקים תאים חודרים, כמו גם מעורבות היעד של מעכבי SHP2 מולקולה קטנה, בתאים.

זה מבטיח, משאבי גילוי מכוונים ביעילות. SHP2 כיעד אטרקטיבי לטיפול בסרטן. וכמה מעכבי SHP2, נמצאים בניסויים קליניים.

הטכניקה שלנו כדי להקל על הגילוי של מעכבי הדור הבא עם פרופילי יעילות משופרת. הפגנה להליך תהיה סלסט רומרו, עוזרת מחקר ודאגלס שפלר, פרופסור עוזר מחקר, מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל לנתק תאי T HEK293 מהלוחות, באמצעות שלושה מיליליטר של ניתוק תאים.

לדלל את התאים עם 12 מיליליטר של מדיה צמיחה, ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 1, 400 פעמים G, במשך ארבע דקות. תן שימוש חוזר בחך התא ב-10 מיליליטר של מדיית צמיחה ולמדוד את הריכוז והכדאיות של התאים עם כחול טריפאן ודלפק תאים. צלחת 700, 000 תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי לתוך כל באר של צלחת תרבות 6 היטב דגירה אותם במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני.

ביום שלמחרת, לדלל שני מיקרוגרם של DNA פלזמה לתוך 200 microliters של חיץ transfection. מערבולת DNA פלזמה במשך 10 שניות ולרכז אותו ב 1, 400 פעמים G במשך ארבע דקות. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של רגנט טרנספיקציה לדנ"א המדולל.

מערבולת זה במשך 10 שניות, ולחזור על הצנטריפוגה. להדגים את ה-DNA ב 23 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף את תערובת transfection לתאי HEK293 T המצורפת בשש צלחת גם, ולהחזיר את התאים לאנקובטור עוד 24 שעות. כדי להכין צלחות ממוזגות, לדלל פתרונות מעכבים ב- DMSO, לריכוז מלאי של 10 מילימולרים ולחלק אותם לתוך צלחת מקור נפח מת נמוך 384, לשימוש מיידי.

לזהות את הנפח הרצוי של מעכבים או רכב, באמצעות מטפל נוזלי לתוך 384 גם בזמן אמת לוחות PCR בנפח הסופי היעד של פחות מ 0.5% DMSO. לאטום את הצלחות באמצעות איטום צלחת עם טיהור גז אינרטי. כדי להכין את התאים המרובים לפני הדגירה מדיה צמיחה ולמכור reagent ניתוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.

מוציאים את התאים מהאינקובטור ושואבים בעדינות את התקשורת מה בארות. מוסיפים 0.3 מיליליטר של רהט ניתוק התא לכל באר, ומטלטלים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי לכסות ביסודיות את פני השטח של תחתית הצלחת. דגירה הצלחת ב 23 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.

הוסף מיליליטר אחד של מדיה צמיחה לכל באר, בעדינות pipette התאים באר. ואז להעביר אותם 15 מיליליטר פלקון צינור צנטריפוגה צנטריפוגה התאים ב 1, 400 פעמים G במשך ארבע דקות כדי לאסוף את התאים. בעדינות שאף את התקשורת, ולאחר מכן תן שימוש חוזר את גלולת התא בשני מיליליטר של מדיה צמיחה.

ודא שהכדאיות של התא גדולה מ- 90%באמצעות נסה כחול פנורמי ודלפק תאים. לדלל תאים לריכוז של 125 תאים לכל microliter, שמירה על התאים בהשעיה לא יותר משעתיים עבור הכדאיות האופטימלית. עבור דגירה עם מעכבי SHP2, לחלק את התאים לתוך שוקת פתרון ערוץ יחיד סטרילי.

צנטריפוגה מוכן בעבר 384 גם בזמן אמת לוח PCR ב 2, 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את החותם ולהשתמש פיפטה רב ערוצית 125 מיקרוליטר, כדי להוסיף חמישה microliters של תאים מדוללים בארות הרצוי. צנטריפוגה הצלחת ב 42 פעמים G במשך 30 שניות ללא מכסה, ולאחר מכן לצרף מכסה הדגירה את הצלחת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תכנתו את ה-Thermo cycler, בהתאם לכיווני כתב היד של שיפוע הפרופיל התרמי או הניסוי היזותרמי.

התחל את תוכנית פעימת החום של התרמוצ'ילר, והצב את לוחית ההתקפיה על הבלוק התרמי. לאחר סיום התוכנית, הסר את לוחית ההתנסויות. להשלים כל באר של צלחת בדיקה עם חמישה microliters של תערובת ראשית זיהוי מורשה.

צנטריפוגה הצלחת ב 42 פעמים G במשך 30 שניות, ולאחסן אותו ב 23 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 עד 60 דקות. למדוד chemiluminescence באמצעות קורא מיקרופלסטיק עם זמן האינטגרציה ממוטב. ניסוי שיפוע תרמי עבור סוג הבר SHP2, הביא פרופיל תרמי תאי סיגמואידאלי עם מעבר התכה צר האופייני לחלבון מקופל.

הדגירה של SHP2 מסוג פראי עם מעכב allosteric SHP099, התייצב לפרופיל התרמי במידה משמעותית ומדידה. הייצוב של SHP2, גם במעקב עם העוצמה של SHP099 כמו תרכובות allosteric. ב 10 micromolar, RMC-4550 חזק יותר, הפיק מידה רבה יותר של ייצוב מאשר SHP099 עבור סוג פראי SHP2.

בשל המנגנון הייחודי שלהם, SHP099 כמו מעכבי allosteric יעילים פחות נגד מוטציות אונקוגניות SHP2 רבות, כולל SHP2-E76K. עולה בקנה אחד עם תכונות ידועות אלה רק ייצוב תרמי שולי של SHP2-E76K על ידי SHP099 הוא ציין. רמת הביטוי של חלבון תג EPL יכולה להשפיע באופן דרמטי על עוצמת האות.

פרופילים תרמיים לתאי סוג בר ארעיים ומשולבים היטב. בתנאי נכס זהים מוצגים. נורמליזציה של עקומות שונות מאפשר פרופילים תרמיים דומים, חושף את המגוון הרחב של מערכת זיהוי EFC.

ניצול היכולת של רוכב האופניים התרמי לייצר מעברי צבע תרמיים על הציר הקצר של צלחת באר 384. סדרה של ציצים isothermal יכול להתבצע על צלחת אחת. בטמפרטורה אופטימלית, טיטרציה איזותרמית באמצעות תגובת מינון מלאה של 10 נקודות, הניבה EC50 שימושי, עבור RMC-4550.

העקרונות של נכס זה יכול לשמש כדי לפקח על השפלה של חלבונים בתאים, המושרה על ידי תרכובות PROTAC. אנו משתמשים בטכניקת שינוי תלמה הסלולר כדי לגלות מעכבי SHP2 מוטציה ולוקמיה, תרופות ספציפיות נגד מוטציות אונקוגניות SHP2 תכופים תהיה השפעה משמעותית לטיפול בסרטן אלה.