Name: הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: למדו שיטת cellular thermal shift assay בפורמט 384-well להערכת מעורבות יעד של מעכבי SHP2 בתאים שלמים. השיטה מאפשרת גילוי מהיר של מעכבים קטני מולקולות לטיפול בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק 1R21CA195422 (ל.ט.), פרס קרן משפחת אפשטיין (N.D. P.C.) ו NCI מרכז תמיכה מרכז P30CA030199. בנוסף, פרויקט זה מומן במלואו או בחלקו עם כספים פדרליים מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, תחת חוזה קונסורציום ביולוגיה כימית לא. HHSN261200800001E. תוכן פרסום זה אינו משקף בהכרח את השקפותיו או מדיניותו של משרד הבריאות ושירותי האנוש, ואינו מזכיר שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים המרמזים על תמיכה של ממשלת ארה"ב. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. הכנת תרבות תאים ותרבית ריאה
<ol><li>לגבש בקבוק 500 מ"ל של מדיה גדילה עם 10% סרום עוף עוברי, 1x אנטיביוטיקה / מיקרוטי, 20 mM HEPES, ו 1 mM נתרן pyruvate. לאחסן ב-4°C.</li>
	<li>הפשרה של ריאגנטים תרמיים סלולריים (ריאגנט EA, מאגר ליסיס ושקוע) מבקבוקי מלאי מקוריים קפואים.</li>
	<li>לחלק ריאגנטים ומאגר כמו 2 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 ° C. הערה: הימנע מהקפאה/הפשרת עבור שכפול והשתמש רק בנפח זה של ריגנט הנדרש עבור הליך ה-assay.</li>
</ol>2. צמיחה ותחזוקה של תאי HEK293T
<ol><li>השג תאי HEK293T דבקים במעבר נמוך מאחסון קריו.</li>
	<li>שמור על תאי HEK293T במדיה צמיחה ב- 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>פיצול תאים כל 4 ימים ביחס של 1:14. הערה: לקבלת הביצועים הטובים ביותר, תאי HEK293T אינם מורשים לעבור מעבר גדול מ- 25 פעמים.</li>
</ol>3. הכנת תא HEK293T עבור טרנס-עביריוני
<ol><li>נתק תאי HEK293T מ-16 לוחות מ"ל באמצעות 3 מ"ל של ריאקנט נתק התא.</li>
	<li>לדלל עם 12 מ"ל של מדיה צמיחה. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגציה ב 1,400 x g במשך 4 דקות.</li>
	<li>תולה מחדש את הכדור במדיה צמיחה 10 מ"ל. למדוד את הריכוז והכדאיות של תאים באמצעות טריפאן כחול מונה תא.</li>
	<li>צלחת 7.0 x 105 גדל באופן אקספוננציאלי HEK293T תאים לכל באר בצלחת תרבות תא 6 באר כ 24 שעות לפני transfection. הערה: שמור באר אחת עבור כל פלסמיד להיות טרנס-נגוע.</li>
	<li>דגירה ל-24 ש' ב-37°C, 5% CO2.</li>
</ol>4. תברה של תאי HEK293T
<ol><li>מתוך מלאי פלסמיד מטוהר של pICP-ePL-N-SHP2-WT או pICP-ePL-N-SHP2-E76K (~ 200 ng/μL) לדלל 2 μg של DNA פלסמיד לתוך 200 μL של מאגר טרנסאפציה.</li>
	<li>מערבולת עבור 10 s וצנטריפוגה ב 1,400 x g עבור 4 דקות.</li>
	<li>הוסף 4 μL של reagent טרנסאפקט ל-DNA מדולל. מערבולת עבור 10 s וצנטריפוגה ב 1,400 x g עבור 4 דקות.</li>
	<li>דגירה ב 23 °C במשך 10 דקות.</li>
	<li>הסר את צלחת 6 באר המכילה גדל HEK293T תאים אינקובטור. הוסף את תערובת הטרנס-פעולה לתאים המצורפים בצלחת 6 הבארות. דגירה עבור 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO2.
</li>
</ol>5. הכנת לוחות תס"א
<ol><li>הכן פתרונות מלאי של 10 מיליון מ"מ ב-DMSO של תרכובות לבדיקה.</li>
	<li>לחלק פתרונות מעכבים לתוך לוח מקור נפח מת נמוך 384 טוב לשימוש מיידי.</li>
	<li>זהה את הנפח הרצוי של מעכבים או רכב (DMSO) באמצעות מטפל נוזלי לתוך לוחות PCR בזמן אמת 384 בזמן אמת בנפח הסופי היעד של פחות מ 0.5% DMSO (v/v). אטמו את הצלחת בעזרת איטום צלחת עם טיהור גז אינרטי. הערה: עבור מעכב מינון תגובה-תגובה, הקפד לגבות DMSO בהתאם כך כמויות שוות של DMSO משמשים עבור כל ריכוז מעכב. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אחסן צלחות ב-23°C והשתמש בלחות תוך 24 שעות.</li>
</ol>6. נתק תאים טרנס נגועים והכנה
<ol><li>טרום צנרור מדיה צמיחה ותא תא פגם reagent באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הסר תאים טרנס-נגועים מהאינקובטור. שאפף בעדינות מדיה מבארות הצלחת. הערה: השתמש במשופרת חדשה עבור כל באר המכילה פלסמיד טרנס-נגוע אחר.</li>
	<li>הוסף 0.3 מ"ל של ריאה של נתק התא. נענעו בעדינות את הצלחת הלוך ושוב כדי לכסות ביסודיות את פני השטח של תחתית הצלחת. דגירה ב 23 °C במשך 2 דקות.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של מדיה צמיחה לכל באר. מדיה ותאים בעדינות פיפטה בבאר ולהעביר צינור צנטריפוגה פלקון 15 מ"ל. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגציה ב 1,400 x g במשך 4 דקות.</li>
	<li>בעדינות אך ביסודיות לשאוף את התקשורת. הערה: שאריות פנול אדום בריגנט ניתוק התא יכול להפריע להודעה.</li>
	<li>בזהירות resuspend תא גלולה ב 2 מ"ל של מדיה צמיחה. למדוד את הריכוז והכדאיות של תאים באמצעות טריפאן כחול מונה תא. הערה: כדאיות התא צריכה להיות > 90% לקבלת התוצאות הטובות ביותר.</li>
	<li>לדלל תאים לריכוז של 125 תאים / μL. לדוגמה, עבור 5 μL assay זה ~ 625 תאים / μL. לכדאיות אופטימלית לשמור על תאים בהשעיה לא יותר מ 2 שעות.</li>
</ol>7. דגירה של תאים עם מעכבי SHP2
<ol><li>לחלק תאים לתוך שוקת פתרון ערוץ יחיד סטרילי.</li>
	<li>צנטריפוגה 384-גם בזמן אמת PCR לוח כי כבר מוכן מראש על ידי תצהיר מעכב SHP2 ב 2,500 x g עבור 5 דקות ב 23 ° C.</li>
	<li>הסר את החותם מהצלחת המורכבת. באמצעות פיפטה רב ערוצית μL 125, להוסיף 5 μL של התאים מדוללים לבארות הרצויות.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצלחת ב 42 x g עבור 30 s ללא מכסה על הצלחת. חברו את חותם המכסה לצלחת לאחר שהצלחת מסובבת כלפי מטה ותדגרו את לוח האחסון ב-37°C, 5% CO2 לשעה אחת.</li>
</ol>8. הכנת תערובת ריאגנט כימיומינסצנטית
<ol><li>הסר את הכמות הנחוצה של ריקגנט זיהוי (רייאגנט EA, מאגר lysis ו- substrate) מ- -20 °C אחסון לאחר תאי ציפוי. הפשרה של ריאגנטים ב-23°C. הערה: לנוחות בהעברה, הכן אמצעי אחסון גדול פי 1.5 מהנפח הכולל של התאים שהופקדו בצלחת. אין לעשות שימוש חוזר בריגנטים לאחר השימוש.</li>
	<li>הכן תמהיל ראשי של הריאגנטים באמצעות תנאי EA-10, המורכב ממרכיב ושבר אמצעי אחסון כדלקמן: רייאגנט EA (0.17), מאגר lysis (0.17), מצע (0.67). הערה: יחסי Reagent מבוססים על ניסויי מיטוב המבוצעים כמצוין במדריך של הספק.</li>
</ol>9. דופק חום הדרגתי של פרופיל איתרמי או תרמי
<ol><li>תכנת את התרמוצ'יקלר בעל יכולת ההדרגה למשלוח של דופק חום.<ol>
<li>לניסויים הדרגתיים בפרופיל תרמי, תכנת מראש את התרמוצ'יקלר עם מפרטי הדוגמה הבאים:</li>
		<li>פעימת חום: טמפרטורת ההתכה הרצויה של 3 דקות (הדרגתיות אנכית או אופקית +/- 15°C; לדוגמה 38-68°C הפרושה על פני 24 בארות מניבה מרווחי טמפרטורה של 1.25°C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>שלב התאוששות שיווי משקל: 3 דקות 20 °C עם מהירות רמפה = 1 °C / s<ol>
<li>עבור ניסויים isothermal להגדיר את הפרוטוקול להגדיר כדלקמן:</li>
		<li>דופק חום: 3 דקות 55 °C. שלב התאוששות שיווי משקל: 3 דקות 20 °C עם מהירות רמפה = 1° צלזיוס לs הערה: עבור שכפול מוגבר, כפי שזה יכול להיות קשה למקם את הצלחת בדיוק בזמן thermocycler מגיע לטמפרטורה הרצויה שלה, להגדיר את התוכנית לספור לאחור 15 s לפני תחילת הדופק 3 דקות. עבור thermocycler בשימוש בניסוי זה ראה טבלת חומרים, המכסה נשמר במהלך דופק החום.</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. זיהוי ומדידה של ליסיס
<ol><li>תוספת לוחות תסיסה עם תמהיל מאסטר זיהוי lysis על ידי תוספת של אמצעי אחסון שווים (5 μL) לכל באר שיש לנתח באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
	<li>צנטריפוגה את הצלחת 42 x g עבור 30 s. לאחסן ב 23 °C בחושך במשך 30-60 דקות.</li>
	<li>מדוד כימינום באמצעות קורא מיקרו-פלטה המסוגל לזהות זוהר בפורמט של 384 בארות. בצע מדידת זוהר עם סוג לוח וזמן שילוב ממוטב (זמן שילוב 1000 ms, ליישב את הזמן 0 s). מדוד ערכים כספירות/s ופלט לניתוח נוסף.</li>
</ol>11. ניתוח נתונים
<ol><li>נתח את נתוני הזוהר באמצעות תוכנת גרפים וסטטיסטיקה דו-מית-מידית מדעית.</li>
	<li>צור פרופילים תרמיים על-ידי ניתוח נתוני הזוהר המנורמלים (מנורמל לבקרת הרכב) באמצעות רגרסיה לא ליניארית ומודל סיגמואידי של בולצמן. הערה: בניסויי פרופיל תרמי, V50 המחושב, הטמפרטורה שהיא נקודת האמצע בין החלק התחתון והתחתון של העקומה, מגדיר את טמפרטורת ההתכה של SHP2. בניסויים isothermal, EC50 מגדיר את הריכוז של המדכא שנותן תגובה חצי מקסימלית.</li>
</ol>

<ol><li>Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation%3A+thirty+years+and+counting%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation: thirty years and counting.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (2), 140-146 (2009).</li>
<li>Alonso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases in the human genome.</a> Cell. 117 (6), 699-711 (2004).</li>
<li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases-the+major+drug+targets+of+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein kinases-the major drug targets of the twenty-first century.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 1 (4), 309(2002).</li>
<li>Ferguson, F. M., Gray, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+inhibitors%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Kinase inhibitors: the road ahead.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).</li>
<li>Stanford, S. M., Bottini, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tyrosine+Phosphatases%3A+Time+to+End+the+Stigma%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Pharmacological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting Tyrosine Phosphatases: Time to End the Stigma.</a> Trends in Pharmacological Sciences. 38 (6), 524-540 (2017).</li>
<li>Tonks, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases--from+housekeeping+enzymes+to+master+regulators+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases--from housekeeping enzymes to master regulators of signal transduction.</a> FEBS Journal. 280 (2), 346-378 (2013).</li>
<li>Chan, R., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTPN11+is+the+first+identified+proto-oncogene+that+encodes+a+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PTPN11 is the first identified proto-oncogene that encodes a tyrosine phosphatase.</a> Blood. 109 (3), 862-867 (2007).</li>
<li>Chan, G., Kalaitzidis, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tyrosine+phosphatase+Shp2+%28PTPN11%29+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The tyrosine phosphatase Shp2 (PTPN11) in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 27 (2), 179-192 (2008).</li>
<li>Hof, P., Pluskey, S., Dhe-Paganon, S., Eck, M., Shoelson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+tyrosine+phosphatase+SHP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Cell. 92 (4), 441-450 (1998).</li>
<li>Barford, D., Neel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+mechanisms+for+SH2+domain+mediated+regulation+of+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Revealing mechanisms for SH2 domain mediated regulation of the protein tyrosine phosphatase SHP-2.</a> Structure. 6 (3), 249-254 (1998).</li>
<li>Neel, B. G., Chan, G., Dhanji, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeel%2C+BG+%22Handbook+of+Cell+Signaling+%28Second+Edition%29%22">Handbook of Cell Signaling (Second Edition)</a>. 2, Academic Press. Amsterdam. 771-809 (2010).</li>
<li>Tartaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+PTPN11%2C+encoding+the+protein+tyrosine+phosphatase+SHP-2%2C+cause+Noonan+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause Noonan syndrome.</a> Nature Genetics. 29 (4), 465-468 (2001).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BTLA+is+a+lymphocyte+inhibitory+receptor+with+similarities+to+CTLA-4+and+PD-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">BTLA is a lymphocyte inhibitory receptor with similarities to CTLA-4 and PD-1.</a> Nature Immunology. 4 (7), 670-679 (2003).</li>
<li>Bialy, L., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+protein+tyrosine+phosphatases%3A+next-generation+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of protein tyrosine phosphatases: next-generation drugs.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 44 (25), 3814-3839 (2005).</li>
<li>Kumar, S., Liang, F., Lawrence, D., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+approach+to+studying+protein+tyrosine+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small molecule approach to studying protein tyrosine phosphatase.</a> Methods. 35 (1), 9-21 (2005).</li>
<li>Tautz, L., Pellecchia, M., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+PTPome+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Thereapeutics+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting the PTPome in human disease.</a> Expert Opinion in Thereapeutics Targets. 10 (1), 157-177 (2006).</li>
<li>Tautz, L., Mustelin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+developing+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Strategies for developing protein tyrosine phosphatase inhibitors.</a> Methods. 42 (3), 250-260 (2007).</li>
<li>Vintonyak, V., Antonchick, A., Rauh, D., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of phosphatase inhibitors.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 13 (3), 272-283 (2009).</li>
<li>Barr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphatases+as+drug+targets%3A+strategies+and+challenges+of+inhibitor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphatases as drug targets: strategies and challenges of inhibitor development.</a> Future Medicinal Chemistry. 2 (10), 1563-1576 (2010).</li>
<li>He, R., Zeng, L., He, Y., Zhang, S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+tools+for+functional+interrogation+of+protein+tyrosine+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine phosphatases.</a> FEBS Journal. 280, 731-750 (2012).</li>
<li>Tsutsumi, R., Ran, H., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+inhibition+by+active+site-targeting+SHP2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Off-target inhibition by active site-targeting SHP2 inhibitors.</a> FEBS Open Biology. 8 (9), 1405-1411 (2018).</li>
<li>Chen, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+inhibition+of+SHP2+phosphatase+inhibits+cancers+driven+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allosteric inhibition of SHP2 phosphatase inhibits cancers driven by receptor tyrosine kinases.</a> Nature. 535 (7610), 148-152 (2016).</li>
<li>Nichols, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAS+nucleotide+cycling+underlies+the+SHP2+phosphatase+dependence+of+mutant+BRAF-%2C+NF1-+and+RAS-driven+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RAS nucleotide cycling underlies the SHP2 phosphatase dependence of mutant BRAF-, NF1- and RAS-driven cancers.</a> Nature Cell Biology. 20 (9), 1064-1073 (2018).</li>
<li>Clinical Trial NCT03114319. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03114319_rank=1</a> (2019).</li>
<li>Clinical Trial NCT03634982. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1">https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03114319?term=NCT03634982_rank=1</a> (2019).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+leukemia-associated+SHP2%28E69K%29+mutant+by+the+allosteric+SHP2+inhibitor+SHP099%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of leukemia-associated SHP2(E69K) mutant by the allosteric SHP2 inhibitor SHP099.</a> Leukemia. 32 (5), 1246-1249 (2018).</li>
<li>LaRochelle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+reorganization+of+SHP2+by+oncogenic+mutations+and+implications+for+oncoprotein+resistance+to+allosteric+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Structural reorganization of SHP2 by oncogenic mutations and implications for oncoprotein resistance to allosteric inhibition.</a> Nature Communication. 9 (1), 4508(2018).</li>
<li>Padua, R. A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activating+mutations+and+allosteric+drug+inhibition+of+the+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activating mutations and allosteric drug inhibition of the phosphatase SHP2.</a> Nature Communication. 9 (1), 4507(2018).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+allosteric+SHP2+inhibition+in+FGFR-driven+cancers+through+rapid+feedback+activation+of+FGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Resistance to allosteric SHP2 inhibition in FGFR-driven cancers through rapid feedback activation of FGFR.</a> Oncotarget. 11 (3), 265-281 (2020).</li>
<li>Smyth, L. A., Collins, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+the+selectivity+of+protein+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting the selectivity of protein kinase inhibitors.</a> Journal of Chemical Biology. 2 (3), 131-151 (2009).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Ericsson, U., Hallberg, B., Detitta, G., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>McNulty, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High-Throughput+Dose-Response+Cellular+Thermal+Shift+Assay+for+Rapid+Screening+of+Drug+Target+Engagement+in+Living+Cells%2C+Exemplified+Using+SMYD3+and+IDO1%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%22%5BJournal%5D)">A High-Throughput Dose-Response Cellular Thermal Shift Assay for Rapid Screening of Drug Target Engagement in Living Cells, Exemplified Using SMYD3 and IDO1.</a> SLAS Discovery. 23 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Romero, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+target+engagement+assay+for+the+characterization+of+SHP2+%28PTPN11%29+phosphatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A cellular target engagement assay for the characterization of SHP2 (PTPN11) phosphatase inhibitors.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (9), 2601-2613 (2020).</li>
<li>Ran, H., Tsutsumi, R., Araki, T., Neel, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticking+It+to+Cancer+with+Molecular+Glue+for+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Sticking It to Cancer with Molecular Glue for SHP2.</a> Cancer Cell. 30 (2), 194-196 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים עם התוכן של מאמר זה.

יש לנו הציג סיסמת מעורבות היעד שיכול לאשר איגוד ישיר של מולקולות קטנות לפוספטאז SHP2 בתאים. ההסתה יכולה להפלות בין מעכבי זיקה נמוכה וגבוהה, וחשוב מכך, לאשר חוסר עוצמה על ידי מעכבי allosteric של SHP099-סוג עבור מוטנט SHP2-E76K oncogenic GOF. כוחה של כך ממזערת היא יכולתה להשתלב בקמפיין הקרנה מעכב SHP2. היכולת של ההסכם לאשר כריכה תאית ל-SHP2 על ידי חומר כימי לא ידוע היא יכולת חשובה להבטיח שניתן לפרוס ביעילות משאבי סינון. בסך הכל, הפרוטוקול המצומצם הוא חזק ואמין.
היבט קריטי של ההסתה הוא התזמון; הת...

פוספורילציה טירוסין ממלא תפקיד חשוב בהתמרת אותות בתאים1,,2. שינוי זה לאחר תרגום הוא תיז על ידי קינאזים טירוסין חלבון (PTKs) והפוך על ידי פוספטאז טירוזין חלבון (PTPs). לכן, פונקציית PTK או PTP חריגה מובילה למחלות אנושיות רבות שעברובירושה או נרכשו 3,,4,,5,,6. Src-homology 2 (SH2) פוספטאז המכיל תחום 2 (SHP2) הוא PTP מסוג שאינו קולטן מבוטא באופן נרחב מקודד על ידי PTPN11פרוטו-oncogene7 והוא רגולטור מרכזי של תהליכים פיזיולוגיים רבים המערבים תזוזת אותות על ידי הפעלת Ras / Raf / ERK, PI3K/Akt, או נתיבי איתות JAK/STAT8. בדרך כלל, פעילות SHP2 מוסדר בחוזקה כדי למנוע איתות חריג. בתנאים בסיסיים SHP2 הוא autoinhibited על ידי תחום SH2 N-מסוף שלה, אשר חוסם את הגישה לאתר הפעיל בתוך תחום פוספטאז קטליטי (איור 1A)9,,10. עם הפעלת התא, חלבוני איגוד phosphorylated טירוזין לגייס SHP2, גורם לו לאמץ את הקונפורמציה הפעילה שלה, שבו האתר הפעיל נגיש כעת מצעים שלה. בסרטן רבים פעילות SHP2 הוא גבוה. מוטציות רווח-של-תפקוד סומטי (GOF) ב PTPN11 זוהו בעיקר לוקמיה ולמנוע איגוד של תחום N-SH2 לתחום phosphatase, וכתוצאה מכך SHP2 פעיל באופן קונסטרטיבי (איור 1B)11. מוטציות GOF נבט PTPN11 אחראים ~ 50% מהמקרים של תסמונת נונאן, הפרעה התפתחותית עם סיכון מוגבר שלממאירות 12. בגידולים מוצקים, שבו מוטציות PTPN11 הן נדירות, רמות גבוהות יותר של חלבונים מחייב זרחן להוביל לפעילות SHP2 משופרת(איור 1C). SHP2 חשוב גם לאותות מחסום חיסוני, כמו קולטני מחסום כגון BTLA או PD-1 לגייס SHP2 כדי dephosphorylate מפתח איתות מולקולות, מניעת הפעלת תאים חיסוניים13,,14,,15.
מיקוד PTPs עם מולקולות קטנות כבר אתגר, כי האתר הפעיל של PTPs הוא מאוד שהוזמן וטעון מאוד; מעכבים המתמקדים באתר הפעיל הם לעתים קרובות חזקים, אבל להפגין לקטיביות ירודה ותוכן ביו אוראלי16,,17,18,19,20,,21,22. אכן, מעכבי SHP2 דיווח רבים סובלים מבחירה ירודה וחוסר יעילות בתאים23. לאחרונה, מעכבי allosteric של SHP2 עם עוצמה טובה ובוחריות מעולה דווחו (למשל, SHP09924 ו RMC-455025) והציתו עניין מחודש מעכבי SHP2. תרכובות המבוססות על SHP099 ו RMC-4550 נמצאים כעת בשלב I ניסויים קליניים לטיפול בגידולים מוצקים עם קולטן טירוסין קינאז (RTK)מסלול הפעלה 26,,27. בעוד פורץ דרך, תרכובות אלה אינם יעילים נגד רבים של מוטנטים oncogenic SHP2 המניעים leukemogenesis במספר משמעותי שלחולי סרטן הדם 28,29,30. חוסר עוצמה זה של תרכובות כמו SHP099 כלפי גרסאות oncogenic SHP2 נובע מנגנון אלהסטרי ייחודי שלהם, כפי שהם מעכבים את פעילות SHP2 על ידי איגוד וייצוב לא פעיל, סגור conformation, אשר משובש מוטנטים SHP2. יתר על כן, בהתבסס עלדו"ח האחרון 31, מנגנוני התנגדות אדפטיבית בחולים שטופלו מעכבים כמו SHP099 הם די מתקבלים על הדעת. כתוצאה מכך, הפיתוח של מעכבי SHP2 הדור הבא המתמקדים במצבה הפעיל והפתוח הוא נושא למחקר אינטנסיבי.
האפיון של מעכבי SHP2 רומן בתאים הוא היבט חיוני של תהליך אופטימיזציה להוביל. באופן קריטי, מעורבות יעד מוכחת של המעכב בתנאים פיזיולוגיים מספק רמה נוספת של ביטחון כי משאבים לכימיה מרפאת פרוסים ביעילות על תרכובות עם יעילות תאית מבטיחה. בעבר, פותחו מספר שיטות להערכת הכריכה של מעכבי מולקולות קטנות ליעדים שלהם, בעיקר עבור קינאז חלבון32. כדי לפתח תסיסה של מעורבות יעד סלולרי SHP2, השתמשנו ב- assay33 שלמשמרת תרמית סלולרית. הודעה זו, בדומה לתנועתה התרמית במבחנה (PTS)לחלבונים 34, מנטרת את היציבות התרמית של חלבון היעד, אשר משתנה בדרך כלל על ידי איגוד מולקולות קטנות. ההסתה המקורית היא תפוקה נמוכה המשתמשת נוגדנים כדי לכמת את רמות חלבון היעד. לחלופין, בחרנו גרסה שדווחה לאחרונה של תסיסה תרמית המנצלת β-galactosidase אנזים שבר משלים (EFC) תס"א(איור 2)35. עבור ניסויים אלה, החלבון של עניין בא לידי ביטוי בתאים כחלבון היתוך N-או C-מסוף נושא תג ProLabel משופרת (ePL, שבר חומצת אמינו 42 של β-galactosidase). לאחר מכן, תאים מועברים להצלחות תואמות PCR של 384 בארות ומשוברים בתרכובות עניין. thermocycler מנוצל כדי להחיל מעבר צבע טמפרטורה על התאים, חלבונים אשר יהיה denature וצבירה ככל שהטמפרטורה עולה בהתבסס על היציבות התרמית שלהם. היכולת של תרכובת מועמד לאגד ולייצב את החלבון של עניין תגרום ליציבות תרמית מוגברת של חלבון זה. לכן, בעקבות הליזה של התאים, אותם חלבונים מתויגים שהתייצבו על ידי תרכובת מועמד יישארו בפתרון בטמפרטורות גבוהות יותר מאשר חלבונים מתויגים של תאים דגירה עם בקרת רכב. כתב אנזים מקבל (EA) הוא מסוגל להשלים את החלבונים מסיסים ePL מתויג, וכתוצאה מכך פעילות β-galactosidase לגילוי באמצעות מצע זוהר.
לאחרונה פיתחנו תסיסה תרמית תאית חזקה עבור SHP2 מסוג פראי (SHP2-WT) וגרסה אונקוגנית תכופה SHP2 (SHP2-E76K) בפורמט מצומצם של 384בארות 36. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט של תסיסה זו, אשר מזהה באופן אמין מעורבות היעד על ידי מעכבי SHP2 בתאים ומדגים רמה גבוהה של מתאם בין עוצמה מעכבת ונתוני משמרת תרמית סלולרית. זרימת העבודה הכללית של תרגום מומחה באות 3. הפלטפורמה שלנו משתמשת בחלבונים באורך מלא של EPL-SHP2 באורך מלא. עבור הדור של פלסמידות ביטוי pICP-ePL-N-SHP2-WT ו pICP-ePL-N-SHP2-E76K, נא עיין בפרסוםהאחרון שלנו 36. תסיסה זו יכולה להתבצע באמצעות מעבר צבע תרמי כדי לבסס פרופילים תרמיים SHP2 ולקבוע טמפרטורות התכה SHP2 בנוכחות או היעדר מעכב. לאחר פרופילים תרמיים הוקמו, זה יכול להתבצע גם בתנאים isothermal, המאפשר מעכב מינון תגובה הערכה. שני סוגי הניסויים מתוארים להלן.

<table><tbody><tr><td>תרמחזור עם שיפוע 384 בארים</td><td>אפנדורף AG</td><td>X50h</td><td></td></tr><tr><td>384 באר מיקרופלטה מתת בנפח נמוך של Echo</td><td>בקמן קולטר, בע"מ.</td><td>LP-0200</td><td></td></tr><tr><td>לוחות תרבית תאים של 6 בארות</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>657 160</td><td>סטרילי עם מכסה</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (אנטי-אנטי) 100 X</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>הרוזנת השנייה פלוגה</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium 1X + GlutaMAX</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10566-016</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>מטפל נוזלים אקוסטי אקוסטי Echo</td><td>בקמן קולטר, בע"מ.</td><td>אקו 550</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה אלקטרונית רב-ערוצית</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>E1 ClipTip</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>26140-079</td><td>500 מ"ל</td></tr><tr><td>בופר HEPES</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>15630-680</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>ערכת התחלה של InCell Pulse</td><td>Eurofins DiscoverX Corp.</td><td>94-4007</td><td>הרכיבים כוללים בופר EA, בופר ליזיס, ומצע</td></tr><tr><td>קורא מיקרופלט</td><td>Tecan Trading AG</td><td>ניצוץ</td><td></td></tr><tr><td>שפל פתרון חד-ערוץ</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S253012005</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11360-010</td><td>100 מ"מ</td></tr><tr><td>אטם מיקרופלט תרמי</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>PlateLoc</td><td></td></tr><tr><td>תגובות טרנספקציה</td><td>טרנספקציה של פוליפלוס</td><td>jetPRIME</td><td></td></tr><tr><td>כחול טרייפן</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>מגיב TrypLE Express</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>לוחות PCR בזמן אמת Twin.tec 384</td><td>אפנדורף AG</td><td>30132734</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי shp2 (ptpn11) מעכבי פוספטאז

Assessing Cellular Target Engagement by SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

Src-homology 2 (SH2) תחום המכיל פוספטאז 2 (SHP2), מקודד על ידי PTPN11 פרוטו-אונקוגן, הוא מגשר מפתח של קולטן טירוסין kinase (RTK) תא מונחה איתות, קידום הישרדות תאים והתפשטות. בנוסף, SHP2 מגויס על ידי קולטני נקודת בדיקה חיסונית כדי לעכב את הפעלת תאי B ו-T. פונקציית SHP2 חריגה כבר מעורב בפיתוח, התקדמות, גרורות של סוגי סרטן רבים. אכן, מעכבי SHP2 מולקולה קטנה נכנסו לאחרונה ניסויים קליניים לטיפול בגידולים מוצקים עם ראס / Raf / ERK הפעלת מסלול, כולל גידולים עם כמה מוטציות ראס oncogenic. עם זאת, המחלקה הנוכחית של מעכבי SHP2 אינה יעילה נגד SHP2 גרסאות oncogenic המתרחשות לעתים קרובות לוקמיה, ופיתוח של מולקולות קטנות ספציפיות כי היעד ONcogenic SHP2 הוא הנושא של המחקר הנוכחי. בעיה נפוצה עם רוב הקמפיינים גילוי סמים מעורבים חלבונים cytosolic כמו SHP2 היא כי ההתאסה העיקרית כי כונן גילוי כימי הם לעתים קרובות במבחנה אסה כי אינם מדווחים על מעורבות היעד הסלולרי של תרכובות מועמד. כדי לספק פלטפורמה למדידת מעורבות היעד הסלולרי, פיתחנו הן את ההגדרות התרמיות הסלולריות מסוג פראי והן את המוטציה התרמית הסלולרית SHP2. אלה אומר אמין לזהות מעורבות היעד של מעכבי SHP2 בתאים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף של תסיסה זו, אשר מספק כלי בעל ערך להערכה ואפיון של מעכבי SHP2.

ניסוי מעבר הצבע התרמי עבור SHP2-WT הביא לפרופיל תרמי תאי סיגמואידי עם מעבר התכה צר האופייני ועקבי עבור חלבון מקופל(איור 4A). SHP2 מורכב משלושה תחומים עצמאיים: שני תחומי SH2 והתחום הקטליטי (איור 1). בהתאמה סגורה אוטומטית תחומים אלה לשייך עצמי; המעבר הנמס שנצפה בניסוי הפרופיל התרמי שיקף ככל הנראה מצב זה בתא. דגירה של SHP2-WT עם מעכב אלוסטרי SHP099 ב 10 μM ייצב את הפרופיל התרמי SHP2-WT במידה משמעותית מדידה(איור 4A). זה משקף את מצב האיג...

היכולת להעריך מעורבות היעד על ידי מעכבי מועמד בתאים שלמים היא קריטית לגילוי סמים. פרוטוקול זה מתאר 384 גם פורמט התא סלולרי תרמי shift assay כי אמין מזהה מעורבות היעד הסלולרי של מעכבים מיקוד SHP2 מסוג פראי או גרסאות oncogenic שלה.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

The Src-homology 2 (SH2) domain-containing phosphatase 2 (SHP2), encoded by the PTPN11 proto-oncogene, is a key mediator of receptor tyrosine kinase ...

טירוזין פוספטזה SHP2, הוא מתווך מפתח של איתות הסלולר, קידום הישרדות התא והתפשטות. הצוות שלי מתמקד במציאת מעכבי SHP2 מולקולה קטנה לטיפול בסרטן. הטכניקה שלנו מספקת שיטה מהירה ורבת עוצמה כדי להקים תאים חודרים, כמו גם מעורבות היעד של מעכבי SHP2 מולקולה קטנה, בתאים.זה מבטיח, משאבי גילוי מכוונים ביעילות. SHP2 כיעד אטרקטיבי לטיפול בסרטן. וכמה מעכבי SHP2, נמצאים בניסויים קליניים.הטכניקה שלנו כדי להקל על הגילוי של מעכבי הדור הבא עם פרופילי יעילות משופרת. הפגנה להליך תהיה סלסט רומרו, עוזרת מחקר ודאגלס שפלר, פרופסור עוזר מחקר, מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל לנתק תאי T HEK293 מהלוחות, באמצעות שלושה מיליליטר של ניתוק תאים.לדלל את התאים עם 12 מיליליטר של מדיה צמיחה, ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 1, 400 פעמים G, במשך ארבע דקות. תן שימוש חוזר בחך התא ב-10 מיליליטר של מדיית צמיחה ולמדוד את הריכוז והכדאיות של התאים עם כחול טריפאן ודלפק תאים. צלחת 700, 000 תאים הגדלים באופן אקספוננציאלי לתוך כל באר של צלחת תרבות 6 היטב דגירה אותם במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני.ביום שלמחרת, לדלל שני מיקרוגרם של DNA פלזמה לתוך 200 microliters של חיץ transfection. מערבולת DNA פלזמה במשך 10 שניות ולרכז אותו ב 1, 400 פעמים G במשך ארבע דקות. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של רגנט טרנספיקציה לדנ"א המדולל.מערבולת זה במשך 10 שניות, ולחזור על הצנטריפוגה. להדגים את ה-DNA ב 23 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף את תערובת transfection לתאי HEK293 T המצורפת בשש צלחת גם, ולהחזיר את התאים לאנקובטור עוד 24 שעות. כדי להכין צלחות ממוזגות, לדלל פתרונות מעכבים ב- DMSO, לריכוז מלאי של 10 מילימולרים ולחלק אותם לתוך צלחת מקור נפח מת נמוך 384, לשימוש מיידי.לזהות את הנפח הרצוי של מעכבים או רכב, באמצעות מטפל נוזלי לתוך 384 גם בזמן אמת לוחות PCR בנפח הסופי היעד של פחות מ 0.5% DMSO. לאטום את הצלחות באמצעות איטום צלחת עם טיהור גז אינרטי. כדי להכין את התאים המרובים לפני הדגירה מדיה צמיחה ולמכור reagent ניתוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.מוציאים את התאים מהאינקובטור ושואבים בעדינות את התקשורת מה בארות. מוסיפים 0.3 מיליליטר של רהט ניתוק התא לכל באר, ומטלטלים בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי לכסות ביסודיות את פני השטח של תחתית הצלחת. דגירה הצלחת ב 23 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.הוסף מיליליטר אחד של מדיה צמיחה לכל באר, בעדינות pipette התאים באר. ואז להעביר אותם 15 מיליליטר פלקון צינור צנטריפוגה צנטריפוגה התאים ב 1, 400 פעמים G במשך ארבע דקות כדי לאסוף את התאים. בעדינות שאף את התקשורת, ולאחר מכן תן שימוש חוזר את גלולת התא בשני מיליליטר של מדיה צמיחה.ודא שהכדאיות של התא גדולה מ- 90%באמצעות נסה כחול פנורמי ודלפק תאים. לדלל תאים לריכוז של 125 תאים לכל microliter, שמירה על התאים בהשעיה לא יותר משעתיים עבור הכדאיות האופטימלית. עבור דגירה עם מעכבי SHP2, לחלק את התאים לתוך שוקת פתרון ערוץ יחיד סטרילי.צנטריפוגה מוכן בעבר 384 גם בזמן אמת לוח PCR ב 2, 500 פעמים G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את החותם ולהשתמש פיפטה רב ערוצית 125 מיקרוליטר, כדי להוסיף חמישה microliters של תאים מדוללים בארות הרצוי. צנטריפוגה הצלחת ב 42 פעמים G במשך 30 שניות ללא מכסה, ולאחר מכן לצרף מכסה הדגירה את הצלחת במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. תכנתו את ה-Thermo cycler, בהתאם לכיווני כתב היד של שיפוע הפרופיל התרמי או הניסוי היזותרמי.התחל את תוכנית פעימת החום של התרמוצ'ילר, והצב את לוחית ההתקפיה על הבלוק התרמי. לאחר סיום התוכנית, הסר את לוחית ההתנסויות. להשלים כל באר של צלחת בדיקה עם חמישה microliters של תערובת ראשית זיהוי מורשה.צנטריפוגה הצלחת ב 42 פעמים G במשך 30 שניות, ולאחסן אותו ב 23 מעלות צלזיוס בחושך במשך 30 עד 60 דקות. למדוד chemiluminescence באמצעות קורא מיקרופלסטיק עם זמן האינטגרציה ממוטב. ניסוי שיפוע תרמי עבור סוג הבר SHP2, הביא פרופיל תרמי תאי סיגמואידאלי עם מעבר התכה צר האופייני לחלבון מקופל.הדגירה של SHP2 מסוג פראי עם מעכב allosteric SHP099, התייצב לפרופיל התרמי במידה משמעותית ומדידה. הייצוב של SHP2, גם במעקב עם העוצמה של SHP099 כמו תרכובות allosteric. ב 10 micromolar, RMC-4550 חזק יותר, הפיק מידה רבה יותר של ייצוב מאשר SHP099 עבור סוג פראי SHP2.בשל המנגנון הייחודי שלהם, SHP099 כמו מעכבי allosteric יעילים פחות נגד מוטציות אונקוגניות SHP2 רבות, כולל SHP2-E76K. עולה בקנה אחד עם תכונות ידועות אלה רק ייצוב תרמי שולי של SHP2-E76K על ידי SHP099 הוא ציין. רמת הביטוי של חלבון תג EPL יכולה להשפיע באופן דרמטי על עוצמת האות.פרופילים תרמיים לתאי סוג בר ארעיים ומשולבים היטב. בתנאי נכס זהים מוצגים. נורמליזציה של עקומות שונות מאפשר פרופילים תרמיים דומים, חושף את המגוון הרחב של מערכת זיהוי EFC.ניצול היכולת של רוכב האופניים התרמי לייצר מעברי צבע תרמיים על הציר הקצר של צלחת באר 384. סדרה של ציצים isothermal יכול להתבצע על צלחת אחת. בטמפרטורה אופטימלית, טיטרציה איזותרמית באמצעות תגובת מינון מלאה של 10 נקודות, הניבה EC50 שימושי, עבור RMC-4550.העקרונות של נכס זה יכול לשמש כדי לפקח על השפלה של חלבונים בתאים, המושרה על ידי תרכובות PROTAC. אנו משתמשים בטכניקת שינוי תלמה הסלולר כדי לגלות מעכבי SHP2 מוטציה ולוקמיה, תרופות ספציפיות נגד מוטציות אונקוגניות SHP2 תכופים תהיה השפעה משמעותית לטיפול בסרטן אלה.

assessing-cellular-target-engagement-shp2-ptpn11-phosphatase

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה לביצוע משקעים חיסוניים משותפים של חלבוני PD-1 מסוג פרא המתויגים כ-GFP ומוטציה PD-1 באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד GFP. חלבוני PD-1-GFP הקשורים לחרוזים מודגרים עם חלבוני SHP2 המקיימים אינטראקציה עם PD-1, ומאפשרים זיהוי מוטיבים מבניים ספציפיים ב-PD-1 הממלאים תפקיד קריטי באינטראקציה עם SHP2.

בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכים נוגדנים לזהות שינויים איתות המסלולים במודלים שונים של הסלולר. שינויים אלה, הנגרם על ידי תרופות/היפוקסיה/אולטרא-violet אור/קרינה, או על ידי ביטוי/downregulation/הסתרה, חשובים עבור מודלים שונים של המחלה, ניתן לציין אם טיפול יהיה יעיל או ניתן לזהות מנגנונים של סמים . התנגדות.

הערכה של התנגדות מעכבי טירוזין קינאז על ידי חקירה של האות התמרה חושית מסלולים על-ידי מערכים נוגדן

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

נייר זה משתמש assay המבוססות על זרימת-cytometry לספריות מסך של מעכבי כימיים לצורך זיהוי מעכבי ו המטרות שלהם להשפיע על איתות לקולטן T-cell. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן גם עבור הקרנות תפוקה גבוהה.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

כאן אנו מציגים פרוטוקול להעשרת פוספטזות פוספופרוטאין אנדוגניות והחלבונים המתקשרים ביניהן מתאים ורקמות וזיהוי וכימות שלהם על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות.

גישה מבוססת ספקטרומטריית מסות לזיהוי פוספטזות פוספופרוטאין והאינטראקציות שלהם

פרוטוקול זה מתאר את התכנון, היצירה והיישום של פוספטאזות מווסתות רפמיצין. שיטה זו מספקת ספציפיות גבוהה ובקרה זמנית הדוקה של הפעלת phosphatase בתאים חיים.

פיתוח ויישום של טירוזין פוספטאזים מווסתים רפמיצין

RASopathies הן תסמונות גנטיות רב-מערכתיות הנגרמות על ידי היפראקטיביזציה של מסלול RAS-MAPK. וריאנטים פתוגניים פוטנציאליים הממתינים לאימות מופיעים ללא הרף בעוד ראיות פרה-קליניות גרועות מגבילות את הטיפול. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ה-in vivo שלנו לבדיקה ואימות צולב של רמות הפעלת ERK הקשורות ל-RASopathy ואת האפנון הפרמקולוגי שלו במהלך האמבריוגנזה על ידי הדמיית FRET חיה בדג זברה Teen-reporter.

פרוטוקול יעיל להערכת אפנון פעילות ERK במודלים מוקדמים של תסמונת נונן של דג הזברה באמצעות מיקרוסקופ FRET חי ואימונופלואורסצנציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במצעים המוצגים על פני השטח של שמרים לבדיקות שינוי אנזימטיות. הפלטפורמה הודגמה באמצעות ניתוח פעילות הדפוספורילציה של טירוזין פוספטאז SHP-2 כנגד אחד המצעים שלו כבדיקת שינוי אנזימטי מייצגת.

שינוי אנזימטי והערכת ציטומטריית זרימה של חלבונים המוצגים על פני השטח של שמרים

פרוטוקול זה נועד לשחזר ולהתכונן התאים היעד נדיר מתערובת עם תאי המטרה ללא רקע אפיון גנטי מולקולרי ברמת תא בודד. איכות ה-DNA שווה לתאים בודדים שאינם מטופלים ומאפשר יישום תא בודד (הקרנת שני מבוסס, ממוקד ניתוח).

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

למדו שיטת cellular thermal shift assay בפורמט 384-well להערכת מעורבות יעד של מעכבי SHP2 בתאים שלמים. השיטה מאפשרת גילוי מהיר של מעכבים קטני מולקולות לטיפול בסרטן.

הערכת מעורבות יעד סלולרי על ידי SHP2 (PTPN11) מעכבי פוספטאז

גלה סרטונים נוספים