ניהול תוך-סחיר של ניסוח אבקה יבשה בעכברים

מתן תוך-קנה של אבקה יבשה חיוני להערכת הביצועים והפעילויות הביולוגיות של פורמולציה של אבקה בשאיפה, כגון ספיגה ריאתית, זמינות ביולוגית והשפעות טיפוליות במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים. תהליך האינטובציה אינו פולשני ויכול לספק פורמולציה של אבקה לעכברים בצורה בטוחה ומדויקת. אינספלטור האבקה היבשה בהתאמה אישית הוא חד פעמי, זול ויעיל בהפצת תכשירי אבקה.

ניתן להשתמש באינסופלטורים בהערכת ניסוחים שונים על מספר עכברים באותם ניסויים ללא סיכון לזיהום צולב משאריות אבקה. תהליך האינטובציה מאתגר עבור חוקרים שאינם מנוסים. היכולת לדמיין ולכוון את הקצה העדין ביותר של הצינורית בפתח קנה הנשימה היא קריטית להחדרה נכונה של הצינורית המנחה.

טכניקה זו דורשת תרגול כדי למזער החדרה לא נכונה. הפוסט-דוקטורנטית שלי קרול והדוקטורנטית שלי רייצ'ל הולכות להדגים את הליך ההכנה והאינטובציה. כדי להתחיל, נטרל את המטענים הסטטיים של האבקה היבשה ואת קצה הפיפטה העגול של 200 מיקרוליטר ללא פילטר עם אקדח אנטי סטטי או איזון עם פונקציית דה-יוניזציה.

הכן נייר שקילה בגודל משוער של ארבעה על ארבעה סנטימטרים. קפלו את הנייר לשניים באלכסון ואז פרשו אותו. לאחר מכן השתמש בו כדי לשקול מיליגרם עד שניים של אבקה יבשה.

מלאו קצה פיפטה טעון ג'ל באבקה דרך הפתח הרחב יותר והקישו עליו בעדינות כדי לארוז את האבקה עד ליצירת אגרומרטים רופפים ליד הקצה הצר של הקצה. הימנע מאריזת האבקה חזק מדי מכיוון שהיא עלולה לפגוע בפיזור. חבר את הקצה הטעון באבקה למזרק מיליליטר אחד דרך תא עצירה תלת כיווני המחזיק את הקצה והמזרק אנכית במהלך החיבור כדי למנוע שפיכת אבקה.

ניתן לשנות את גודל המזרק בהתאם לנפח האוויר המשמש לפיזור האבקה. אם המתן לא מתבצע באופן מיידי, השתמש בפרפילם כדי לאטום את פתחי הקצה ולאחסן אותו באופן זמני בתנאים מתאימים עד לשימוש. לאחר הרדמת עכבר BALB/c בן שבעה עד תשעה שבועות עם קטמין וקסילזין, הנח אותו על פלטפורמת פרספקס המותקנת על מעמד.

תלו את העכבר על ידי חיבור החותכות שלו על חוט דנטלי ואבטחו את מיקומו בעזרת פיסת סרט או גומיה. התאם את הגובה והזווית של הפלטפורמה. הכנס את הסיב האופטי לתוך הצינורית המנחה עם קצה מפלס הסיבים עם פתח הצינורית.

לאחר מכן הפעל את פנס ה-LED כדי להאיר. הבליטו בעדינות את לשון העכבר בעזרת זוג מלקחיים כדי לחשוף את קנה הנשימה שלו. השתמש ביד השנייה כדי להחזיק את הצינורית המנחה עם סיבים אופטיים ולהכניס אותם דרך חלל הפה.

עם התאורה מהסיב האופטי, ניתן לדמיין את פתח קנה הנשימה כפתח בין מיתרי הקול. יישר את השיפוע של הצינורית המנחה לכיוון קו האמצע של הפתח והחדיר אותו בעדינות עם הסיב האופטי לתוך קנה הנשימה על ידי כיוון הקצה העדין ביותר של הצינורית לפתח קנה הנשימה. לאחר האינטובציה, הסר במהירות את הסיב האופטי והשאיר את הצינורית המנחה בתוך קנה הנשימה.

יש להקפיד על שיקום רגיל. החזק את פיפטת הקצה הדק בפתח הצינורית המנחה והחדיר נשיפה קטנה של אוויר לתוך ריאת העכבר. ניפוח קל בחזה מעיד על אינטובציה תקינה.

יש להסיר את פיפטת הקצה הדק לפני מתן האבקה. החזק את הקצה הטעון בחשמל המחובר למזרק, וודא שזרימת האוויר בין המזרק לקצה מנותקת. משוך את בוכנת המזרק לאחור כדי להוציא 0.6 מיליליטר אוויר.

סובב את השסתום של תא העצירה התלת-כיווני כדי לחבר את זרימת האוויר בין המזרק לקצה הטעון בכוח. לאחר מכן הכנס את הקצה הטעון בכוח לתוך הצינורית המנחה שכבר הונחה בקנה הנשימה של העכבר. החזק את הצינורית המנחה ודחף את בוכנת המזרק בכוח בפעולה רציפה אחת כדי לפזר את האבקה כאירוסולים לתוך הריאה, תוך מזעור כל תנועה קדימה כדי למנוע פגיעה בבעל החיים.

הסר את הקצה ובדוק אם האבקה התרוקנה. לאחר השלמת הניהול, הסר את הצינורית המנחה מקנה הנשימה. אפשר לעכבר להתאושש על ידי הצבתו אופקית במצב שכיבה כשלשונו בולטת למחצה כדי למנוע חסימה של דרכי הנשימה.

כדי לייעל את השיטה, נעשה שימוש בכמויות שונות של אוויר כדי לפזר מיליגרם אחד של מניטול מיובש בתרסיס ומשקל העכברים נוטר. השימוש ב-0.3 ו-0.6 מיליליטר אוויר לא גרם לירידה במשקל של העכברים עד 48 שעות לאחר המתן. פיזור האבקה במיליליטר אחד של אוויר הביא לירידה של למעלה מ-5% במשקל תוך 24 שעות, שלא התאוששה במלואה לאחר 48 שעות.

העכברים קיבלו מיליגרם אחד של אבקת SFD המכילה חמישה מיקרוגרם של mRNA וביטוי הלוציפראז בריאות הוערך 24 שעות לאחר מתן באמצעות מערכת הדמיה in vivo. אבקת ה-SFD התפזרה בריאה העמוקה ונצפה ביטוי לוציפראז. לשם השוואה, האבקה הורכבה מחדש במים וניתנה באמצעות מרסס מיקרו באותו הליך אינטובציה.

ביטוי הלוציפראז של הפורמולה המחודשת היה גבוה משמעותית מתכשיר האבקה היבשה, מה שיכול לנבוע מבעיית התפכחות האבקה או פרופיל פרמקוקינטי שונה בין האבקה לצורת הנוזל. המאפיינים ההיסטולוגיים של הריאות שטופלו בתרסיס אבקה יבשה mRNA הושוו לקבוצות ביקורת לא מטופלות וקבוצות שטופלו ב-LPS. הריאה ללא כל טיפול הדגימה מצג בריא ואילו הריאה שטופלה ב-LPS הראתה פיזור לא סדיר של חלל האוויר וחדירת תאים דלקתיים לחללים הבין-רקמתיים והמכתשית.

הריאות שטופלו באבקת SFD לא הראו סימני דלקת. לפיזור אבקה מוצלח, יש להקיש בעדינות על האבקה בקצה הטעינה ולא לארוז חזק מדי בקצה. ניתן להתאים את הגדרת האינטובציה הזו גם למתן תכשירים נוזליים באמצעות פיפטה או מיקרו מרסס.