הפרעות RNA בחפשיות מימיות ככלי רב עוצמה למניפולציה ביטוי גנים בנקודות זמן התפתחותיות ספציפיות

אפילו כאשר עריכת גנים הפכה לפופולרית לחקר הגנטיקה המולקולרית של אורגניזמים שאינם מודלים, RNAi נשאר כלי סינרגטי רב עוצמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה יכול להיות מיושם על שלבים התפתחותיים שונים. בנוסף, ניתן להשתמש בהפלה חלקית כדי לחקור את כל הגנים האלה.

ההצלחה של ההליך מסתמכת על הזרקת DSR ויש נזק מינימלי. זה דורש תרגול, אז אל תתייאש אם זה לוקח כמה ניסיונות כדי לקבל את זה נכון. כדי להכין עוברים בשלב מוקדם להזרקת מיקרו, יוצקים תחילה 20% רותחים לתוך צלחת פטרי קטנה ומ מניחים שלושה צינורות פלסטיק ברוחב 1-2 מ"מ על פני הנוזל לפני שהוא מתגבש.

לאחר שהתעוררות התגבשה השתמשו בזוג מדפים קהים כדי להסיר את הצינורות ולכסות את החריצים הנובעים מכך ב-500 מיקרוליטרים של מים מזוקקים אוטוקלאבים. כאשר מיכל הקולקציה מוכן להשתמש במברשת צבע שיער טבעית עדין להעביר חמישה שמונה שעות עובר T.marmoratus בן מאתרי קינון חיפושית לתוך צלחת חלל זכוכית מלא מים מזוקקים autoclave תחת מיקרוסקופ סטריאו. באמצעות מיקרוסקופ ומטלות ניתוח בסדר לתפוס את chorion של כל עובר משני הצדדים לקרוע את chorion פתוח המאפשר לעובר להחליק בעדינות מתוך הרקמה.

לאחר הסרת שתי שכבות chorion מכל העוברים שנאספו להשתמש במברשת צבע כדי להעביר בזהירות את העוברים מן צלחת חלל הזכוכית לתוך החריצים של צלחת אגרוז מוכן. כדי להזריק עוברים בשלב מוקדם עם RNA גנים ספציפיים כפול תקוע תחילה להכין מחטי microinjection על פולר מחט ולהשתמש במיקרוסקופ סטריאו ולמצוא מדפים לשבור כל קצה לקצה חד. לאחר זריקת מלאי מטוהרים כפול תקועים RNA של עניין על קרח, להוסיף microliter אחד של חיץ הזרקה 10X לפתרון וכתוצאה מכך ולהשתמש במים מזוקקים כפולים כדי להביא את נפח ויניל של הפתרון 10 microliters.

השתמש פיפטה P10 כדי backfill אחד מחטי microinjection מוכן עם פתרון RNA תקוע כפול עובד לטעון את המחט לתוך מחזיק microneedle מחובר למערכת microinjection שמשתמש בטכנולוגיית פליטת לחץ. הפעל את מערכת microinjection ואת אספקת האוויר בלחץ ולהשתמש שסתום מיקרו על מערכת microinjection כדי להגדיר את לחץ ההזרקה ל 15 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע ואז להשתמש ידית התאמת זמן כדי להגדיר את משך ההזרקה לשניות. כדי לכייל את מחט ההזרקה להעריך את נפח בועת הנוזל שנוצר בקצה המחט בעת הזרקת לאוויר עבור עובר T.marmoratus להשתמש בגודל בועה אופטימלית של 100 עד 200 מיקרון.

מחט ההזרקה היא באיכות טובה אם בועות אופטימליות ניתן להשיג ב 15 ק"ג של לחץ לאינץ 'מרובע עם משך הזרקה של כשלוש שניות. כאשר המחט להגדיר מוכן ליישר את המחט על צלחת agarose של עוברים, כך המחט מתקרב העוברים בזווית של 45 עד 60 מעלות. השתמש במיקרו מניפולטור כדי להזיז לאט את המיקרונידל עד שהטיפ נוגע במשטח של אמצע עובר אחד ואז בזהירות להזיז את המחט קדימה עד שהוא פשוט חודר את פני השטח של העובר.

ברגע המחט היא בתוך העובר בזהירות ללחוץ על כפתור הזרקת מזרק מיקרו כדי לספק אחד עד שני nanoliters של RNA תקוע כפול לתוך העובר. כאשר כל RNA נמסר לאט לסגת המחט מן העובר מבלי לגרום לעובר להיקרע. עוברים מוזרקים בהצלחה ניתן לזהות על ידי נוכחות של נקודה צבעונית באתר של הזרקה.

כאשר כל העוברים הוזרקו בזהירות למקם את המנה לתוך תא לחות באינקובטור 25 מעלות צלזיוס להגדיר מחזור אור 14 שעות 10 שעות כהה במשך ארבעה עד חמישה ימים. נטר את התקדמות התפתחות העובר מדי יום תחת מיקרוסקופ הסטריאו כדי לזהות פנוטיפים נוקאאוטים גלויים למורפולוגית. שימוש במצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה כדי לתעד את תהליך הפיתוח.

הסר את כל העוברים המתים ולחדש את המים על צלחת האגרוז מדי יום, כדי למנוע יירוז והתפשטות של זיהום מיקרוביאלי לעוברים אחרים ששרדו במהלך תקופת הדגירה. לפני איסוף הזחל הראשון להוסיף 60 עד 70 מעלות צלזיוס 2% נוזלי agarose לצלחת פטרי קטנה. כאשר agarose יש מוצק להשתמש מדפים קהה לעשות קבוצה רדודה אחת לכל זחל להיות מוזרק לתוך אגרוז בעדינות לנקז את המים מן כוסות תרבות הזחל.

לאחר ההרדמה להשתמש מטלפים קצה רך בזהירות למקם את הזחל על צלחת קיבוע עם הצווארים והגוף בחריצים אבל הזנב ממוקם מעל פני השטח agarose. כאשר כל הזחל הונח, לכסות כל לבה עם שכבה עבה של אגרוז כי הוא עדיין נוזלי אבל לא חם בצורה מסוכנת ללא כל סיפורים כי היו מכוסים בטעות לפי הצורך. עבור microinjection RNA תקוע כפול לטעון microneedle עם הגן ספציפי כפול תקוע RNA פתרון עבודה של עניין כפי שהוכח.

רדרג את הבוכנה של מזרק microinjection נשלט ידנית לטעון את המחט על מערכת microinjection. מקם את הזחל משותק תחת מיקרוסקופ סטריאו כך אתר ההזרקה מיושר עם המסלול של מחט microinjection בזווית שטוחה יחסית. השתמש במיקרו מניפולטור כדי להעביר בזהירות את קצה המחט לתוך הזחל לאט ובזהירות להפעיל לחץ על המזרק, התאמת לחץ ההזרקה על פי התנועה של נוזל ההזרקה הצבעונית במחט לפי הצורך.

כאשר כל ה- RNA הוזרק להשתמש במקלפים רכים כדי לשחרר את הזחל מן agarose ולהחיל את הזחל לתוך מיכל חדש של מים בטמפרטורת החדר ב 25 עד 28 מעלות צלזיוס ומחזור אור 14 שעות 10 שעות כהה. בניתוח מייצג זה שלושה גנים שונים הופלו במגוון שלבים התפתחותיים שונים של חיפושית הצלילה של קרני השמש T.marmoratus. הפרעת RNA מבוצעת כפי שהוכח על ידי הזרקת RNA כפול תקוע בשלב מוקדם מאוד של עובר.

חלק מהעוברים אינם שורדים את התהליך והפכו לנמקים. בתמונות אלה הם שולטים הפרט אדם עם צבע עיניים בהיר מעט ניתן לראות. באדם זה, הפלה חמורה יותר שבה השקרים הגחוני יותר של האשכול הם unpigmented לחלוטין, אבל בעלי הברית לעשות עדיין להראות קצת פיגמנטציה ניתן לראות.

כאן דוגמה של אדם אחר עם אובדן פיגמנט שלם במהותו בכל העיניים מוצגת. Lac2 הפיל בתוצאות זחלים קוטיקל פחות פיגמנט, אנשים בוגרים קלים יותר עם כנפיים מעוותות במקצת סביר בשל הרכות יוצאת דופן של הרקמה הושגו גם. הקפד להסתכל בחריפות כדי להתבונן מקרוב בבעלי החיים המוזרקים שלך על בסיס יומי ולהסיר באופן מיידי את כל האנשים המתים.

כוחה של טכניקה זו הוא שניתן ליישם אותה על הגנים של אורגניזמים רבים ושונים. טכניקה זו גם יישמת באופן נרחב ומצליח על ביולוגיה התפתחותית אבולוציונית.