Name: זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: למד זיהוי מהיר של Phytophthora capsici במי השקיה באמצעות שיטת LAMP וסינון נייר. שיטה שטחית זו מאפשרת ניתוח מיידי לניהול מחלות צמחים יעיל ומונעת הפסדים חקלאיים משמעותיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו זכתה לתמיכה כספית של הנציבות לסחורות של גאורגיה עבור מזהה פרויקט ירקות# FP00016659. המחברים מודים ד"ר Pingsheng ג'י, אוניברסיטת ג'ורג'יה וד"ר אן דורנס, אוהיו סטייט למתן תרבויות טהורות של Phytophthora spp. אנו מודים גם לי וואנג וDeloris Veney על הסיוע הטכני שלהם לאורך כל המחקר.

1. זיהוי באתר של Phytophthora capsici ממים השקיה באמצעות לולאה ניידת מתווכת
<ol><li>הגדרת המשאבה והמסנן<ol>
<li>חבר בקבוקון סינון לצינור המחובר למשאבת יד כך שכאשר המשאבה תופעל, האוויר יימשך דרך הפה של בקבוקון הסינון.</li>
		<li>התאם את משפך בוכנר לתוך מעצור הגומי לפה בקבוקון הסינון והכנס את פיסת נייר הסינון בגודל המתאים למשפך בוכנר כך שאוויר נשלף דרך נייר הסינון. נייר המסנן צריך להיות בגודל שמירה של 15 μm. הערה: נייר המסנן חייב להתאים לקצוות של משפך Buchner כך שמים מינימליים יזרמו סביב נייר המסנן.</li>
	</ol></li>
	<li>דגימת מים וסינון<ol>
<li>קח דגימות מים מהמקור המיועד. מים עשויים להיות כמויות קטנות של פסולת אבל לא משקעים משמעותיים או אדמה.</li>
		<li>יוצקים עד 1,000 מ"ל (1 ליטר) של מי בדיקה על נייר המסנן הממוקם בתוך משפך Buchner לאט מספיק כדי למנוע גלישה, בעוד משאבת היד (או ואקום) משמש ליצירת יניקה כדי למשוך את המים דרך. הערה: אין כמות מינימלית של מים שניתן לבדוק בשיטה זו, ולמרות שזה לפחות 50 מ"ל מוצע, 1000 מ"ל הוא המקסימום עבור שיטה זו.</li>
		<li>בעזרת מקצות, הסר את נייר המסנן ממשפך בוכנר וחתוך אותו לחתיכות קטנות עם מספריים סטריליות. להוסיף כמו חתיכות רבות (8-12) כפי שניתן לשקוע בכמות של מאגר החילוץ (400 μL עבור מיצוי מבוסס חרוז מגנטי) הנדרש על ידי הפרוטוקול לתוך צינור 1.5 מ"ל. שמור את החלקים הנותרים של נייר סינון לעיבוד לאחר חילוץ הסט הראשון.</li>
		<li>מערבולת או אחרת להרגיז את חתיכות נייר מסנן ומאגר החילוץ במשך 10 s כל דקה במשך 5 דקות. לאחר מכן, באמצעות מפסים, הסר את נייר המסנן לאבד מעט ממאגר החילוץ ככל האפשר. חזור על שלב זה עם החלקים הנותרים של נייר סינון עד שכל החלקים יהיו מערבולת / נסער וספוג במאגר החילוץ.</li>
	</ol></li>
	<li>חילוץ מגנטי מבוסס חרוז של DNA מנייר סינון<ol>
<li>לצינור 1.5 מ"ל (אשר מכיל כעת כ 200-300 μL של מאגר החילוץ), להוסיף 20 μL של חלבון K ו 10 μL של 10 ng/μL RNase.</li>
		<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, מערבולת או לנער את הצינור כל 3 דקות.</li>
		<li>להוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים עם מאגר האיגוד לדגימה ולערבב היטב על ידי טלטול. לאחר מכן דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>מניחים את הצינור במדף המפריד המגנטי למשך 2 דקות עד שכל החרוזים נמשכו למגנט. הסר וזרוק את הסופרנטנט.</li>
		<li>הסר את הצינור מהמפריד המגנטי. להוסיף 500 μL של מאגר כביסה 1 ולהשעות מחדש חרוזים על ידי ניעור הצינור במרץ. חכה 30 שניות ואז תמקם את הצינור בחזרה במפריד המגנטי. המתן 2 דקות עד כל החרוזים נמשכו לכיוון המגנט לפני הסרת ושליך supernatant. הערה: כאשר מחכים לחרוזים המגנטיים כדי למגנט את המפריד, אנו ממליצים להפוך את הצינור, אשר יכול לנתק חרוזים מגנטיים דבוקים לכובע והצדדים של הצינור וכתוצאה מכך מספר גדול יותר של חרוזים להיות מחובר.</li>
		<li>חזור על שלב 1.3.5 עם 500 μL של מאגר כביסה 2.</li>
		<li>חזור על שלב 1.3.5 עם 500 μL של 80% אתנול.</li>
		<li>Airdry גלולת חרוז מגנטי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (18-27 ° C) עם המכסה פתוח. אם הטמפרטורות אינן מתירות, דגירה ביד עם כפפות עם הכובע פתוח במשך 15 דקות.</li>
		<li>הסר את הצינור מהמפריד המגנטי. להוסיף 50 μL של חוצץ חוצץ ולהשעות מחדש את החרוזים על ידי pipetting למעלה למטה במשך 1 דקות.</li>
		<li>המקם צינור בחזרה במפריד מגנטי. המתן 2 דקות לפני העברת supernatant מבלי להפריע את החרוזים צינור נפרד לאחסון DNA. הערה: כאן ניתן להשהות את הניסוי לפני שתמשיך הלאה. דנ"א שחולץ צריך להיות מאוחסן על קרח או במקפיא של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>יישום של תסוואי LAMP שפותח לאחרונה<ol>
<li>הכן את תערובת פריימר LAMP באמצעות 0.2 μM של כל פריימר F3 ו- B3, 0.8 μM של כל פריימר Loop-F ולולאה-B, ו- 1.6 μM של כל פרימר FIP ו BIP(טבלה 2).</li>
		<li>הוסף את פתרון LAMP הבא שפופרת PCR יחיד, או לכל צינור בודד ברצועת צינור 8: 2.5 μL של תערובת פריימר (שלב 1.4.1), 12.5 μL של תערובת מאסטר מנורת LAVA, 1 μL של ה-DNA שחולצו, ו 9 μL של ddH2O. הנפח הכולל הוא 25 μL. הערה: אם משתמשים בכלי ההגדלה הנייד (לדוגמה, Genie III) עם צבע צבעי (לדוגמה, התחלה חמה), עיין בסעיף 2.4.2- 2.4.3.</li>
		<li>ציין שני צינורות כפקדים חיוביים ושליליים. עבור פקד חיובי, להשתמש או פקד שסופק על ידי ערכת LAVA LAMP, או דגימת DNA חיובית ידועה. עבור פקד שלילי, השתמש ddH2O. עבור שניהם, להחליף את 1 μL של ה-DNA שחולצו עבור 1 μL של שליטה חיובית או ddH2O.</li>
		<li>הגדר את הדגימות לבלוק חום (או למכשיר ההגדלה הנייד) המוכן ל-64°C למשך 45 דקות. הערה: שיטות חילוץ אחרות ניתן להשתמש כאן במקום חילוץ מבוסס חרוז מגנטי. CTAB וערכת מיצוי DNA מסחרי נבדקו שניהם בהצלחה באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים והחלפה חתיכות נייר מסנן עבור דגימת הצמח24,25. התוצאות הושוו בטבלה 2. אם ניתן לכמת ריכוז של דנ"א, השתמשו בין 1-10 דנ"א גנומי.</li>
	</ol></li>
	<li>הדמיה של תוצאות<ol>
<li>אם מבוצע בהגדרת מעבדה, להציג את מוצרי ההגבהה על ידי טעינת 5 μL של כל מדגם לתוך 1% ג'ל agarose, הפעלתם במכונת אלקטרופורזה ג'ל, והדמיה אותם במכונת הדמיה UV.</li>
		<li>אם נעשה שימוש בצבע צבע (לדוגמה, Warmstart), הצג את שינוי הצבע כדי לקבוע את התוצאות כחיוביות או שליליות.</li>
		<li>אם נעשה שימוש בכלי ההגדלה נייד (לדוגמה, Genie III), הצג את גרף ההגדלה על המסך כדי לקבוע את התוצאות.</li>
	</ol></li>
	<li>יישום של אביזר PCR שפותח בעבר הערה: אם משתמש ב- PCR רגיל, שלבים 1-3 נשארים זהים, ויש להחיל את השלבים הבאים במקום שלבים 1.4 ו- 1.5.<ol>
<li>להוסיף 1 μL של כל הפקת DNA לצינורות בודדים המכילים את הרכיבים הבאים: 12.5 μL של תערובת PCR ירוקה, 9.5 μL של ddH2O, ו 1 μL של פריימרים קדימה והפוך(טבלה 2).</li>
		<li>סובבו כל דגימה באמצעות מיקרוצנטריפוגה והכנסו צינורות למחזור תרמי.</li>
		<li>השתמש בהגדרות המחזור התרמי הבאות בהתאם לפרסומים הקודמים: 94 °C למשך 5 דקות, 30 מחזורים של denaturation ב- 94 °C עבור 30 שניות, חיתוך ב- 54 °C עבור 30 שניות, הארכה ב- 72 °C למשך דקה אחת והארכה סופית ב- 72 °C למשך 10 דקות.</li>
		<li>הפעל את המוצר בג'ל agarose 1%. שים לב לנוכחות של להקות תחת אור UV שבו תגובות חיוביות יהיה גודל הלהקה של ~ 508 bp.</li>
	</ol></li>
	<li>שיטת זיהוי מסורתית הערה: קיימות שיטות מרובות של ציפוי סלקטיבי לזיהוי פתוגן, וההודעה הבאה היא פרוטוקול כללי עבור P. capsici.<ol>
<li>ראשית, להשיג פרי חצילים בריא (מארח רגיש P. capsici)ופני השטח לחטא על ידי שטיפת פני השטח של הפרי עם 70% אלכוהול isopropyl.</li>
		<li>מניחים את פרי החציל בגזי חלב עם מכשיר ציפה (קצף פוליאתילן או אחר) ופורסים בבריכות השקיה. אבטחו כל מלכודת פיתיון לנקודה אחת והשאירו את המלכודות במאגר המים (מי השקיה ממוחזרים) למשך 7 ימים לפחות או עד לתסמיני ריקבון פירות. לאסוף את הפרי ולהעביר אותו למעבדה.</li>
		<li>לשטוף ולתייבש את הפרי בקפוצ'ון סטרילי לפני הסרת חתיכות קטנות של רקמות נגועות ולמקם אותם על צלחת של PARPH בינוני תוקן עם 25 מ"ג / L pentachloronitrobenzene, 0.0005% pimaricin, 250 מ"ג / L אמפליקלין, 10 מ"ג / L rifampicin ו 50 מ"ג / L hymexazol. דגירה צלחות ב 25 ° C במשך 5 ימים.</li>
		<li>הצג לוחות מתחת למיקרוסקופ מורכב לזיהוי מורפולוגי מסורתי ב 4 ימים לאחר הבידוד.</li>
	</ol></li>
</ol>2. קביעת מגבלת הגילוי של ריכוז zoospore
<ol><li>ביצוע השעיית zoospore<ol>
<li>דגירה P. capsici על V8 agar (100 מ"ל של מיץ V8, 900 מ"ל של ddH2O, 1 גרם של CaCO3)צלחות במשך שבוע אחד ב 26 ° C. ניתן להשתמש במספר צלחות כדי לקבל כמות גדולה יותר של השעיית zoospore.</li>
		<li>דגירה את הצלחות תחת אור רציף בטמפרטורת החדר במשך 3 ימים כדי לעורר אידוי.</li>
		<li>להציף את הצלחות על ידי הוספת 15 מ"ל של ddH2O לכל צלחת ולמקם אותם במקרר 4 מעלות C במשך 25 דקות. לאחר מכן לחזור לטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.</li>
		<li>להרגיז צלחות כדי לנתק zoospores ופיפטה הפתרון לתוך צינור יחיד 50 מ"ל מכל הצלחות.</li>
		<li>כדי לקבל הערכה מדויקת של ריכוז zoospore, להוסיף 10 μL של מתלה נבג על מד המוסיטומטר ולהתבונן תחת מיקרוסקופ לספור zoospores ולהעריך את הריכוז הממוצע.</li>
	</ol></li>
	<li>דילול טורי<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של מתלה נבוב ו 9 מ"ל של ddH2O לצינור נפרד. חזור על שלב זה עבור דילולים רבים פי 10 ככל הרצוי.</li>
		<li>לאחר מכן, פתרונות נסורים לחילוץ DNA בהתבסס על הפרוטוקול הקודם באמצעות שיטת הסינון. הערה: אם נפח גדול יותר של מתלים רצוי, להכפיל את עוצמת הקול: 2 מ"ל של מתלה נבוב ו 18 מ"ל של ddH2O.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי מגבלת ריכוז זואספר<ol>
<li>להעריך את מגבלת זיהוי נבוב על ידי הפעלת כל דילול סדרתי בנפרד דרך ההסחה עד תוצאות חיוביות ברורות כבר לא נצפו. לאחר השגת דילול הסופי, לדלל על ידי גורם של 2 (4.8 כדי 2.4 בדוגמה זו) ולהפעיל את ההסמעה שוב כדי לקבל מגבלת זיהוי מדויקת יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>פיתוח ואופטימיזציה של שיטת LAMP הערה: פריימרים LAMP תוכננו בהתבסס על 1121 בסיס זוג (bp) קטע של P. capsici (Li et al.19) כפי שמפורט באות משלימה 2.<ol>
<li>אם צבע צבע (למשל, Warmstart) משמש, השתמש בפתרון הבא: 2.5 μL של תערובת פריימר, 12.5 μL של צבע צבע, 0.5 μL של צבע פלורסנט ירוק, 1 μL של DNA שחולצו, ו 8.5 μL של ddH2O. הנפח הכולל הוא 25 μL.</li>
		<li>בעת שימוש במכשיר ההגדלה הנייד עם LAVALAMP mastermix, יש שלב ראשוני של 95 °C במשך 3 דקות כפי שהומלץ על ידי היצרן, אך הדבר אינו נדרש. שלב חיור סופי אינו נדרש כדי לבחון את שינוי הצבע או גרף ההגדלה. אין להפעיל שלב התחלה חמה אם יש להשתמש בצבע המסחרי.</li>
		<li>הצג את תוצאות ה-LAMP assay באחת מהשיטות הבאות: הפעל דוגמאות על ג'ל agarose 1% או תצוגה באמצעות מכונת הדמיה UV עם עין או תצוגה בלתי במסך ההגבורה בזמן אמת של ג'יני III.</li>
		<li>מטב את הטמפרטורה של אחסון LAMP באמצעות מכשיר ההגדלה הנייד וניתח באמצעות גרף ההגדלה בזמן אמת עבור מהירות ורמה של רגישות. הפעל דגימות עם טמפרטורות ייחודיות כדי לקבוע את ההגדלה המהירה ביותר עם רמת הרגישות הגבוהה ביותר.</li>
		<li>לקבוע את מגבלת הזיהוי של המנורה שפותחה על ידי ביצוע דילול סדרתי של DNA שחולץ (כמו עם מתלה נבוב בשלב 2.2.1) ושמירה על תנאי תגובה כפי שתואר קודם לכן עבור תגובת LAMP עבור כל דילול.</li>
	</ol></li>
	<li>קביעת מגבלת זיהוי והשוואה עם שיטת PCR רגילה<ol>
<li>השתמש ב-DNA שחולץ בשלבים בסעיף 1.3 כדי להשוות את רמת הזיהוי של PCR קונבנציונלי עם זה של אביזר LAMP.</li>
		<li>להוסיף 1 μL של DNA לצינור PCR שהכיל 1 μL של פריימרים PCR קדימה והפוך(טבלה 2),12.5 μL של PcR מאסטרמיקס ירוק, ו 9.5 μL של ddH2O עבור סך של 25 μL.</li>
		<li>הגבירו דגימות במחזור תרמי בתנאים הבאים: 94°C למשך 5 דקות, 30 מחזורים של denaturation ב- 94 °C ל- 30 שניות, שינועים ב- 54 °C למשך 30 שניות, הארכה ב- 72 °C למשך דקה אחת והארכה סופית ב- 72 °C למשך 10 דקות.</li>
		<li>הפעל דגימות במכונת אלקטרופורזה על ג'ל agarose 1% וצפה על מכונת הדמיית UV. גודל הלהקה למעט היה 508 bp.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+pathogens+in+irrigation+water%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li>
<li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+Genetics%2C+Morphology%2C+%26+Microorganisms%2C+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Basic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li>
<li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li>
<li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li>
<li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops%3A+research+progress+and+management+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li>
<li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li>
<li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Reporter%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li>
<li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li>
<li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Water+Management%22%5BJournal%5D)">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues%2C+soil+and+water%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li>
<li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li>
<li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Commputers+and+Electronics+in+Agriculture%22%5BJournal%5D)">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li>
<li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+%28West+Bank+of+Jordan%29%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathologia+Mediterranea%22%5BJournal%5D)">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li>
<li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora%2C+Pythium%2C+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655(1990).</li>
<li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses%3A+their+detection+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Irrigation+Science%22%5BJournal%5D)">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li>
<li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li>
<li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22CAB+Reviews+Perspectives+in+Agriculture+Veterinary+Science+Nutrition+and+Natural+Resources%22%5BJournal%5D)">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li>
<li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Horticultural+Science%22%5BJournal%5D)">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li>
<li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li>
<li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089(2018).</li>
<li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples%3A+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li>
<li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903(2019).</li>
<li>Böhm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+PCR%3A+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li>
<li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li>
<li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li>
<li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li>
<li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification%3A+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50(2019).</li>
<li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis%5BTitle%5D)+AND+%22Horticultural+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li>
<li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Reporter%22%5BJournal%5D)">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף או ניגודי עניינים.

הבדיקה של מי השקיה עבור phytopathogens הוא צעד מכריע עבור מגדלים באמצעות בריכות השקיה ומים ממוחזרים27. בריכות השקיה מספקות מאגר וקרקע פורייה עבור מספר פיטופטוגנים כמו מי השקיה עודפים מופנה מהשדה אל הבריכה נושאת איתו כל פתוגנים שאולי היהנוכח 16,27. השיטה המסורתית לזיהוי פתוגנים צמח במקור מים גדול היא להגדיר פיתיון לפתוגן באמצעות רקמת מארח רגיש (למשל, פרי, עלים) תלוי בבריכה ולחכות זיהום להתרחש, לאחר מכן להסיר את הפרי / עלים ולאשר את האבחנה ע...

מיחזור מים בחוות ובפעוטונים הופך פופולרי יותר ויותר בשל העלייה בעלויות המים וחששות סביבתיים מאחורי השימוש במים. שיטות השקיה רבות פותחו עבור מגדלים כדי להפחית את ההתפשטות וההתרחשות של מחלת הצמח. ללא קשר למקור המים (השקיה או משקעים), ההתנקזות נוצרת, ומגדלי ירקות ופעוטונים רבים יש בריכה לאסוף ולמחזר runoff1. זה יוצר מאגר להצטברות פתוגן אפשרית לטובת התפשטות פתוגנים כאשר המים הממוחזרים משמשים להשקיהיבולים 2,,3,,4. פתוגנים צמחיים Oomycete במיוחד ליהנות מנהג זה כמו zoospores יצטברו במים נבגים פיזור העיקרי הוא מוטיב עצמי, אבל דורש מים פניהשטח 5,6,7. Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete המשפיע על מספר משמעותי של גידולי solanaceous ו cucurbit בדרכים שונות8. לעתים קרובות, הסימפטומים הם שיכוך-off של שתילים, שורש וכתר ריקבון; עם זאת, בגידולים כגון מלפפון, סקווש, מלון, דלעת, אבטיח, חצילים ופלפל, יבולים שלמים עלולים ללכת לאיבוד עקב ריקבון פירות9. למרות שיש שיטות ידועות של זיהוי פתוגן צמח זה, רוב דורשים זיהום כבר התרחש וזה מאוחר מדי עבור כל פטריות מונעות יש השפעה משמעותית10.
השיטה המסורתית כדי לבדוק מי השקיה לזיהוי ואבחן של מיקרואורגניזמים ממוקדים היא גישה מיושנת כאשר מהירות ורגישות הם קריטיים להצלחה וייצור יבולרווחי 11,12. רקמת הצמח רגישה לפתוגן ממוקד (למשל, חציל עבור P. capsici)מחובר למלכודת שונה כי הוא מושעה בבריכה השקיה לתקופה ממושכת לפני שהוסר ונבדק לזיהום. דגימות מרקמות הצמח מצופה לאחר מכן על מדיה סלקטיבית למחצה (PARPH) ודגירה לצמיחת תרבות, אז זיהוי מורפולוגי מתבצע באמצעות מיקרוסקופמורכב 13. ישנן שיטות זיהוי דומות אחרות עבור פתוגנים צמחיים אחרים באמצעות מדיה סלקטיבית ציפוי כמויות קטנות של מים מזוהמים לפני תת culturing14,15. שיטות אלה דורשות בין 2 ל 6 שבועות, מספר סיבובים של תת-culturing כדי לבודד את האורגניזם, וניסיון על אבחון Phytophthora כדי להיות מסוגל לזהות את התווים המורפולוגיים העיקריים של כל מין. שיטות מסורתיות אלה אינן פועלות היטב לזיהוי מי השקיה מזוהמים על ידי P. capsici בשל גורמים כגון הפרעה על ידי מיקרואורגניזמים אחרים כי הם גם נוכחים במקורות המים. כמה מיקרואורגניזמים הגדלים במהירות כמו Pythium spp. וחיידקים הנישאות במים יכולים לגדול יתר על המידה על הצלחת מה שהופך P. capsici בלתי ניתן לגילוי16,17.
מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה מולקולרית רגישה וספציפית שניתן להשתמש בה הן בהגדרות שדה והן במעבדה כדי לזהות גני חיות P. capsici במים השקיה. הפרוטוקול כולל פיתוח של פריימר איזותרמי (LAMP) חדשני בתיווך לולאה (LAMP) מסוגל להגביר באופן ספציפי P. capsici, בהתבסס על 1121 בסיס זוג (bp) קטע של P. capsici18,19. פריימר LAMP שפותח בעבר מתוך דונג ואח '. (2015) שימש בהשוואה ל- assay שפותחה עבור מחקר זה20.
אביזר ה-LAMP הוא צורה חדשה יחסית של זיהוי מולקולרי שהוכח להיות מהיר יותר, רגיש, וספציפי יותר מאשר תגובת שרשרת פולימראז קונבנציונלית (PCR)21. באופן כללי, מחשבים קונבנציונליים PCR אין אפשרות לזהות תחת 500 עותקים (1.25 pg/μL); לעומת זאת, מחקרים קודמים הראו כי הרגישות של LAMP יכול להיות 10 עד 1,000 פעמים גבוה יותר מאשר PCR קונבנציונלי והוא יכול בקלות לזהות אפילו 1 fg / μL של DNAגנומי 22,23. בנוסף, ניתן לבצע את ההתאסה במהירות (לעתים קרובות ב-30 דקות) ובאתר (בשטח) באמצעות בלוק חימום נייד להגדלה וצבע צבעוני שמשנה צבע לדוגמה חיובית (הסרת הצורך באלקטרופורזה). במחקר זה, השווינו את הרגישות של PCR ו- LAMP assays באמצעות שיטת חילוץ מסנן. שיטת הזיהוי המוצעת מאפשרת לחוקרים ולסוכני הרחבה לזהות בקלות את נוכחותם של נבגים מסוג P. capsici ממקורות מים שונים בתוך פחות משעתיים. ההסתה הוכחה כרגישה יותר מאשר PCR קונבנציונלי, אומתה ב- situ על ידי זיהוי הנוכחות של הפתוגן במים השקיה בשימוש על ידי מגדל. שיטת איתור זו תאפשר למגדלים להעריך את הנוכחות וצפיפות האוכלוסין של הפתוגן במקורות מים שונים המשמשים להשקיה, מניעת התפרצויות הרסניות והפסדים כלכליים.

<table><tbody><tr><td>אבקת ג'ל אגרוז</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>C997J85</td><td></td></tr><tr><td>בוכנר משפך</td><td>Southern Labware</td><td>JBF003</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620509</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>CTAB פתרון</td><td>Biosciences</td><td>786-565</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק סינון</td><td>United</td><td>FHFL1000</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>United Scientific Supplies</td><td>FPR009</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל ירוק 10000X</td><td>תומאס Scientific</td><td>B003B68 (1/EA)</td><td></td></tr> <tr><td>Genie III</td><td>OptiGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבת יד</td><td>תומאס Scientific</td><td>1163B06</td><td></td></tr><tr><td>איזו-אמיל אלכוהול</td><td>פישר Scientific</td><td>BP1150-500</td><td></td></tr><tr><td>LAVA LAMP מאסטר מיקס</td><td>Lucigen</td><td>30086-1</td><td></td></tr><tr><td>מיצוי DNA חרוז מגנטי</td><td>Genesig</td><td>genesigEASY-EK</td> מפריד מגנטי Genesig genesigEASY-MR <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyvinylpyrrolidone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PVP40-500G</td><td></td></tr><tr><td>פריימרים</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism מיני צנטריפוגה</td><td>Labnet</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>UV Gel</td><td>Doc Analytik Jena</td><td>849-00502-2</td><td></td></tr><tr><td>Warmstart Colorimetric Dye</td><td>Lucigen</td><td>E1800m</td><td></td></tr><tr><td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1704489EDU</td><td></td></tr><tr><td>70% איזופרופנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A451-1</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי של phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici הוא פתוגן oomycete הרסני המשפיע על גידולים solanaceous ו cucurbit חשובים רבים גרימת הפסדים כלכליים משמעותיים בייצור ירקות מדי שנה. Phytophthora capsici הוא קרקע נישאת ובעיה מתמשכת בשדות ירקות בשל מבני ההישרדות ארוכת החיים שלה (oospores ו כלמידוספורים) המתנגדים לבליה והשפלה. שיטת הפיזור העיקרית היא באמצעות ייצור של zoospores, שהם חד-תאי, נבגים מנוקבים שיכולים לשחות דרך סרטים דקים של מים הנוכחים על משטחים או נקבוביות אדמה מלאות מים יכול להצטבר בשלוליות ובריכות. לכן, בריכות השקיה יכול להיות מקור של פתוגן ונקודות ראשוניות של התפרצויות מחלה. זיהוי של P. capsici במים השקיה קשה באמצעות שיטות מסורתיות מבוססות תרבות כי מיקרואורגניזמים אחרים נוכחים בסביבה, כגון Pythium spp., בדרך כלל overgrow P. capsici מה שהופך אותו בלתי ניתן לגילוי. כדי לקבוע את הנוכחות של נבגים P. capsici במקורות מים (מי השקיה, runoff, וכו '), פיתחנו עבודת נייר מסנן מבוססת משאבת יד (8-10 μm) שיטה הלוכדת נבגים של הפתוגן (zoospores) ומאוחר יותר משמש כדי להגביר את ה-DNA של הפתוגן באמצעות לולאה רומן מתווכת תוגרה (LAMP) essay שנועדה להגבר ספציפי של P capsici. שיטה זו יכולה להגביר ולזהות DNA מריכוז נמוך כמו 1.2 x 102 zoospores / מ"ל, שהוא 40 פעמים רגיש יותר מאשר PCR קונבנציונלי. לא הושגה ההגדלה צולבת בעת בדיקת מינים קרובים. LAMP בוצעה גם באמצעות צבע LAMP מאסטר לערבב צבע צבע, הצגת תוצאות כי ניתן לקרוא בעין בלתי לזיהוי מהיר באתר. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם פתוגנים אחרים השוכן, לצבור, או מפוזרים באמצעות מערכות השקיה מזוהמות.

אופטימיזציה של שיטת LAMP במחקר זה, זיהינו את הנוכחות של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה ניידת מתווכת גברה isothermal (LAMP) assay. ראשית, תסוואי LAMP המוצע היה אופטימיזציה על ידי בדיקת ריכוזי פריימר LAMP שונים [F3, B3 (0.1–0.5 μM כל אחד); LF, LB (0.5–1.0 μM כל אחד) ו- FIP, BIP (0.8–2.4 μM כל אחד)], משכים (30-70 דקות) וטמפרטורות (55-70 °C). תמהיל פריימר LAMP הסופי בשימוש במחקר זה היה: 0.2 μM של כל פריימר F3 ו B3, 0.8 μM של כל פריימר Loop-F ולולאה-B, 1.6 μM של כל פריימר FIP ו BIP....

פיתחנו שיטה לזיהוי zoospores capsici Phytophthora במקורות מים באמצעות שיטת הפקת DNA נייר מסנן יחד עם לולאה בתיווך isothermal תוגבר (LAMP) essay שניתן לנתח בתחום או במעבדה.

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

זיהוי פיטופתוגן הוא צעד מכריע בניהול מחלות צמחים. פרוטוקול זה מספק שיטת זיהוי מהירה לזיהום מי השקיה עקב פתוגן לוחם נפוץ המועבר במים. באמצעות טכניקה זו, פתוגן ספציפי, כגון Phytophthora capcici, ניתן לעבד ולזהות במהירות מהנפח הגדול שלנו של מי השקיה תוך שמירה על האתר.הדגמת ההליך יהיה אוון הדסון, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, ו Sumyya Waliullah, חוקר PostDoctoral מהמעבדה של ד"ר Pingxi G להקים משאבה ומסנן עבור באתר Phytophthora capcici זיהוי מי השקיה. חבר בקבוק סינון לצינור המחובר למשאבת יד והתאים משפך בוכנר לתוך פקק הגומי בפה של בקבוק הסינון. לאחר מכן התאם פיסת נייר סינון בגודל מתאים עם גודל שימור של 15 מיקרון לתוך המשפך.כדי להשיג דגימות מים לאסוף מי השקיה מהמקור היעד. המים עשויים להיות כמויות קטנות של פסולת, אבל לא מעים משמעותיים או אדמה. יוצקים לאט בין 50 ל -1000 מיליליטר של מי בדיקה על נייר המסנן בתוך המשפך תוך שימוש במשאבת היד כדי ליצור יניקה כדי למשוך את המים דרך המשפך.כאשר כל המים מסוננים, השתמש במדפים כדי להסיר את נייר הסינון מהמשפך. ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את הנייר לחתיכות קטנות. טביעה שמונה עד 12 חתיכות נייר ב 400 microliters של חיץ החילוץ בצינור 1.5 מיליליטר עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר.מערבולת או להתסיס את הנייר בדרך אחרת במשך 10 שניות פעם בדקה. בסוף הדגירה, השתמש במדפים כדי להסיר את הנייר עם חיץ קטן ככל האפשר. ולחזור על הרישיון עם הסט הבא של חתיכות נייר מסנן.עבור מיצוי DNA מדגימות נייר המסנן הוסיף 20 microliters של proteinase K ו 10 microliters של 10 ננוגרם לכל RNAs microliter לדגימה מדי דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות עם מערבולת או רועד כל שלוש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים במאגר מחייב לדגימה ומערבבים היטב על ידי טלטול. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הצינור ואת מתלה המפריד המגנטי במשך שתי דקות לפני הסרת והשליכת העל-טבעי.מוציאים את הצינור מהמפריד המגנטי ומשעה מחדש במרץ את חרוזים ב 500 microliters של חיץ לשטוף. לאחר 30 שניות להחזיר את הצינור למגנט ולחכות שתי דקות לפני השלכת supernatant. חזור על הכביסה עם 500 microliters של חיץ לשטוף מדי 500 microliters של 80% אתנול כפי שהוכח רק.ואוויר להניע את גלולת חרוז מגנטי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה מחדש להשעות את חרוזים ב 50 microliters של חיץ אלוט עם צינורות במשך דקה אחת לפני הצבת הצינור בחזרה על המגנט במשך שתי דקות כדי לאפשר איסוף של supernatant. לאחר הכנת תערובת פריימר LAMP כפי שצוין בטבלה, להוסיף ב 2.5 microliters של פרימר לערבב 12.5 microliters של מאסטרמיקס LAMP לבה אחד microliter של DNA שחולצו ותשעה microliters של מים מזוקקים כפולים לצינור PCR ולהגדיר שליטה חיובית אחת שלילית אחת.הדגירה כל הדגימות בבלוג חום 64 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות או מכשיר הגברה ג'יני שלוש בסוף הדגירה, עומס של חמישה microliters של כל דגימה מוגברת על 1% agarose ג'ל תמונה הרצועות וכתוצאה מכך על מכונת הדמיה אולטרה סגולה. אם נעשה שימוש בצבע קלורימטרי, הצג את שינוי הצבע כדי לקבוע את התוצאות כחיוביות או שליליות. אם נעשה שימוש בכלי הגברה נייד, הצג את גרף ההגברה על המסך כדי לקבוע את התוצאות.הזמן האופטי להפעלת מישן LAMP ב 64 מעלות הוא 45 דקות, כמו הריכוזים הנמוכים ביותר שהיו חיוביים לגילוי אינם מוגברים עד 40 דקות, בעוד ריכוזים גבוהים יותר מוגברים ב 20 דקות. הגברה ניתן לאשר על 1% ג'ל agarose שכותרתו עם כתם חומצה גרעינית. כפי שמודגם PCR קונבנציונלי הוא 40 פעמים פחות רגיש מאשר LAMP.גילוי 4.8 פעמים 10 לגני החיות השלישיים לריכוזים מיליליטר בנמוך ביותר. בניתוח זה נאספו דגימות מים משבע בריכות המשמשות לייצור ירקות מסחרי במחוז טיפט, ג'ורג'יה. שלושה מהם הפגינו תוצאות חיוביות של LAMP.כאשר הדגימות נבדקו על ידי PCR קונבנציונלי עם זאת, zoospores זוהו רק באחת משלוש דגימות חיוביות. בטבלה זו, ההבדלים בין שיטות זיהוי באמצעות משתנים כגון רגישות, זמן, הכנה נדרשת, חומרים ועלות מסוכמים. LAMP היא השיטה הזולה ביותר מבין השיטות שנבדקו, והיא גם המהירה ביותר, הדורשת רק 30 עד 60 דקות להגברה בהשוואה להגברת PCR קונבנציונלית.באמצעות פרוטוקול זה DNA שחולצו פתוגנים הקשורים קשר הדוק UMI זרעי תוצאות אין זיהוי עבור כל הדגימות, המאשר את הספציפיות של פריימרים. הקפד לא לשפוך את המים מדגם מהר מדי להיזהר בעת הוספת DNA שחולצו צינורות LAMP כדי להגביל את הזיהום. לאחר שפותחו פתוגנים אחרים המועברים במים, ניתן להתאים את שיטות הסינון וחומצת המנורה לפתוגנים אחרים.

detection-phytophthora-capsici-irrigation-water-using-loop-mediated

Research

JoVE Journal

Environment

סביבה

מקור: דומסל, ק. ג'. ואחרים. הגברה איזותרמית מתווכת לולאה לסינון סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבית.  J. Vis. Exp. (2020).סרטון זה מדגים את טכניקת ההגברה האיזותרמית המתווכת בלולאה (LAMP) לזיהוי גן חיידקי מטרה על ידי הגברת DNA בטמפרטורה קבועה. תערובת התגובה מוכנה על ידי הוספת תערובת מאסטר איזותרמית, פריימרים ספציפיים לגן היעד, ודגימות המכילות תבניות DNA. ההגברה מתחילה במכשיר LAMP ומפוטרת פלואורסצנציה בזמן אמת כדי לאשר את נוכחות הגן היעד.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה לזיהוי גנים חיידקיים

Assay qPCR פותח לצורך זיהוי של O157 החיידקים Escherichia: H7 מיקוד סמן גנטי ייחודי, Z3276. QPCR היה בשילוב עם טיפול monoazide propidium (PMA) לגילוי תא חי. פרוטוקול זה כבר שונה ומותאם לפורמט צלחת 96 היטב לטיפול קל ועקבי של דגימות רבות...

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

פרוטוקול הכולל ריכוז משולב, העשרה וזיהוי קולורימטרי של נקודת קצה של פתוגנים הנישאים במזון בכמויות גדולות של מים חקלאיים מוצג כאן.  המים מסוננים באמצעות Modified Moore Swabs (MMS), מועשרים במדיה סלקטיבית או לא סלקטיבית, והזיהוי מתבצע באמצעות התקנים אנליטיים מבוססי נייר (μPAD) המשובצים במצעים קולורימטריים אינדיקטיביים חיידקיים.

מבוסס נייר Colorimetric איתור של<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt;,<em&gt; סלמונלה</em&gt; Spp., ו<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; מכמויות גדולות של מים לחקלאות

האבחנה של זיהום איימריה בתרנגולות נותרה תובענית. גישות המובלות על ידי מורפולוגיה של טפילים ופתולוגיה של מארח אינן חד משמעיות בדרך כלל, בעוד שגישות מולקולריות המבוססות על PCR הוכיחו את עצמן כתובעניות מבחינת עלות ומומחיות. מטרת פרוטוקול זה היא לבסס הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) כאבחון מולקולרי פשוט לזיהום איימרי.

Isothermal הגברה מבחני בתיווך לולאה (LAMP) לאיתור המינים ספציפי של<em&gt; Eimeria</em&gt; כי להדביק תרנגולות

זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים באתר, במיוחד קרקע בתפו פתוגנים צמח, הוא חיוני כדי למנוע התפשטות של מחלות בתחום עיצוב והפקת inoculum. השיטה שפותחה כאן באמצעות מערכת זיהוי PCR נייד בזמן אמת מאפשר האבחון באתר בתנאי שדה.

זיהוי מולקולרי באתר של קרקע בתפו Phytopathogens באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת

אנו מציגים שיטת RT-מנורה לגילוי של TiLV בדגים אמנון באמצעות כלים פשוטים על פני תקופה קצרה יחסית של זמן לעומת טכניקות RT-PCR קונבנציונאלי. פרוטוקול זה עשוי לעזור לשלוט על התפשטות המגיפה של TiLVD, במיוחד במדינות מתפתחות.

הפוך תמלול לולאה בתיווך איזותרמי הגברה (RT-מנורה) שיטת הזיהוי הספציפי והמהיר של וירוס אמנון לייק

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP) היא מבחן הגברה של חומצת גרעין (iNAAT) אשר משך עניין נרחב בתחום זיהוי הפתוגן. כאן, אנו מציגים פרוטוקולסלמונלה LAMP מרובה מעבדות כשיטה מהירה, אמינה וחזקה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ולאימות סלמונלה חזקה מבידוד תרבותי.

הגברה איזותרמית בתיווך לולאה להקרנת סלמונלה במזון לבעלי חיים ואישור סלמונלה מבידוד תרבות

הצמדת הראש הבסיסי של צמח הפלפל השחור היא שיטה קצרה וחסכונית בזמן כדי לפגוע בו. כאן סיפקנו שלבים מפורטים עם סרטון להדבקת צמחי פלפל שחור.

שיטת חיסון יעילה עבור Phytophthora capsici על צמחי פלפל שחור

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבנות מערכת שרשרת זרימה רציפה פולימראז המבוססת על שבב מיקרופלואידי וכיצד לבנות מערכת אלקטרופורזה נימית במעבדה. הוא מציג שיטה פשוטה לניתוח חומצות גרעין במעבדה.

הגברה של Escherichia coli בשבב מיקרופלואידי PCR בזרימה רציפה וגילויו באמצעות מערכת אלקטרופורזה נימית

פתוגנים חיידקיים שונים עלולים לגרום לזיהומים בדרכי הנשימה ולהוביל לבעיות בריאותיות חמורות אם לא מזהים אותם במדויק ומטפלים בהם מיד. זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים אלה באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה מספק ניהול ובקרה יעילים של זיהומים בדרכי הנשימה בסביבות קליניות.

זיהוי מהיר של פתוגנים חיידקיים הגורמים לזיהומים בדרכי הנשימה התחתונות באמצעות הגברה איזותרמית בתיווך לולאה בתיווך שבב מיקרופלואידי

בפרוטוקול זה, מבחן CRISPR/Cas12a משולב להגברת פולימראז רקומבינאז מודגם לזיהוי הפתוגן הצמחי הפולש, Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical race 4.

בדיקת הגברה משולבת של פולימראז רקומבינאז CRISPR/Cas12a לאיתור Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

למד זיהוי מהיר של Phytophthora capsici במי השקיה באמצעות שיטת LAMP וסינון נייר. שיטה שטחית זו מאפשרת ניתוח מיידי לניהול מחלות צמחים יעיל ומונעת הפסדים חקלאיים משמעותיים.

זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

גלה סרטונים נוספים