זיהוי של Phytophthora capsici במים השקיה באמצעות לולאה בתיווך איזותרמית

זיהוי פיטופתוגן הוא צעד מכריע בניהול מחלות צמחים. פרוטוקול זה מספק שיטת זיהוי מהירה לזיהום מי השקיה עקב פתוגן לוחם נפוץ המועבר במים. באמצעות טכניקה זו, פתוגן ספציפי, כגון Phytophthora capcici, ניתן לעבד ולזהות במהירות מהנפח הגדול שלנו של מי השקיה תוך שמירה על האתר.

הדגמת ההליך יהיה אוון הדסון, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי, ו Sumyya Waliullah, חוקר PostDoctoral מהמעבדה של ד"ר Pingxi G להקים משאבה ומסנן עבור באתר Phytophthora capcici זיהוי מי השקיה. חבר בקבוק סינון לצינור המחובר למשאבת יד והתאים משפך בוכנר לתוך פקק הגומי בפה של בקבוק הסינון. לאחר מכן התאם פיסת נייר סינון בגודל מתאים עם גודל שימור של 15 מיקרון לתוך המשפך.

כדי להשיג דגימות מים לאסוף מי השקיה מהמקור היעד. המים עשויים להיות כמויות קטנות של פסולת, אבל לא מעים משמעותיים או אדמה. יוצקים לאט בין 50 ל -1000 מיליליטר של מי בדיקה על נייר המסנן בתוך המשפך תוך שימוש במשאבת היד כדי ליצור יניקה כדי למשוך את המים דרך המשפך.

כאשר כל המים מסוננים, השתמש במדפים כדי להסיר את נייר הסינון מהמשפך. ולהשתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך את הנייר לחתיכות קטנות. טביעה שמונה עד 12 חתיכות נייר ב 400 microliters של חיץ החילוץ בצינור 1.5 מיליליטר עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר.

מערבולת או להתסיס את הנייר בדרך אחרת במשך 10 שניות פעם בדקה. בסוף הדגירה, השתמש במדפים כדי להסיר את הנייר עם חיץ קטן ככל האפשר. ולחזור על הרישיון עם הסט הבא של חתיכות נייר מסנן.

עבור מיצוי DNA מדגימות נייר המסנן הוסיף 20 microliters של proteinase K ו 10 microliters של 10 ננוגרם לכל RNAs microliter לדגימה מדי דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות עם מערבולת או רועד כל שלוש דקות. בסוף הדגירה, מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים במאגר מחייב לדגימה ומערבבים היטב על ידי טלטול. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הצינור ואת מתלה המפריד המגנטי במשך שתי דקות לפני הסרת והשליכת העל-טבעי.

מוציאים את הצינור מהמפריד המגנטי ומשעה מחדש במרץ את חרוזים ב 500 microliters של חיץ לשטוף. לאחר 30 שניות להחזיר את הצינור למגנט ולחכות שתי דקות לפני השלכת supernatant. חזור על הכביסה עם 500 microliters של חיץ לשטוף מדי 500 microliters של 80% אתנול כפי שהוכח רק.

ואוויר להניע את גלולת חרוז מגנטי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה מחדש להשעות את חרוזים ב 50 microliters של חיץ אלוט עם צינורות במשך דקה אחת לפני הצבת הצינור בחזרה על המגנט במשך שתי דקות כדי לאפשר איסוף של supernatant. לאחר הכנת תערובת פריימר LAMP כפי שצוין בטבלה, להוסיף ב 2.5 microliters של פרימר לערבב 12.5 microliters של מאסטרמיקס LAMP לבה אחד microliter של DNA שחולצו ותשעה microliters של מים מזוקקים כפולים לצינור PCR ולהגדיר שליטה חיובית אחת שלילית אחת.

הדגירה כל הדגימות בבלוג חום 64 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות או מכשיר הגברה ג'יני שלוש בסוף הדגירה, עומס של חמישה microliters של כל דגימה מוגברת על 1% agarose ג'ל תמונה הרצועות וכתוצאה מכך על מכונת הדמיה אולטרה סגולה. אם נעשה שימוש בצבע קלורימטרי, הצג את שינוי הצבע כדי לקבוע את התוצאות כחיוביות או שליליות. אם נעשה שימוש בכלי הגברה נייד, הצג את גרף ההגברה על המסך כדי לקבוע את התוצאות.

הזמן האופטי להפעלת מישן LAMP ב 64 מעלות הוא 45 דקות, כמו הריכוזים הנמוכים ביותר שהיו חיוביים לגילוי אינם מוגברים עד 40 דקות, בעוד ריכוזים גבוהים יותר מוגברים ב 20 דקות. הגברה ניתן לאשר על 1% ג'ל agarose שכותרתו עם כתם חומצה גרעינית. כפי שמודגם PCR קונבנציונלי הוא 40 פעמים פחות רגיש מאשר LAMP.

גילוי 4.8 פעמים 10 לגני החיות השלישיים לריכוזים מיליליטר בנמוך ביותר. בניתוח זה נאספו דגימות מים משבע בריכות המשמשות לייצור ירקות מסחרי במחוז טיפט, ג'ורג'יה. שלושה מהם הפגינו תוצאות חיוביות של LAMP.

כאשר הדגימות נבדקו על ידי PCR קונבנציונלי עם זאת, zoospores זוהו רק באחת משלוש דגימות חיוביות. בטבלה זו, ההבדלים בין שיטות זיהוי באמצעות משתנים כגון רגישות, זמן, הכנה נדרשת, חומרים ועלות מסוכמים. LAMP היא השיטה הזולה ביותר מבין השיטות שנבדקו, והיא גם המהירה ביותר, הדורשת רק 30 עד 60 דקות להגברה בהשוואה להגברת PCR קונבנציונלית.

באמצעות פרוטוקול זה DNA שחולצו פתוגנים הקשורים קשר הדוק UMI זרעי תוצאות אין זיהוי עבור כל הדגימות, המאשר את הספציפיות של פריימרים. הקפד לא לשפוך את המים מדגם מהר מדי להיזהר בעת הוספת DNA שחולצו צינורות LAMP כדי להגביל את הזיהום. לאחר שפותחו פתוגנים אחרים המועברים במים, ניתן להתאים את שיטות הסינון וחומצת המנורה לפתוגנים אחרים.