כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי
9 בספטמבר 2020
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במבחנה Ca2+ שטף בנוירונים המוח האמצעי ואת ההשפעות שלהם במורד הזרם על caspase-3 באמצעות תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי. מודל זה יכול להיות מועסק כדי ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים הקשורים פעילות Ca2+ חריגה בנוירונים המוח האמצעי, ולסנן טיפולים רומן עבור תכונות אנטי אפופטוטיות.
פרוטוקול זה מכמת שטפי סידן בנוירונים דופאמין, אשר הולכים לאיבוד במחלת פרקינסון. זה שימושי להבנת איך סידן חריג גורם אובדן נוירון דופאמין במחלת פרקינסון. בפעם הראשונה, אנו מדגימים שטפי סידן ספונטניים בנוירונים ראשוניים מתורבתים.
שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח תרומות קולטן ספציפי מעורב אפופטוזיס מתווך סידן. השיטה שלנו מספקת שדרה למסכי תרופות בעלי תוכן גבוה כדי לגלות תרכובות נוירו-הגנה ספציפיות ויעילות למחלת פרקינסון. תרכובות נוירו-פרוטקטיביות אלה ימנעו אפופטוזיס מתווך סידן בנוירון דופאמין.
התחל בהכנת מיליליטר אחד של מדיום DMEM ללא סרום עם מיקרוליטר אחד של hSyn-GCaMP6f AAV למנה. שאפו את מדיום תרבות התאים מכל מנה והחליפו אותו במיליליטר אחד של ה- DMEM המוכן עם hSyn-GCaMP6f. מניחים את הכלים בחזרה לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר הדגירה, שאפו את המדיום עם AAVs והחלפו אותו בשלושה מיליליטר של מדיום תרבות התא. הדגירה את הכלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. שינוי המדיום כל יומיים עד שלושה ימים לאורך תקופה זו של זיהום ויראלי.
הכן ליטר אחד של מאגר ההקלטות HEPES, 200 מיליליטר של מאגר הקלטת גלוטמט מיקרומולר 20, ו 200 מיליליטר של 10 מאגר הקלטה micromolar NBQX על פי הוראות כתב היד. מלאו צלחת פטרי סטרילית של 35 מ"מ בשלושה מיליליטר של חיץ ההקלטה. קח את צלחת פטרי עם תרבויות נגועות מן החממה, ואז בזהירות לתפוס את הקצה של להחליק כיסוי אחד עם מטסות קצה בסדר ולהעביר אותו לתוך המנה עם חיץ ההקלטה.
מניחים את החלקת הכיסוי הנותרת במדיום בחזרה לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס ולהעביר את המנה עם חיץ הקלטה למיקרוסקופ confocal. הפעל את תוכנת ההדמיה. בעת האתחול, הפעל את המשאבה הראשונית והצב את הקו במאגר ההקלטה.
ואז לכייל את הזרימה לשני מיליליטר לדקה. מעבירים את החלקת הכיסוי הנגועה מצלחת פטרי לאמבט ההקלטה עם מדפים עדין. באמצעות המטרה טבילת מים 10X ואור שדה בהיר, למצוא את מישור המיקוד ולחפש אזור עם צפיפות גבוהה של גופי תא נוירון, ולאחר מכן לעבור למטרה 40X ולמקד מחדש את המדגם.
בחר והחל את AlexaFluor 488 בחלון הרשימה צבעים. על מנת למנוע תפוקת יתר והלבנת תמונות של הפלואורופורים, התחל עם הגדרות כוח HV ולייזר נמוכות. עבור ערוץ AlexaFluor 488, הגדר את ה- HV ל- 500, את הרווח ל- 1x ואת ההיסט לאפס.
הגדר את העוצמה ל- 5% עבור קו הלייזר 488. הגדל את גודל חור הסיכה ל- 300 מיקרומטרים ושתמש באפשרות הסריקה של המוקד x2 כדי להתאים באופן מיטבי אותות פליטה לרמות תת-תאורציה. לאחר מכן ניתן להתאים את ההגדרות לנראות אופטימלית של כל ערוץ.
לאחר אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ, הזיזו את הבמה לאיתור אזור עם תאים מרובים המציגים שינויים ספונטניים בנורסצנטיות GCaMP6f והתמקדו במישור הרצוי להדמיה. השתמש בכלי תיקון קליפ כדי לגזור את מסגרת ההדמיה לגודל שיכול להשיג מרווח מסגרת של קצת פחות משנייה אחת. הגדר את חלון המרווח לערך של 1.0 ואת החלון Num ל- 600.
כדי ללכוד סרט מסדרת T, בחר באפשרות שעה ולאחר מכן השתמש באפשרות סריקת Xyt כדי להתחיל בהדמיה. צפה בר התקדמות ההדמיה והזז את הקו ממאגר ההקלטות של HEPES למאגר ההקלטות של 20 מיקרומולאר גלוטמט בנקודת הזמן המתאימה. לאחר השלמת ההדמיה, בחר את לחצן סיום הסדרה ושמור את הסרט המוגמר של סדרת T.
המשך לבלבל את גלוטמט במשך חמש דקות נוספות, כך התרבות של נוירונים נחשפו גלוטמט במשך סך של 10 דקות. חזור על תהליך זה כדי שכל שובר כריכה ידמיין. ניתן לראות עקבות סידן וגופי תאים עצביים מיד לאחר הניסוי.
השתמש בכלי אליפסה כדי לצייר את המספר הרצוי של ROIs סביב soma עצבי. ולהשתמש בלחצן ניתוח סדרה כדי לדמיין את העקבות. לאחר החשיפה הנוספים של חמש דקות לגלוטמט, מוציאים את החלקת הכיסוי מהאמבטיה עם מדפים עדיפים וממקמינים אותה בחזרה לצלחת פטרי עם חיץ ההקלטה עד שכל ההדמיה הושלמה.
ביום ההדמיה, תרבות ה-VM טופלו עם גלוטמט או שילוב של גלוטמט ו- NBQX. בשני התנאים נצפו שינויים הטרוגניים וספונטניים בפלורזנס GCaMP6f המצביעים על שטפי סידן ספונטניים. יישום גלוטמט יצר תגובת סידן חזקה ומתמשכת הן בנוירונים פעילים באופן ספונטני והן בנוירונים הרהוי.
היישום של NBQX הפחית את הפעילות הספונטנית, וחסם חלקית את תגובת הגלוטמט. המידה שבה יישום גלוטמט עורר תגובת סידן בכל תנאי היה מכומת באמצעות האזור מתחת לעקומה, משרעת שיא, ו latency להגיב. ההשהיה לתגובה גדלה תחת מצב NBQX וגלוטמט.
כדי למדוד אפופטוזיס מתווך גלוטמט, התאים היו קבועים מוכתמים בנוגדן נגד קפסה-3. עוצמת הקספסה-3 הממוצעת הייתה גבוהה משמעותית בשני תנאי הטיפול בהשוואה לפקדים לא מטופלים. ניתוח יסודי יותר של מוות תאים רעילים נרגש יכול להיעשות על ידי ספירת מספר immunostain טירוסין הידרוקסילאז נוירונים דופאמין חיובי בשליטה ומצב גלוטמט מטופל.
טכניקה זו סללה את הדרך להבנת התרומות היחסיות של קולטנים שונים וערוצי ברזל המעורבים באפופטוזיס מתווך סידן בנוירון דופאמין.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למדידת זרמי סידן (Ca2+) in vitro בנוירונים של המוח האמצעי באמצעות תרביות ראשוניות של תאי מוח אמצעי מעכברים. המודל בוחן שינויים פתולוגיים הקשורים לפעילות סידן חריגה, במיוחד בהקשר של מחלת הפרקינסון, ומספק פלטפורמה לסריקת טיפולים נוירופרוטקטיביים פוטנציאליים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- נוירופרמקולוגיה
רקע
- זרימת סידן בנוירונים ממלאת תפקיד מכריע בתהליכים תאיים רבים.
- אובדן נוירונים דופמינרגיים הוא סימן היכר של מחלת הפרקינסון.
- המחקר בוחן כיצד רמות סידן לא תקינות משרות אפופטוזיס בנוירונים דופמינרגיים.
- יישום של גלוטמט ו-NBQX מסייע להעריך תגובות מתווכות סידן ואפקטים של הגנה נוירונלית.
מטרת המחקר
- למדידת זרמי סידן ספונטניים בתרביות ראשוניות של נוירונים מהמוח האמצעי.
- להבנת תרומתם של קולטנים למות תאים המתווך על ידי סידן.
- לסייע בסריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening) של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- נעשה שימוש בתרביתי תאים שהופקו מנוירונים ראשוניים של מוח בינוני של עכבר.
- דימוי סידן כלל שימוש ב-GCaMP6f לניטור שינויים בפלואורסצנציה.
- הליכים מרכזיים כללו הכנת מצע גידול והגשה של גלוטמט.
- דימוי תלוי-זמן בוצע תחת מיקרוסקופ עם הגדרות פרמטרים קפדניות.
- התאים טופלו בגלוטמט או בשילוב של גלוטמט ו-NBQX.
תוצאות עיקריות
- תגובות הסידן השתנו בהתאם לתנאי הטיפול, והראו שינויים ספונטניים וכן שינויים המושרים על ידי גלוטמט.
- פעילות Caspase-3 הייתה מוגברת באופן משמעותי בנוירונים שעברו טיפול, דבר המעיד על תהליכי אפופטוזיס.
- מתן NBQX הפחית את הפעילות הספונטנית ושינה את התגובות לגלוטמט.
- השיטה הדגימה פוטנציאל לניתוח תרומות ספציפיות של רצפטורים למות נוירונלי.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר בחינה מפורטת של אפופטוזה המתווכת על ידי סידן בנוירונים דופמינרגיים.
- הפרוטוקול משמש ככלי בעל ערך לסריקה של חומרים נוירו-פרוטקטיביים הרלוונטיים למחלת פרקינסון.
- הממצאים מספקים תובנות לגבי מנגנונים פתולוגיים ומטרות טיפוליות לניו روند נוירוני.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
פרוטוקול זה מאפשר כימות של זרמי סידן ספונטניים וזרמים המושרים על ידי גלוטמט בנוירונים ראשוניים מהמוח האמצעי של עכבר, ובכך מספק מערכת רלוונטית למחלה למודל של רעילות עיגור (excitotoxicity) של נוירונים דופמינרגיים במחלת פרקינסון. באמצעות קישור של דינמיקת הסידן להפעלת caspase-3, הפרוטוקול תומך בהפחתת סיכונים מכניסטית של תרכובות נוירו-פרוטקטיביות באמצעות מדדים תפקודיים של הישרדות נוירונלית. גישה זו מציעה רציפות תרגומית (translational continuity) משלב תיקוף המטרה ועד לסריקה פרה-קלינית, על ידי מתן אפשרות להערכה בעלת תוכן גבוה (high-content assessment) של השפעות תרופות על אפופטוזיס המתווך על ידי סידן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות בנוגע להזרמת סידן המתווכת על ידי קולטני גלוטמט באובדן נוירונים דופמינרגיים.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות על ידי מדידת זרימת סידן כקריאה קרובה (proximal readout) של פעילות הקולטן.
- ערך ניבוי: תומך בביטחון ניבוי על ידי קישור של מודולציית קולטנים לתוצאות אפופטוטיות במורד המסלול באמצעות הפעלת caspase-3.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק מדידות כמותיות בזמן אמת של שינויים בריכוז הסידן התוך-תאי כפלט של בדיקה תפקודית.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תנאי טיפול מוגדרים ב-glutamate וב-NBQX ופרמטרי דימות.
- מדרגיות: תומך בפורמט של סריקת תוכן גבוהה (high-content screening) באמצעות דימות חי ואנליזה אוטומטית של ROI של סומות נוירונליות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- סמן ביולוגי תרגומי: משתמש בהפעלה של caspase-3 כנקודת קצה מדידה של אפופטוזיס המושרה על ידי גלוטמט בנוירונים חיוביים ל-tyrosine hydroxylase.
- מודל פרה-קליני: מבסס מערכת רלוונטית למחלה באמצעות נוירונים ראשוניים מה-ventral mesencephalon כדי לדמה רעילות עיגור (excitotoxicity) הקשורה למחלת פרקינסון.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר תיעדוף של תרכובות על בסיס יכולתן לדכא זרימת סידן והפעלה של caspase-3 במסלול ההמשך.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, על ידי אספקת קריאה תפקודית של בריאות עצבית במודל הרלוונטי למחלת פרקינסון.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות לגבי תרומתם של קולטני גלוטמט לאפופטוזיס המתווך על ידי סידן בנוירונים דופמינרגיים.
- סריקה: מספקת מוכנות של הבדיקה באמצעות מדידות סטנדרטיות של זרימת סידן וזיהוי אפופטוזיס באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים כמותיים הכוללים שטח תחת העקומה, אמפליטודת שיא וזמן השהיה לתגובה עבור עקומות סידן, ומאפשרת ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הפרעה בוויסות הסידן לבין מוות תאי אפופטוטי בנוירונים דופמינרגיים, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים לנתיבים נוירודגנרטיביים.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובות נוירופרוטקטיביות במספר קמפיינים של סריקה המכוונים להומאוסטזיס של סידן.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד זרימת סידן כמניע מרכזי לאפופטוזיס של נוירונים דופמינרגיים.
- ערך תפעולי: מקדם שחזור באמצעות טרנסדוקציה ויראלית סטנדרטית, הכנת תמיסת דימוג (imaging buffer) והגדרות פרמטרים של מיקרוסקופ קונפוקאלי.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת ניסוי (go/no-go) על ידי אספקת ראיות תפקודיות מוקדמות למעורבות המטרה ולהגנה עצבית.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרכובות המפחיתות אפופטוזיס המתווך על ידי סידן בנוירונים הרלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות ראשוניות של נוירונים, טרנסדוקציה ויראלית והדמיית קונפוקלית של תאים חיים.
- תלוי במיכשור הכולל מיקרוסקופ קונפוקלי עם מערכת פרפוזיה ותוכנה לניתוח ROI.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תזמון החשיפה לגלוטמט, יישום משולב של NBQX ופרוטוקולי צביעה של caspase-3.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר ממודלים נוירונליים של עכברים למודלים אנושיים או להקשרי מחלה חלופיים.
- מוגבל עקב שונות ביעילות הטרנספקציה של נוירונים ראשוניים ובפעילות ספונטנית בבסיס בין דגימות שונות.
