מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

לאחר פיתוחו, מודל הרטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן הפך לשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים של מחלות רשתית ניאו-וסקולריות. הוא שימש כמודל לחקר אנגיוגנזה פתולוגית בתגובה להיפוקסיה. היתרון העיקרי של מודל זה הוא שהוא גורם לתגובה נוירו-וסקולרית חזקה הניתנת לשחזור וניתנת לכימות בקלות.

מודל זה יכול לשמש כמודל פרה-קליני לחקר ההשפעות של מועמדים טיפוליים אפשריים. הוא נחשב כמודל רלוונטי למספר מחלות אנושיות, כגון רטינופתיה של פגות, רטינופתיה סוכרתית וניוון מקולרי רטוב הקשור לגיל. רשום את משקל בעלי החיים לפני ואחרי אינדוקציה של היפוקסיה ובזמן ההקרבה.

וודאו שיש מספיק מזון בתחתית הכלוב והוסיפו סודה ליים עם מחוון צבע לתחתית החדר כדי לספוג עודף פחמן דו חמצני כאשר לא משתמשים במערכת סינון. עקוב אחר הלחות והטמפרטורה בתוך החדר, תוך שמירה על הלחות בין 40 ל -65% במידת הצורך, הגדל את לחות החדר על ידי הנחת כלים עם מים בתחתית. כייל את חיישן החמצן עם אוויר רגיל בחדר ו-100% חמצן.

לאחר מכן הכניסו את עכברי ה-P7 לתא והגדירו את רמת החמצן ל-75% החזיקו את העכברים בתא במשך חמישה ימים עד ל-P12, תוך ניטור החיות במהלך האינדוקציה. בסיום, הוציאו את העכברים מהתא. שקלו את החיות ועשו סימני זיהוי על הזנב או האוזן.

לאחר הרדמת בעל החיים, בצע צביטה בבוהן. רפלקס קטן מקובל. שמור את החיה על כרית חימום במהלך הטיפול.

השתמש במזרק זכוכית עם מחט בגודל 33 עד 34 להזרקת IVT. מרחו טיפת יוד, ואז לחצו על העפעף כלפי מטה ותפסו את גלגל העין בעזרת מלקחיים. בצע את ההזרקה אחורית ללימבוס, בערך בזווית של 45 מעלות המצביעה לכיוון עצב הראייה.

שמור את המחט במקומה למשך 30 שניות לאחר הזרקת התרופה כדי למנוע ריפלוקס של התמיסה המוזרקת. בדוק את העין לאיתור סיבוכים כגון שטפי דם או נזק לרשתית לאחר הסרת המחט. יש למרוח משחה אנטיביוטית על גבי העין לאחר ההזרקה.

אם תרצה, בצע הדמיה in vivo על בעלי חיים חיים במהלך תקופת המעקב כדי לתעד שינויים המתפתחים ברשתית במהלך התגובות האנגיוגניות. השתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום ספקטרלי כדי לדמיין שכבות רשתית in vivo. אסוף את עיני בעלי החיים על ידי חיתוך הרקמה סביב העין, אחיזה מאחורי גלגל העין בעזרת מלקחיים מעוקלים והרמת העין החוצה מהמסלול.

דגרו על גלגלי העיניים ב-4% פרפורמלדהיד מסונן טרי למשך שעה עד ארבע שעות. יש להסיר את הקיבוע ולשטוף את גלגלי העיניים שלוש פעמים עם PBS למשך 10 דקות בכל כביסה. נתח מיד את הרשתית או אחסן אותן ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס.

הכן תושבות שטוחות ברשתית כדי לכמת את כמות הניאו-וסקולריזציה ואת גודל אזורי כלי הדם או AVAs. נתח את הרשתית תחת מיקרוסקופ סטריאו בעזרת מספריים מיקרו ומלקחיים. הנח את גלגל העין ב-PBS כדי לשמור על לחות ונקב אותו בלימבוס עם מחט בגודל 23, ואז חתוך סביב הלימבוס עם מספריים מיקרו מעוקלים כדי להסיר את הקשתית והקרנית.

הנח בזהירות את קצה המספריים בין RPE לרשתית העצבית וחתוך את קומפלקס הכורואיד של RPE לכיוון עצב הראייה. עשו את אותו הדבר לצד השני של גלגל העין. לאחר מכן חתכו או קרעו בעדינות את הטישו עד שהגביעונית נחשפת.

משוך את העדשה החוצה מכוס הרשתית והוסף PBS לכוס. הסר את כל כלי הדם ההיאלואידיים, הזגוגית והפסולת מבלי לפגוע ברשתית. בצע ארבעה חתכים ברשתית בעזרת מספריים מיקרו ישרים ליצירת מבנה דמוי פרח.

השתמש במברשת צבע רכה או בפיפטה להעברה כדי להעביר אותה לצלחת באר לצביעה. סמן את כלי הדם ברשתית עם איזולקטין B4 אשר מכתים את פני השטח של תאי האנדותל. דגרו את הרשתית במאגר חוסם למשך שעה אחת ושטפו אותן עם 1% NGS ו-0.1% טריטון ב-TBS למשך 10 דקות.

דגרו על הרשתית עם 5 עד 10 מיקרוגרם למיליליטר צבע פלואורסצנטי מצומד איזולקטין B4 למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס כשהוא מוגן מאור. למחרת, שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם 1% NGS ו-0.1% טריטון ב-TBS למשך 10 דקות בכל שטיפה. הנח את הרשתית על מיקרוסקופ החלק את הרשתית הפנימית כלפי מעלה.

לאחר מכן פרשו בזהירות את הרשתית בעזרת מברשת צבע רכה והסירו את כל כלי ההיאלואיד או הפסולת שנותרו. הוסף אמצעי הרכבה על גבי המדגם והנח כיסוי על גבי השקופית. אחסן את הרשתית בארבע מעלות צלזיוס מוגנת מפני אור.

דמיין את התושבות השטוחות ברשתית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרה של פי 10. התמקדו במקלעת כלי הדם השטחית ובניאו-וסקולריזציה טרום רשתית. צור תמונת סריקת אריחים כדי ללכוד את כל הרשתית ולמזג את סריקות האריחים.

כמת את התמונות על ידי מדידת ה-AVAs, אזור הניאו-וסקולריזציה ושטח הרשתית הכולל באמצעות תוכנית עיבוד תמונה. צייר את ה-AVA ואת שטח הרשתית הכולל באמצעות כלי ציור ביד חופשית ובחר את האזורים הניאו-וסקולריים באמצעות כלי בחירה. במודל הרטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן בעכבר, מחיקת כלי הדם מתרחשת ברשתית המרכזית.

בעוד שבמודל החולדה, הוא מתפתח בפריפריה בדומה ל-ROP אנושי. ניאו-וסקולריזציה קדם-רשתית מתפתחת ליד אזורי כלי הדם, במיוחד הרשתית המרכזית בעכבר והפריפריה בחולדות. ניתוח היסטולוגי באמצעות חתכים או תושבות שטוחות יכול להיעשות כדי להעריך שינויים מורפולוגיים ברשתית OIR או נוכחות של סוגי תאים מעניינים, למשל, תאים דלקתיים.

לחלופין, ניתן לבצע הדמיה לא פולשנית in vivo במהלך תקופת המעקב של OIR. ניתן לדמיין כלי דם ברשתית ובהיאלואיד באמצעות אנגיוגרפיה פלואורסצאין וניתן להשתמש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום הספקטרלי כדי להעריך שינויים מבניים ברשתית. ניתן למדוד שינויים תפקודיים על ידי אלקטרורטינוגרפיה.

Aflibercept, מלכודת VEGF מסיסה, מעכבת רה-וסקולריזציה ניאו-וסקולרית ופיזיולוגית ב-OIR. לעיני OIR שהוזרקו ב-P14 במינון גבוה של אפליברספט היו AVAs ברשתית אפילו יותר מאשר עיניים שלא טופלו, מה שמרמז על כך שאפליברספט חוסם גם רה-וסקולריזציה פיזיולוגית של הרשתית המונעת על ידי היפוקסיה. כשאתה מנסה פרוטוקול זה, זכור לשקול מראש את גודל ההמלטה המתאים לניסוי שלך ולפקח על רווחת הסכרים והגורים בתא החמצן.

קחו בחשבון שעלייה במשקל לאחר הלידה משפיעה על התוצאה במודל. דגימות רשתית המתקבלות ממודל זה יכולות לשמש לשיטות אנליטיות, כגון אימונוהיסטוכימיה, ניתוח ביטוי גנים או חלבונים, ולמדידת ההשפעות של מועמדים טיפוליים פוטנציאליים על הרשתית ברמה המולקולרית.