Name: Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: חקור מורפוגנזה של קנדידה אלביקנים במערכת העיכול באמצעות שיטת ex vivo עם תמציות הומוגניזט מעיים וצביעת אימונופלואורסצנציה. שיטה זו חושפת את אותות הסביבה המווסתים מעברים מורפוגנטיים בחיידקים פתוגניים במעי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מכירים במשאבים ותמיכה ממכון מחקר הליבה התאית והמולקולרית של אוניברסיטת המערב התיכון.

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת המערב התיכון (IACUC) כמתוארלפני 57. ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת המערב התיכון אישרה מחקר זה תחת פרוטוקול MWU IACUC #2894. מדיניות הטיפול בבעלי חיים של MWU פועלת בהתאם למדיניות שירות הבריאות הציבורי (PHS) בנוגע לטיפול בבני אדם ולשימוש בבעלי חיים במעבדה ולמדיניות שנקבעה לחוק לרווחת בעלי חיים (AWA).
1. עכברים לומדים פרוטוקול סטנדרטי
<ol><li>השתמש בעכברים C57BL/6J זכר ונקבה לפחות שישה שבועות. משלימים אותם עם מים סטריליים עם או בלי cefoperazone (0.5 מ"ג / מ"ל).<ol>
<li>עכברי בית שותף בקבוצות של 5, כאשר כל כלוב מכיל את כל העכברים הזכריים או את כל העכברים הנשיים. לספק לעכברים אוכל עכבר רגיל ומים (באמצעות בקבוק 400 מ"ל) בכל עת.</li>
		<li>בדוק כלובים מדי יום כדי להבטיח שרמות המזון והמים מספיקות, ולבדוק עכברים לסימני מצוקה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החלף את המים עם cefoperazone כל 48 שעות כדי להבטיח אנטיביוטיקה טרי מסופק ללא קשר למים הנותרים בכלוב האכלה בקבוקים.</li>
	<li>לאחר 5\u20127 ימים של טיפול cefoperazone, המתת לחץ חוץ עכברים באמצעות CO2 חנק התבוננות פרוטוקול IACUC הוקמה. אשר מוות באמצעות נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>לנתח עכברים באמצעות מספריים חדים מעוקרים אוטומטית ומדפים מעוקרים אוטוקלאב.<ol>
<li>לאחר המתת חסד, לאבטח את החיה למשטח ניתוח על ידי הצמדת כל הגפיים כך הבטן נחשפת.</li>
		<li>לרסס את אזור הבטן עם 70% אתנול כדי למנוע פרווה להידבק מדפים, מספריים, או חלקי המעיים במהלך הניתוח.</li>
		<li>השתמש מדפים כדי לצבוט ולהרים קטע של העור בבסיס הבטן וליצור חתך קטן דרך העור ואת fascia הבסיסית באמצעות מספריים. יש לדאוג מאוד בעת ביצוע חתך זה, כדי למנוע ניקוב cecum או דופן המעי.</li>
		<li>מרחיבים את החתך הזה לכלוב הצלעות, וחושפים חלקית את חלל הצלף. בצע חתך החל בנקודה של החתך הראשוני משני הצדדים המשתרע כלפי מעלה וצד.</li>
		<li>משוך מדפים אלה באופן כללי ולהצמיד למשטח הניתוח כדי לחשוף באופן מלא את חלל צפירה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלץ את מערכת העיכול באמצעות מדפים, תוך שימוש במספריים כדי להפוך חתכים מעולה על הבטן ועל האזור הדיסטלי של המעי הגס כדי להבטיח איסוף של הכמות הגדולה ביותר של תוכן המעיים מכל סעיף.</li>
	<li>בעת הסרת מערכת העיכול, יש לדאוג להימנע מפגיעה ברכיבים הבודדים. להפריד את הקיבה, המעי הדק, cecum, ואת המעי הגס בנפרד באמצעות מספריים בקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים שלהם.</li>
	<li>לאיסוף כל תוכן מעיים מכל מקטע, בצע חתך יחיד בקצה הדיסטלי של כל מקטע באמצעות מספריים, ואחריו לגרש באופן ידני את תוכן המעיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל באמצעות מדפים.</li>
	<li>לאחסן את תכולת המעיים ב -80 °C (70 °F) עבור מראיות vivo לשעבר.</li>
</ol>2. הכנת תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YPD) צלחות אגר
<ol><li>לבקבוק זכוכית 1 L להוסיף 25 גרם של תמצית שמרים אבקת מרק peptone-dextrose, 10 גרם של אגר, ומים אולטרה לנפח הסופי של 500 מ"ל.</li>
	<li>אוטוקלאב ב 121 °C (60 °F) במשך 30 דקות על מחזור נוזלי כדי לעקר את התקשורת.</li>
	<li>מתחת למכסה המנוע לזרימה למינארית, יוצקים כ-20 מ"ל של אג מדיה לצלחת פטרי סטרילית. 500 מ"ל של אגאר מדיה צריך להניב כ 25 צלחות.</li>
	<li>לאחסן צלחות ב 4 °C (60 °F) עד מוכן לשימוש.</li>
</ol>3. אקס ויוו הכנה למקף מורפוגנזה
<ol><li>פס תרבות טרייה של C. albicans SC5314 על צלחת אגר YPD ודגירה לילה ב 30 °C (60 °F).</li>
	<li>בחר שתיים עד שלוש מושבות בודדות בגודל בינוני מתרבות C. albicans SC5314 הגדלות בן לילה והשהה מחדש ב- 1 מ"ל של תמיסת מלח במאגר פוספט (PBS).</li>
	<li>לאחזר תכולת מעיים קפואה מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ולהפשיר ב 25 °C (69 °F).</li>
	<li>לשקול כ 150 מ"ג של תוכן המעיים לתוך צינור חדש 1.5 מ"ל.</li>
	<li>השהה מחדש את תכולת המעיים עם 150 μL של PBS (תוכן המעיים ו- PBS ביחס משקל של 1:1 לנפח).</li>
	<li>מערבולת במהירות גבוהה עבור 30 s כדי homogenize את תכולת המעיים ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך כדקה.</li>
	<li>צנטריפוגה הומוגניטים ב 1000 x גרם במשך 3 דקות.</li>
	<li>העבר את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 כדי להסיר את כל הפסולת ב- supernatant.</li>
	<li>הוסף 10 μL של C. אלביקנים SC5314 אינוקולום מוכן לעיל זה על טבעי</li>
	<li>מערבבים היטב ו דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 4 עד 5 שעות.</li>
</ol>4. תוספת אקסוגנית של מטבוליטים לתמציות הומוגנטיות במעיים עבור מקף מורפוגנזה assay
<ol><li>אחזר תכולת מעיים קפואה מהמקפיא -80 °C (60 °F) והושעה מחדש ב- PBS ביחס של 1:1 (משקל: נפח).</li>
	<li>מוסיפים את הריכוז הרצוי של מטבוליטים במעיים לתכלית המעיים ולתערובת PBS.</li>
	<li>מערבולת במהירות גבוהה עבור 30 s כדי homogenize את תכולת המעיים המכיל מטבוליטים ולאפשר לשבת בטמפרטורת החדר במשך כ 10 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה הומוגניטים ב 1000 x גרם במשך 3 דקות.</li>
	<li>העבר את העל-טבעי לצינור חדש של 1.5 מ"ל. חזור על שלבים 4.4 ו- 4.5 כדי להסיר את כל הפסולת ב- supernatant.</li>
	<li>הוסף 10 μL של C. אלביקנים SC5314 אינוקולום מוכן לעיל זה על טבעי. מערבבים היטב ו דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 4 עד 5 שעות.</li>
</ol>5. C. אלביקנים מורפוגנזה מראי (immunostaining והדמיה)
<ol><li>צנטריפוגה הדגימות ב 1000 x g במשך 2 דקות להשליך את supernatant באמצעות צינורות.</li>
	<li>לתקן את הדגימות ב 100 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) במשך 15 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 2 דקות ולהשליך על טבעי באמצעות צינורות.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות פעמיים עם 1 מ"ל של PBS. כדי לשטוף דגימות, להשעות מחדש את גלולה PBS על ידי צינור בעדינות. אין למערבולת המדגם שכן הדבר עלול לגרום נזק למבני המקף. לאחר השעיה מחדש, צנטריפוגה ב 1000 x g במשך 2 דקות להשליך את supernatant באמצעות צינורות.</li>
	<li>הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר ב 100 μL של PBS המכיל נוגדן פוליקלונל C. אלביקנים (1:100 דילול) במשך 30 דקות.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS. הערה: בעת שימוש בנוגדן פלואורסצנטי, מומלץ לבצע את כל שלבי הדילול והכביסה באור עמום כדי למנוע הלבנת תמונות ולשפר את תוחלת החיים לדוגמה.</li>
	<li>דגירה הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ב 100 μL של PBS המכיל נוגדן אנטי ארנב IgG Alexafluor 488 ב 1:500 דילול. בצע דגירה במגירה כהה או בחדר כדי למנוע הלבנת תמונות.</li>
	<li>לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של PBS.</li>
	<li>להשעות מחדש את הדגימות ב 100 μL של PBS ולהעביר צלחת 96 באר להדמיה. הערה: כאשר לא להיות בתמונה, מומלץ כי צלחת 96 גם להיות עטוף בנייר אלומיניום, כדי למנוע הלבנת תמונה.</li>
	<li>תאים פטרייתיים תמונה באמצעות 20x ו 40x עדשות אובייקטיביות באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי. השתמש במסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) (אורך גל 470/40 ואורך גל פליטה 525/50) כדי לזהות פלואורסצנטיות.</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי אינטרסים אחרים.

השיטה המתוארת כאן מציגה דרך חדשנית לחקור את ההשפעה של השפעות אנטיביוטיות, תזונתיות, קסנוביוטיות וטיפוליות על C. אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול. מאז רוב זיהומים מערכתיים מקורם GItract 21,22,23,24,25,26,27,28,29</su...

קנדידה אלביקנים הוא פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי, פולימורפי, כי הוא בדרך כלל בקנה אחד, אבל יכול לעבור שינוי מורפולוגי לתוך צורה ארסית המסוגלת לגרום לזיהומים מסכניחיים אצלאנשים immunocompromised 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. אלביקנים הוא הגורם המוביל של זיהומים nosocomial מערכתית, עם 40 \u201260% שיעור התמותה אפילו עם טיפול נגד פטריות2,14,15. למרות C. albicans שוכן בנישות מארח שונות כולל מערכתהרבייה הנשית 16,17, חלל הפה של אנשיםבריאים 18 ואת מערכת העיכול (GI) מערכת19,20, רוב זיהומים מערכתיים מקורם במערכת העיכול ועוד, מקור הזיהום המערכתי הוא אישר לעתים קרובות להיות GI בדרכי21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. פתוגניות אלביקנים במערכת העיכול מושפעת ממגוון רחב של גורמים; עם זאת, מאפיין מרכזי הנחוץ לארסיות הוא המעבר ממורפולוגיה של תאי שמרים למורפולוגיה של תאי מקףארסיים 35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans התקשרות והפצה מ GI בדרכי במהלך זיהום קשורה מאוד עם היכולת שלה לעבור שמרים commensal לתוך hyphae ארסי, המאפשר פטריותלגרום למחלה פולשנית 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
מגוון גורמים במעיים, כולל n-אצטילגלוקוסאמין, לווסת היווצרות מקף על ידי C. אלביקנים. לכן, חשוב לצמצם את הפער בידע לגבי מורפוגנזה המקף של פתוגן פטרייתי זה בדרכי GI54,55,56. עדויות אחרונים מצביעות על כך מטבוליטים שונים במעיים לשלוט באופן דיפרנציאלי מורפוגנזה המקף של C. אלביקנים במבחנה 57,58,59,60. עם זאת, אילוצים טכניים מציגים בעיות כאשר מנסים לחקור C. albicans היווצרות hyphae בדגימות המעיים in vivo, במיוחד הכתמת שמרים ותאי hyphae וניתוח כמותי של התפתחות המקף. כדי להבין C. אלביקנים מקף morphogenesis במערכת העיכול, שיטת vivo לשעבר פותחה באמצעות תמציות מסיסים של תוכן המעי הומוגני מעכברים כדי לחקור את ההשפעה של מטבוליטים על מורפוגן מקף פטרייתי. ניצול דגימות מעיים מעכברים עמידים רגישים לזיהום C. albicans GI, שיטה זו תסייע לזהות וללמוד את ההשפעה של מטבוליטים, אנטיביוטיקה ושנאת קסנוביוטיקה על מורפוגנזה מקף פטרייתי במערכת העיכול.

<table><tbody><tr><td>1 - 10 ומיקרו; L טיפים פיפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-454</td><td>שונות</td></tr><tr><td>100 - 1000 ומיקרו; L טיפים</td><td>פיפט פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-400</td><td>שונות</td></tr><tr><td>20 - 200 ומיקרו; L טיפים לפיפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-707-451</td><td>שונות</td></tr><tr><td>2-חומצה מתיל-בוטירית</td><td>סיגמא</td><td>193070-25G</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>488 עז אנטי-ארנב IgG</td><td>Invitrogen (פישר)</td> <td>A11008</td><td>IF צביעה משנית ab</td></tr><tr><td>אגר</td><td>פישר</td><td>BP1423-500</td><td>YPD רכיב אגר</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הדמיה אוטומטי</td><td>Keyence</td><td>BZX700</td><td></td></tr><tr><td>קנדידה אלביקנס נוגדן</td><td>Invitrogen (פישר)</td> <td>PA1-27158</td><td>IF צביעת בטן ראשונית</td></tr><tr><td>cefoperazone</td><td>קיימן</td><td>16113</td><td>אנטיביוטיקה</td></tr><tr><td>חומצה דאוקסיקולית</td><td>סיגמא</td><td>30960</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>פישר</td><td>D16-500</td><td>מלקחיים תרכובת מקדמת היפי</td></tr><tr><td></td><td>פישר</td><td>08-885</td><td></td></tr><tr><td>חומצה לקטית</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAAL13242-06</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>חומצה ליטוכולית</td><td>Sigma</td><td>L6250-10G</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>חומצה פלמיטית</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>אלפא</td><td>Aesar A11313</td> IF צביעה תמיסת מלח <td>מקיבוע</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ פוספט (PBS), 10x</td><td>אלפא Aesar</td><td>J62692</td><td>PBS רכיב</td></tr><tr><td>p-tolylacetic חומצה</td><td>SCBT</td><td>sc-257959</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>חומצה סבצית</td><td>Sigma</td><td>283258-250G</td><td>תרכובת מעכבת היפאלית</td></tr><tr><td>מספריים חדים פישר</td><td></td><td>28301</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים Milli-Q N</td><td>/ A</td><td>N /</td><td></td></tr><tr><td>A שונות YPD מרק</td><td>BD Biosciences</td><td>242810</td><td>רכיב אגר YPD</td></tr></tbody></table>

ex vivo assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

קנדידה אלביקנים מקף morphogenesis במערכת העיכול (GI) מערכת העיכול נשלטת היטב על ידי אותות סביבתיים שונים, וממלא תפקיד חשוב בהפצה ופתוגנזה של פתוגן פטרייתי אופורטוניסטי זה. עם זאת, שיטות לדמיין hyphae פטרייתי במערכת העיכול ב vivo הם מאתגרים אשר מגביל את ההבנה של אותות סביבתיים בשליטה על תהליך morphogenesis זה. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים שיטת ex vivo חדשנית להדמיה של מורפוגנזה מקפית בתמציות הומוגניות במעיים. באמצעות מבחן אקס ויוו, מחקר זה מדגים כי תוכן cecal מעכברים מטופלים אנטיביוטיים, אבל לא מעכברי בקרה מטופלים, לקדם C. אלביקנים מקף morphogenesis בתכולת המעיים. כמו כן, הוספת קבוצות ספציפיות של מטבוליטים במעיים לתכולת cecal מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה מווסתת באופן דיפרנציאלי את המקף morphogenesis ex vivo. יחד, פרוטוקול זה מייצג שיטה חדשנית לזהות ולחקור את האותות הסביבתיים השליטה C. אלביקנים מקף morphogenesis במערכת העיכול.

תוצאות אלה יחד עם ממצאים קודמים ממעבדת Thangamani60 מצביעים על כך שכאשר C. albicans גדל ex vivo בתמציות הומוגנטיות במעיים שנלקחו מהבטן, המעי הדק והמעי הגס של שליטה לא מטופלת ועכברים שטופלו באנטיביוטיקה, C. אלביקנים מתפתחים בדרך כלל עם מורפולוגיה שמרים (איור 1B). עם זאת, כאשר גדל בתמצית cecal מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה, C. albicans בקלות עובר מורפוגנזה, וכתוצאה מכך דגימות המכילות שמרים וצורות hyphae (איור 1B); מ...

ex vivo assay המתואר במחקר זה באמצעות תמציות הומוגנטיות במעיים וכתמי immunofluorescence מייצג שיטה חדשנית לבחון את המורפוגנזה המקף של קנדידה אלביקנים במערכת העיכול. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת כדי לחקור את האותות הסביבתיים המסדירים מעבר מורפוגנטי במעיים.

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

הפרוטוקול המודגם בסרטון זה מאפשר לנו להבין את התפקיד של מטבוליטים במעיים על מורפוגנזה מקף פטרייתי. טכניקת אקס ויוו זו פחות או יותר את הקירוב הקרוב ביותר של המעיים לחקר מורפוגנזה מקף פטרייתי באופן שאף מחקר במבחנה לא יכול לשכפל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את התפקיד של מטבוליטים במעיים על פתוגנים א המעית אחרים.לנתח עכברים באמצעות מספריים חדים מעוקלים אוטומטית ומלקחיים. לאחר המתת חסד, לאבטח את החיה למשטח ניתוח על ידי הצמדת כל הגפיים כדי לחשוף את הבטן. יש לרסס את אזור הבטן ב-70% אתנול כדי למנוע מפרווה להידבק למדפים, מספריים או חלקי מעיים.השתמש מדפים כדי לצבוט ולהרים קטע של העור בבסיס הבטן וליצור חתך קטן דרך העור ואת fascia הבסיסית דואגת כדי למנוע ניקור cecum או דופן המעי. מרחיבים את החתך הזה לבית החזה וחושפים חלקית את חלל הצלף, ואז עושים חתך שמתחיל בנקודת החתך הראשוני משני הצדדים ונמשך כלפי מעלה וצד. משוך מדפים אלה באופן כללי ולהצמיד אותם למשטח ניתוח כדי לחשוף באופן מלא את חלל צפירה.לחלץ את מערכת העיכול עם מטליות תוך שימוש במספריים כדי להפוך חתכים מעולה על הבטן באזור דיסטלי של המעי הגס כדי להבטיח איסוף של הכמות הגדולה ביותר של תוכן המעיים. בעת הסרת מערכת העיכול, יש לדאוג להימנע מפגיעה ברכיבים הבודדים. להפריד את הקיבה, המעי הדק, cecum, ואת המעי הגס בקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים שלהם.לאיסוף תכולת המעיים מכל מקטע, בצע חתך יחיד בקצה הדיסטלי, ולאחר מכן הוצא ידנית את תכולת המעיים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר עם מטליות. אחסן את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס לשעבר vivo assays. פסים תרבות טרייה של C.albicans SC5314 על צלחת אגר YPD ודגירה אותו לילה ב 30 מעלות צלזיוס.ביום שלמחר, בחר שתיים או שלוש מושבות בודדות בגודל בינוני ותייסוף שוב במיליליטר אחד של PBS. יש לאחזר תכולת מעיים קפואה מהמקפיא ולהפשיר אותם ב-25 מעלות צלזיוס. מעבירים כ-150 מיליגרם של תכולת המעיים לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ומעבירים אותם מחדש עם 150 מיקרוליטר של PBS.Vortex המדגם במהירות גבוהה במשך 30 שניות כדי homogenize את תכולת המעיים ולאפשר לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך כדקה. צנטריפוגה homogenates ב 1, 000 פעמים G במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מיליליטר דואג לא להעביר שום פסולת. לאחר חזרה על הצנטריפוגה, מוסיפים 10 מיקרוליטרים של אינקולום C.albicans לעל-טבעי, מערבבים היטב, ודוגרים את המדגם ב-37 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות.כדי לבדוק את ההשפעה של מטבוליטים אקסוגניים על C.albicans, להוסיף את הריכוז הרצוי של מטבוליטים לתכלית המעיים ותערובת PBS, ואז מערבולת המדגם במהירות גבוהה במשך 30 שניות, לתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, ולבצע צנטריפוגה וחיסון כפי שתואר קודם לכן. צנטריפוגה תרבות התא הפטרייתי ב 1, 000 פעמים G במשך שתי דקות ולהשליך את העל טבעי. תקן את הדגימות ב 100 microliters של 2%PFA במשך 15 דקות, ולאחר מכן לחזור על הצנטריפוגה ולהשליך את supernatant.לשטוף את הדגימות פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS על פי הוראות כתב היד, ולאחר מכן להדגיר את הדגימות בטמפרטורת החדר ב 100 microliters של PBS עם נוגדן C.albicans polyclonal במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, לשטוף את המדגם שלוש פעמים נוספות עם PBS, עובד באור עמום כדי למנוע photobleaching. בחדר חשוך, הדגירה את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות ב 100 microliters של PBS המכיל נוגדן אנטי ארנב IgG Alexa Fluor 488 בדילול אחד עד 500.לאחר שטיפת הדגימה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של PBS, להשתמש בו מחדש ב 100 microliters של PBS ולהעביר אותו צלחת 96 באר להדמיה. תדמיין את התאים הפטרייתיים עם מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי באמצעות עדשות אובייקטיביות 20X ו- 40X ומסנן חלבון פלואורסצנטי ירוק. כאשר C.albicans גדל ex vivo בתמציות הומוגנטיות במעיים שנלקחו מהבטן, המעי הדק והמעי הגס של שליטה לא מטופלת ועכברים שטופלו באנטיביוטיקה, זה בדרך כלל מתפתח עם מורפולוגיה שמרים.עם זאת, כאשר גדל תמצית cecal מעכברים שטופלו באנטיביוטיקה, C.albicans בקלות עובר מורפוגנזה וכתוצאה מכך שמרים וצורות hyphae. זה מצביע על כך טיפול אנטיביוטי גורם לשינויים בסביבת cecal, אשר לגרום מורפוגנזה מקף של C.Albicans. תוספת אקסוגנית של גלוקוז ל-cecal homogenate של עכברים שטופלו באנטיביוטיקה הראתה התפתחות מקף מסיבית אקס ויוו.תוצאות אלה מראות כי תוספת של מטבוליטים במעיים בחזרה הומוגנאט cecal של עכברים שטופלו באנטיביוטיקה דיפרנציאלי מווסת את המורפוגנזה של C.albicans. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי אופטימיזציה של דילול של תוכן המעיים מבטיח אוסף מספיק של מטבוליטים במעיים ללא אוסף של פסולת. אין לחרוג מדילול תוכן מדיה-בטן של שניים לאחד ולכוון לדילול נמוך יותר במידת האפשר.טכניקה זו נמצאת בשימוש כעת כדי לחקור כיצד מטבוליטים ספציפיים בהתפתחות המקף השפעת המעיים, המאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את התפקיד של מטבוליטים במעיים על פתוגנזה פטרייתית.

an-ex-vivo-assay-to-study-candida-albicans-hyphal-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הפיתוח של מודל עכבר in vivo לחקר היווצרות ביופילם של קנדידה אלביקנס ברקמה תת-עורית. הניסוי כולל השתלת מכשירים נגועים בקנדידה באזור הגב של החיה לצורך פיתוח ביופילם.

קנדידה אלביקנס היווצרות ביופילם במודל עכבר In Vivo

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לחקר השפעת נוגדנים על ביופילמים פטרייתיים. הפטרייה הפתוגנית Candida tropicalis מפרישה גורם אלים המופרש aspartyl proteinase 2 (Sap2), מה שמקל על היווצרות ביופילם. עם החדרת סרום מומת חום המכיל נוגדנים ספציפיים ל-Sap2 המעכבים את הבשלת הביופילם, נבדקת הכדאיות של התאים הפטרייתיים באמצעות בדיקה כרומוגנית.

בדיקת מבחנה להערכת השפעת נוגדנים על ביופילם קנדידה טרופיקליס

אנו מתארים שיטות למיקרוסקופיה וידאו חי...

מיקרוסקופיה וידאו חי מתא phagocytosis הפתוגן פטרייתיים

המאמר הנוכחי מתאר פרוטוקול להקים מערכת מודל תרבית תאים במבחנה כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן פקולטטיבי תוך תאי אנושי פטריית קנדידה glabrata עם מקרופאגים אדם אשר יהיה כלי שימושי כדי לקדם את הידע של מנגנוני ארסיות פטרייתי שלנו.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

אנו מציגים הליך ניסיוני של התפתחות ביופילם של קנדידה אלביקנס במודל תת עורי של עכבר. ביופילמים פטרייתיים כומתו על ידי קביעת מספר היחידות היוצרות מושבה ועל ידי הדמיית ביולומינסנציה לא פולשנית, כאשר כמות האור המופקת תואמת את מספר התאים הקיימאים.

קנדידה אלביקנס Biofilm פיתוח על גופי חוץ-רפואי רלוונטיים בתת עורי מודל עכבר ואחרי פליטת אור הדמיה

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מכשיר microfluidic אוטומטית להתאמה אישית כדי להמחיש ביופילמים ב קנדידה אלביקנס בתנאים פיזיולוגיים המארח.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

מטרת פרוטוקול זה היא להמחיש את הצורה של קנדידה אלביקנס תא ולוקליזציה במערכת העיכול היונקים.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

כתב יד זה מתאר שיטה לסינון ספריות מוטנטיות בגודל בינוני של קנדידה אלביקנס עבור פנוטיפים של מורפוגנזה במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית.

שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

חקור מורפוגנזה של קנדידה אלביקנים במערכת העיכול באמצעות שיטת ex vivo עם תמציות הומוגניזט מעיים וצביעת אימונופלואורסצנציה. שיטה זו חושפת את אותות הסביבה המווסתים מעברים מורפוגנטיים בחיידקים פתוגניים במעי.

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

גלה סרטונים נוספים