Name: מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למדו שיטת SAX-HPLC לזיהוי וכימות פוליפוספטים לאנוזיטול בצמחים באמצעות תיבול רדיו. הפרוטוקול מספק רגישות גבוהה לניתוח מטבוליזם צמחי ותהליכי פיתוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית מצוינות של גרמניה - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), קבוצת הכשרת מחקר GRK2064 ומעניקי מחקר בודדים SCHA1274/4-1 ו SCHA1274/5-1 כדי G.S. אנו מודים גם ללי שלוטר ובריג'יט אוברבאך על הסיוע הטכני.

לסופרים אין מה לחשוף.

כאן אנו מציגים שיטה רב-תכליתית ורגישה לכמת InsPs כולל PP-InsPs בתמציות צמח ולספק עצות מעשיות על איך לקבל שיטה זו הוקמה. למרות שהפרוטוקול הוא בדרך כלל חזק, ריצות וניתוחים תת-אופטימליים יכולים להתרחש. ברוב המקרים, ריצות אלה ניתן לזהות על ידי הפחתה חזקה או אפילו אובדן מוחלט של InsPs זרחן מאוד, במיוחד המינים PP-InsP InsP7 ו InsP8. סיבות אפשריות יכולות להיות זיהום מיקרוביאלי של חומר הצמח ונעה לא מספיק של הידרולאזים PP-InsP צמח אנדוגני במהלך החילוץ בשל שחיקה מספיקה והפשרה של חומר הצמח שלא יהיה במגע מיידי עם מאגר החילוץ. סיבות נוספות כוללות התאמת pH לא מדויקת על-ידי תוספת לא מספקת או עודפת של מאגר נטרול, או פשוט חומר לדוגמה לא מספיק. האחרון יכול לעשות את זה קשה לזהות PP-InsPs, מאז אלה נמצאים לעתים קרובות בכמויות נמוכות מאוד בתאים. עודף של חומר מדגם או ייבוש לא יעיל במהלך שלב 3.5 עלול לגרום דילול של חומצה perchloric, ולכן גם מוביל השבתת אנזים מספיק ואובדן ספציפי של InsP6 ו PP-InsPs. כמות החומר הצמחי, כמו גם radiolabel בשימוש בפרוטוקול זה היו אופטימיזציה בהתבסס על עלויות וביצועים, ולכן הוא קרוב לכמות הנמוכה ביותר שעדיין מספיקה למתן תוצאות אופטימליות. בנוסף, שרפטור העמודה יאבד בהדרגה את קיבולת הרזולוציה שלו. הסימן הראשון של תהליך זה הוא (מסיבות לא לגמרי ברורות למחברים) אובדן ספציפי של מינים InsP זרחן גבוה יותר כמו PP-InsPs בספקטרום HPLC. עם הזדקנות נוספת, אפילו InsP6 לא ייפתר כראוי על ידי העמודה(איור 1D). לכן, השימוש בעמודה נאותה, כמו גם טיפול קפדני של המדגם ותחזוקה נכונה של רכיבי HPLC הוא חיוני להבטחת תוצאות מדויקות.
בעת השוואת דוגמאות וריצות, במיוחד כאשר נוצרים באמצעות ציוד שונה (לדוגמה, מערכות ועמודות של HPLC) או בימים שונים, חיוני לנרמל את הדגימות זו לזו (כמתואר בשלב 7.3) ולנתח אותן באותו אופן. רק באמצעות נורמליזציה ניתן ומדויק להציג דגימות מרובות באותו גרף (איור 3). לכמת InsPs בודדים ביחס לסך של InsPs, או למין InsP ספציפי אחר, אין צורך לנרמל, כל עוד מוצגים רק ערכים יחסיים ולא ערכים מוחלטים. באופן אידיאלי, הן פרופילי InsP והן הכימות מוצגים. עם זאת, במקרים מסוימים לא ניתן להציג כראוי שתי ריצות או יותר באותו גרף. זמני שמירה שונים או רמות שונות של פעילות רקע יכולים לקשה על השוואת פרופילי SAX-HPLC לא כירים בלבד. אותו הדבר נכון כאשר דגימות רבות צריך להיות מושווה. במקרים כאלה, יש צורך בהערכה נוספת באמצעות תוכנה נוספת (לדוגמה, Origin) לכמת שיא אישי.
המחברים מודעים לכך שניתן לייעל את הפרוטוקול המתואר כאן ויש להתאים אותו לכל שאלת מחקר פרטני. למרות להיות אופטימיזציה עבור תמציות Arabidopsis 7,17 בפרוטוקול זה, שיטה זו היא תכליתית והוא יכול לעזור בקביעת פרופילי InsP של מינים אחרים של צמחים גם כן. כאן אנו מדגים אפשרות זו על ידי הצגת בפעם הראשונה פרופיל InsP עבור L. japonicus, אשר לא דרש שינויים של תנאי התיוג, חילוץ InsP או SAX-HPLC לרוץ(איור 2). במיוחד, בעוד באופן כללי דומה, ההבדלים נצפו בין L. japonicus ו פרופילים InsP Arabidopsis. למשל, בל. japonicus InsP5 [4-OH] או הצורה enantiomeric שלה InsP5 [6-OH] הם בשפע יותר מאשר InsP5 [1-OH] או הצורה אננטיומרית שלה Insפ'-5 [3-OH] בהשוואה לערבידופסיס,שם InsP5 [1-OH] או צורתו enantiomeric InsP5 [3-OH] הם המינים הדומיננטיים InsP5. כמו כן, אנו צופים כי שינויים בהרכבהתקשורת, [3H]-מיו-ריכוז, גיל הצמח, תנאים סביבתיים (למשל, אור וטמפרטורה), תוספת של תרכובות כימיות או ניתוחים של אינטראקציות צמח מיקרוביאלי בין גורמים אחרים, ייתכן שיהיה צורך להיבדק ולהתאים.
אחד החסרונות החשובים של שיטה זו שיש לקחת בחשבון הוא כי התיוג נעשה בתרבות נוזלית (סטרילית), אשר אינה מייצגת סביבה פיזיולוגית עבור רוב צמחי הקרקע. בנוסף, בשל העלויות הגבוהות של [³H]-מיו-אינוזיטול, נפח פתרון התיוג וגודל כלי התרבות מוגבל בדרך כלל, מה שמגביל גם את גודל הצמחים שניתן להשתמש בהם. ניתן להימנע מטיפוח בתרבות הנוזלית על ידי הסתננות ישירה למשל של צמחים מגודלים בקרקע עם [³H]-מיו-אינוזיטול ולאחר מכן בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן, כפישדווח קודם לכן 10.
ישנם מספר חסרונות של פרוטוקול זה בהשוואה לשיטות חלופיות, כגון TiO2 למשוך למטה ואחריו טכניקות מבוססות PAGE או ספקטרומטריה המונית. בשל[3H]-מיו-תיוג inositol, רק מינים InsP שמקורם ישירות מיו -inositol רדיויתגלה בסופו של דבר. השיטה המתוארת כאן היא עיוורת isomers Ins אחרים כגון scyllo-אינוזיטול ו isomers אחרים שחלקם זוהו בצמחים מסוימים44. יתר על כן, myo-InsPs נגזר ממסלולים אחרים לא ייכללו, כולל אלה מסונתז על ידי סינתזה דה נובו של מיו-אינוזיטול ומיו-אינוזיטול-3-פוספט באמצעות isomerization של גלוקוז-6-פוספט, קטאלי על ידי מיו-אינוזיטול-3-פוספט סינתאז (MIPS)חלבונים 45. למרות[32P] או [33P]- אורתופדיה -פוספט יכול לשמש תוויות חלופיות, השימוש בהם מהווה חיסרון גדול, שכן כל מולקולה המכילה פוספט, כולל נוקלאוטידים בשפע ונגזרותיה, יסויג.ortho מולקולות אלה ניתן גם לחלץ עם פרוטוקול זה ולאגד לעמודה SAX, אשר יגרום רמה גבוהה של פעילות רקע שתפריע לזיהוי של פסגות InsPבודדים 5. בנוסף, כימות של [32P]- או [33P] מתויג InsPs ו PP-InsPs יכול להיות מושפע מאוד על ידי מחזור פוספט ו pyrophosphate moiety ולא יכול לדווח על קריאה המונית עבור מינים אינוזיטול.
מצד שני,[3H]-מיו-אינוזיטול במיוחד תוויות מיו-אינוזיטול המכיל מולקולות. InsPs, שומנים המכילים אינוזיטול, כגון פוספינוסיטידים, ו galactinol הם במקרה זה מסומן. עם זאת, רק InsPs ינותחו עם פרוטוקול זה, מאז שומנים אינם מסיסים במאגר החילוץ galactinol אינו נקשר לעמודה SAX.
עד כה, ההבדלים מפרופיל InsP צמח שנוצר על ידי [3H]-מיו-אינוזיטול תיוג לעומת אחד שנקבע על ידי TiO2 נסיגה / PAGE נשאר לא ידוע, מאז השוואות כאלה לא בוצעו בצמחים. מחקר שנערך לאחרונה בתאי בעלי חיים התייחס לשאלה זו46. בעבודה זו, בריכה של InsP6 כי הוא בלתי נראה על ידי [3H]-מיו-אינוזיטול תיוג, אשר בכך צריך להיות נגזר ישירות גלוקוז-6-פוספט, זוהה על ידי השוואת פרופילי SAX-HPLC עם ג'לים דף של קווי תאים יונקים. 24 שעות של רעב פוספט הביא לעלייה של 150% של InsP6 בעת כימות ג'לים דף של InsPs מטוהרים באמצעות TiO2 נסיגה. SAX-HPLC ניתוחים של [3H]-מיו-אינוזיטול-תווית תאים שטופלו באופן זהה רק הראה עלייה של 15% של [3H]-InsP6. כפי שהוזכר קודם לכן, InsPs נמוך יותר מ- InsP5 אינם ניתנים לגילוי עם ניתוח PAGE ברוב המקרים. תייבל רדיו ואחריו SAX-HPLC נראה כשיטת הבחירה, כל עוד פרוטוקולים ספקטרומטריים מסה אינם ממוטבים כדי לזהות קבוצה זו של מולקולות טעונות שלילית מאוד.
אתגר נוסף שנותר הוא להבחין בין enantiomers בניתוחי SAX-HPLC (או בכל שיטה אחרת לניתוח InsP)10,17. אתגר זה ניתן להתמודד על ידי תוספת של בוררים כיראליים, כלומר, enantiopure תרכובות כמו L-ארגנין amide אינטראקציה עם מולקולות enantiomeric בהתאמה כדי ליצור תרכובות diastereomeric שניתןלהפריד 10. למיטב ידיעתנו, גישה זו יושמה רק כדי להפלות את Enantiomeric InsP5 isomers InsP5 [1-OH] ו- InsP5 [3-OH] על ידי NMRמנתח 10. אפליה של זוגות אננטיומריים אחרים או אפליה מוצלחת של enantiomers על ידי ניתוח SAX-HPLC כיראלי או שיטות מבוססות דף כיראלי עדיין לא דווחו ויש לפתח גם. בהתחשב בסינתזה המשומרת וברגולציה המשומרת של PP-InsPs על ידי זמינות זרחן, אנו מדמיינים כי שיטות לא רדיואקטיביות במיוחד כגון PAGE או שיטות מבוססות MS, יחד עם ניתוחים תזונתיים, יסייעו לקרקע את מאמצי האמת לכייל נתוני חישה מרחוק שנועדו לאבחן ליקויים תזונתיים בגידולים17,,18,,24,,25. עם זאת, השיטה המוצגת כאן עדיין יכול להיחשב תקן הזהב עבור ניתוחי InsP ויהיה אינסטרומנטלי לגלות פונקציות חדשות של שליחים מסקרנים אלה בצמחים.

לפני כמעט ארבעה עשורים, פוספטים אינוזיטול (InsPs) הגיח כמו מולקולות איתות, לאחר Ins(1,4,5)P3 (InsP3) זוההכשליח שני המפעיל את שחרור מתווכי הקולטן של Ca2+ בתאים בעליחיים 1,,2. עד כה, אין קולטן InsP3 (IP3-R) זוהה בצמחים, אשר מטיל ספק תפקיד איתות ישיר עבור InsP3 בתאי צמח3. ללא קשר, InsP3 משמש כסימן מקדים עבור InsPs אחרים המעורבים במספר תהליכים התפתחותיים של הצמח, כולל רגולציה של מסלולי איתותספציפיים 3,4,,5,,6,7,,8. לדוגמה, InsP3 יכול להיות זרחן נוסף InsP 6 ,המכונהגם "חומצה פיטית", אשר מייצג מקור מרכזי של פוספט, מיו-אינוזיטול ו cations, והוצג לשחק תפקידי מפתח בהגנה על הצמח מפני פתוגנים, MRNA ייצוא פוספט הומסטאזיס 5 ,9,,10,11,12.9
אינוזיטול pyrophosphates (PP-InsPs) הם מחלקה של InsPs המכילים לפחות אחד אנרגיה גבוהה די-פוספו בונד, מזוהה בתחילה בתאים בעלי חיים, אמבה ושמרים, שם הם משחקים תפקידיםקריטיים בתהליכים תאיים שונים 13,14,15. למרות עבודה על PP-InsPsבצמחים 16,17,18,19,1720,,21,22,23,24,25,26, הפונקציות הביולוגיות וזהות isomer של מולקולות אלה עדיין להישאר אניגמטי במידה רבה., במפעל מודל Arabidopsis thaliana, תאי InsP8 הוצע לווסת את ההגנות נגד אוכלי עשב חרקים ופטריות necrotrophic באמצעות גילויצירוף מקרים של InsP 8 ו jasmonate פעיל על ידי קומפלקס קולטן ASK1-COI1-JAZ17. יתר על כן, תפקידים של InsP8 ו- PP-InsPs אחרים בהונואוסטזיס אנרגיה חישה תזונתית, כמו גם הומוסטאזיס פוספטהוצעו 17,23,24,25,26.
ללא קשר למערכת הביולוגית המועסקת, אחד האתגרים המתודולוגיים העיקריים בעת לימוד InsPs היה זיהוי אמין וכמת מדויק של מולקולות אלה. שיטות מבוססות ספקטרומטריה מסה שימשו לזיהוי InsPs, כולל PP-InsPs, מתמציות תאים. עם זאת, מחקרים אלה לא הצליחו להבדיל בין26 ל-26,27. גישה נוספת לניתוח InsPs משתמשת במשיכה כלפי מטה של InsPs מתאי ליסטים באמצעות TiO2 חרוזים, ואחריו אלקטרופורזה ג'ל polyacrylamide (PAGE) של InsPs האלגנטיות. לאחר מכן ניתן להכתים את ה- InsPs על-ידי טולואידין כחול או DAPI24,28,29. עם זאת, עד כה לא ניתן לזהות InsPs באופן מהימנות נמוך יותר InsP5 מתמציות צמחים באמצעות שיטה זו. לאחרונה, שיטה באמצעות [13C]-מיו-inositol עבור תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ניתוח של InsPs פורסם כחלופה חילופי אניון חזק כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (SAX-HPLC)30. טכניקה זו דווחה כדי להשיג רגישות דומה בהשוואה SAX-HPLC ולאפשר זיהוי של 5-InsP7, כמו גםאת האפליה של InsP 5 אינונטיומריםשונים מתמציות תאים. עם זאת, יישום השיטה מבוססת NMR דורש מסונתז כימית ולאזמין מבחינהמסחרית [ 13 C]-מיו-אינוזיטול. לכן, השיטה המועסקת ברוב המקרים היא תייול רדיו דגימות עם [3H]-מיו-אינוזיטול, ואחריו SAX-HPLC31,32,33. טכניקה זו מבוססת על ספיגה של מיו -אינוזיטולרדיואקטיבי לתוך הצמח והמרה שלה InsPs שונים על ידי הפעילות המשולבת של קינאזים ופוספטים תאיים ייעודיים.
ה- InsPs המסויגים בתווית[3H]מופקים בחומצה ומחולצים באמצעות SAX-HPLC. בשל החיוב השלילי שלהם, InsPs לקיים אינטראקציה חזקה עם השלב הנייח טעון חיובית של העמודה SAX-HPLC וניתן לפתוח עם מעבר צבע מאגר המכיל הגדלת ריכוזי פוספט כדי לתוחב InsPs מהעמודה. זמני ההתמהמה תלויים אפוא בהסתערות ובגיאומטריה של מיני ה-InsP שיש להפרידם. בהיעדר עמודות כיראליות, רק אנשים לא אננטיומרים יכולים לפי הם מופרדים על ידי פרוטוקול זה. עם זאת, ניתן להשתמש בתקני תיומת רדיו כדי להקצות את האופי האיתורי של פסגת InsP ספציפית. מאמצים מרובים בעבר על ידי מעבדות שונות כדי ליצור סטנדרטים מתויגים ללא תווית עם (ביו)שיטות כימיות או לטהר אותם מתאים שונים אורגניזמים עזרו הקצאת פסגות מינים מסוימים InsP, וגם לצמצם את הזהות האיתונטרית שלמינים בודדים שלInsP 5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. כמו כן, ההברה האחרונה של מסלולים אנזימטיים המובילים להיווצרות PP-InsPs בצמחים, כמו גם הגילוי של אפקט חיידקי סוג III עם פעילות ספציפית 1-phytase, לספק מידע על איך ליצור סטנדרטיםשימושיים עבור ניתוחים אלה 10,17,18,22,23.
ניתן למדוד את השברים המתקבלים במונה מבריק נוזלי בשל β של tritium (3H). עם הגדלת זמן תיוג, שיווי משקל איזוטופי מצב יציב הוא הגיע, לאחר מכן פרופילי InsP שהושגו צריך לייצג את מצב InsP של הצמח31. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה בהשוואה לטכניקות זמינות אחרות הוא הרגישות הגבוהה שהושגה על ידי השימוש בסימן המוקדם הישיר עבור InsPs ומדידה של אות רדיואקטיבי.
SAX-HPLC שלדגימות שחולצומ [ 3 H]-מיו-אינוזיטול-תווית צמחים או אורגניזמים אחרים משמש בדרך כלל לזיהוי וכימות של InsPs החל מינים InsP נמוך כדי PP-InsPs, המייצג כלי בעל ערך כדי להבין טוב יותר את חילוף החומרים, פונקציה ו מצבי פעולה של InsPs. עד כה, שיטה זו היא גם הבחירה המתאימה ביותר עבור חוקרים עם עניין מיוחד מינים InsP נמוך יותר. בעוד היסודות של הליך זה, שבו הפרוטוקול המתואר כאן בונה על, תוארובעבר 7,21,31,,34, פרוטוקול מפורט המותאם לניתוח של InsPs נגזר צמח ובמיוחד של PP-InsPs עדיין חסר. פרסומים קודמים דיווחו על קשיים לזהות באופן אמין את PP-InsPs בשפע נמוך,במיוחדInsP 8 , בשל אחד או יותר מהגורמים הבאים: כמויות נמוכות יחסית של חומר צמחי, [3H]-מיו-אינוזיטול עם פעילות ספציפית נמוכה (> 20 Ci/mmol), שימוש במאגרי חילוץ שלא מבוססים על חומצה perchloric או מרוכזים פחות מ 1 M, מאגרים נטרול שונים, כמו גם מעברי צבע תת אופטימליים או זיהוי של [3H] עם גלאי על הקו. בהשוואה ללימודים אלה, הפרוטוקול המוצג כאן מיועד לזיהוי אמין של PP-InsPs7,21,34.
כאן אנו מציגים זרימת עבודה מפורטת, החל מהגדרת הציוד לטיפוח ותיוג צמחים, חילוץ InsP וה-SAX-HPLC מפעילים את עצמם. למרות השיטה היה אופטימיזציה צמח מודל A. thaliana, זה יכול להיות שונה בקלות כדי ללמוד מינים אחרים של צמחים, כפי שהראה כאן עם פרופיל InsP הדיווח הראשון של המודל קטנית לוטוס japonicus. למרות שהשימוש במין צמחי אחר עשוי לדרוש אופטימיזציה מסוימת, אנו מבינים כי אלה יהיו מינוריים, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לנקודת התחלה טובה למחקר נוסף ב-InsPs של הצמח. על מנת להקל על מיטוב אפשרי, אנו מציינים כל שלב בפרוטוקול שבו ניתן לבצע שינויים, כמו גם את כל הצעדים הקריטיים שעשויים להיות מאתגרים בעת ביסוס השיטה בפעם הראשונה. בנוסף, אנו מדווחים כיצד ניתן להשתמש בנתונים שהושגו על-ידי שיטה זו לכמת של InsPs ספציפיים וכיצד ניתן לנתח ולהשוות דגימות שונות.

<table><tbody><tr><td>צנטריפוגה</td><td>Eppendorf AG</td><td>דגם: 5430 R</td><td></td></tr><tr><td>דיאמוניום מימן פוספט, &ge; 97%</td> <td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0268.1</td><td></td></tr><tr><td>אתילנדיאמין חומצה טטראצטית, מלח דיסודיום דיהידרט, &ge; 99%, p.a., ACS</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 12 בארות צלחת תרבית תאים מרובת בארות עם תחתית שטוחה שקופה, עם מכסה, עטופה בנפרד, סטרילית</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אספן שברים</td><td>353043 LAMBDA Instruments GmbH</td><td>דגם: אספן</td><td></td>ערוץ יחיד OMNICOLL</tr><tr><td>חממת צמיחה</td><td>פולי klima GmbH</td><td>דגם: משאבות HPLC PK 520-LED</td><td></td></tr><tr><td></td><td>דגם Kontron Instruments</td>: מזרק <td>420</td><td></td></tr><tr><td>HPLC לשסתומי Rheodyne, מזרק 1 מ"ל</td><td>Hamilton Company</td><td>81365</td><td></td></tr><tr><td>ל-HPLC</td><td>דגם Supelco</td><td>: Rheodyne 9725</td><td></td></tr><tr><td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td><td>ART 0261</td><td></td></tr><tr>אוניברסיטת<td>חנקן נוזלי</td><td>, המחלקה</td><td></td><td></td>לכימיה</tr><tr><td>מונה נצנוץ נוזלי</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>דגם: TRI-CARB 2900TR</td><td></td></tr><tr><td>עלי מיקרו Carl</td><td>Roth GmbH + Co. KG</td><td>CXH7.1</td><td></td></tr><tr><td>מסנן Eester תאית מעורבת, טווח ME (ME 24), רגיל, 0.2 ומיקרו; m גודל נקבוביות, 47 מ"מ עיגול</td><td>GE Healthcare Life</td> Sciences <td>10401770</td><td></td></tr><tr><td>מיקסר עבור HPLC</td><td>Kontron Instruments</td><td>דגם: M 800</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog בינוני, תערובת מלח</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro תוכנה</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חומצה אורתופוספורית, &ge; 85%, p.a., ISO</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>Partisphere 5 ומיקרו; m עמודת מחסנית SAX, 125 x 4.6 מ"מ</td><td>Hichrom Limited</td><td>4621-0505</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פרכלורית, 70%, 99.999% בסיס מתכות קורט</td><td>צלחת פטרי Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>, מרובעת, PS, שקופה, 120/120/17 מ"מ, סטרילית</td><td>Greiner Bio One International GmbH</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>נייר מחוון pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td><td>Merck KGaA</td><td>109564</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פחמתי</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>P743.2</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נעילה בטוחה, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf AG</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>לולאת דגימה למזרקים 9725, נפח 2 מ"ל, PEEK</td><td>Supelco</td><td>57648</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון נצנוץ SNAPTWIST, 6.5 מ"ל</td><td>Simport Scientific Inc.</td><td>S207-5</td><td></td></tr><tr><td>ספסל סטרילי</td><td>LaboGene</td><td>דגם: ScanLaf MARS 900</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז, &ge; 99.5%, p.a.</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-Flo AP קוקטייל נצנוץ נוזלי</td><td>PerkinElmer Inc</td><td>6013599</td><td></td></tr><tr><td>מים טהורים במיוחד נטולי יונים</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wrenchless WVS ערכת התאמה לקצה</td><td>Hichrom Limited</td><td>4631-1001</td><td></td></tr></tbody></table>

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות sax-hplc

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

אסטרים פוספט של מיו-אינוזיטול, גם כנף פוספטים אינוזיטול (InsPs), הם סוג של רגולטורים סלולריים לשחק תפקידים חשובים בפיזיולוגיה של הצמח. בשל החיוב השלילי שלהם, שפע נמוך ורגישות לפעילות הידרולית, הגילוי והכימות של מולקולות אלה הוא מאתגר. זה במיוחד המקרה עבור צורות זרחן מאוד המכיל 'אנרגיה גבוהה' אג"ח diphospho, גם גם כנוזיטול pyrophosphates (PP-InsPs). בשל הרגישות הגבוהה שלה, חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (SAX-HPLC) של צמחיםהמסוממיםעם [ 3 H]-מיו-אינוזיטול היא כיום השיטה של בחירה לנתח מולקולות אלה. באמצעות [ 3 H]-מיו-אינוזיטול שתילי צמח radiolabel, מיניםשוניםInsP כולל מספר isomers שאינם enantiomeric ניתן לזהות ומופלה ברגישות גבוהה. כאן מתוארת ההתקנה של מערכת SAX-HPLC מתאימה, כמו גם זרימת עבודה מלאה מטיפוח צמחים, תייול רדיו וחילוץ InsP ועד להפעלה של SAX-HPLC וניתוח נתונים עוקב. הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר אפליה וכמות של מינים שונים של InsP, כולל מספר isomers שאינם enantiomeric של PP-InsPs, InsP7 ו InsP 8 ,ולהיותמותאם בקלות מינים אחרים של צמחים. כדוגמאות, SAX-HPLC מנתח של Arabidopsis thaliana ו לוטוס ג'פניקו שתילים מבוצעים ופרופילי InsP מלאים מוצגים ונדונים. השיטה המתוארת כאן מייצגת כלי מבטיח כדי להבין טוב יותר את התפקידים הביולוגיים של InsPs בצמחים.

התוצאות המוצגות כאן שואפות להמחיש תוצאות אפשריות שהושגו על פי וריאציות ברמות טכניות וביולוגיות. הראשון מובחן על ידי ניתוחים באמצעות עמודות חדשות לעומת גיל ( איור 1 )ודוגמאות טריותלעומתמאוחסנות (איור 3), והשנייה עלידי הערכת תמציות משתי מערכות צמחיםשונות, א. תליאנה (איור 1, איור 3) ול.
הפעלת SAX-HPLC אופטימלית מתוארת על איור 1A\u2012C, אשר מראה ספקטרום פוליפוספט אינוזיטול מלא שהושג מתמציות A. thaliana לאחר ספירת מבריק. שימו לב כי הפסגות מופרדות יפה ותו לא ניתן להקצותן ל-isomers שונים (או לזוגות enantiomer) המבוססים על ניידות כרומטוגרפית המתוארתקודם לכן 5,7.
איור 2 מציג את התוצאה המייצגת של ניתוח SAX-HPLC של שתילי L. japonicus שגדלו וסויגו באותם תנאים כמו שתילי Arabidopsis. בעוד ככל הנראה כל מיני InsP ופסגות הידועים Arabidopsis ניתן לראות, ישנם הבדלים משמעותיים לגבי יחסית (למשל, יחסים בין isomers) של isomers InsP ספציפי, בעת השוואת הפרופילים של שני המינים. לדוגמה, תמציות לוטוס הראו InsPמוגברת 3c, InsP4b, InsP5b ו מופחת InsP3a, InsP4a, InsP5a ו InsP5c לעומת Arabidopsis אשר משאיר מקום לחקירות נוספות. איור 2D ממחיש את היחסים השונים בין Isomers InsP בין Arabidopsis לבין לוטוס.
איור 3 מציג שני פרופילי InsP של מדגם שפוצלו לאחר החילוץ. המחצית הראשונה נותחה מיד והמחצית השנייה יום לאחר מכן, לאחר אחסון ב-80 מעלות צלזיוס. שים לב כי רק הבדלים קלים נצפו בין הדגימות השונות (כלומר, קווים שחורים ואדומים באיור 3A\u2012C, ואיור תלת-מידי). הדבר ממחיש שמחזור הקפאה אחד אינו פוגע בדגימה וששיטה עצמה מייצרת תוצאות לשחזור.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> איור 1: פרופיל InsP טיפוסי של ניתוח SAX-HPLC מוצלח שבוצע באמצעות פרוטוקול זה. (a\u2012C) פרופיל SAX-HPLC של בני 17 יום מסוג פראי (קול-0) שתילי Arabidopsis radiolalabeled עם [3H]-מיו-אינוזיטול. חילוץ InsP כללי והפעלה SAX-HPLC בוצעו באותו יום. (א)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה Ins(1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a מייצג InsP5 [2-OH], InsP5b מייצג את InsP5 [4-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 עדיין אינם ידועים. לוח (D) מציג פרופיל SAX-HPLC של צמחים שגודלו באופן זהה אך באמצעות עמודה מזדקנת (&gt;40 פועל). הפחתה ברורה של InsP6 בהשוואה למינים אחרים InsP והיעדר PP-InsPs גלוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> איור 2: פרופיל InsP מייצג של צמחים ל. יפניקוס.  פרופיל SAX-HPLC (A\u2012C) של 17 יום בן בר מסוג (גיפו) L. שתילי יפניקוס radiolabeled עם [3H]-מיו-אינוזיטול. (א)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה InsP (1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b מייצג ככל הנראה InsP5 [4-OH] או את צורתו אננטיומרית InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג ככל הנראה את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנונטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 אינם ידועים. (ד)השוואה בין מיני InsP בודדים (ב% מכלל הפעילות מ- elution 25\u201296) של A. thaliana (נתונים מאיור 1A\u2012C) ו- L. japonicus (נתונים מאיור 2A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> איור 3: פרופילי InsP של מדגם מפוצל הממחישים את האפשרות לשחזור של ניתוחי SAX-HPLC. (a\u2012C) פרופילי SAX-HPLC של בני 17 יום (קול-0) שתילי ערבידופסיס עם[3H]-מיו-אינוזיטול. לפני הריצה, הדגימה פוצלה וחצי לרוץ מיד והשני חצי יום לאחר מכן לאחר אחסון ב -80 ° C. (A)ספקטרום מלא; (B, C) מה אתה עושהכאן? הגדלת התצוגה של הפרופיל המוצג ב- A. כל הפסגות הגלויות מסומנות ומוקצות למין InsP המתאים. בהתבסס על ניידות כרומטוגרפיתשפורסמה 5,7, InsP4a מייצג ככל הנראה Ins(1,4,5,6)P4 או Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a מייצג InsP5 [2-OH], InsP5a מייצג את InsP5 [2-OH], InsP5b מייצג את InsP5 [4-OH] או את הטופס האנטנטיומרי שלו InsP5 [6-OH], ו- InsP5c מייצג את InsP5 [1-OH] או את צורתו האנזנטיומרית InsP5 [3-OH]. האופי האיתורי של InsP3a-c, InsP4b, InsP7ו- InsP8 עדיין אינם ידועים. לוח ד' מציג את הכימות של InsP6 ו- PP-InsPs InsP7 ו- InsP8 של שתי הריצות. הערכים מייצגים את הסכום (ב- %) של מיני InsP בהתאמה ביחס לכל InsP (פעילות כוללת מ-25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
איור משלים 1: הגדרות תוכנה לספירת נוזלים באמצעות מונה מבריק קל. צילומי מסך המציגים את גירסת התוכנה, כמו גם הגדרות המשמשות לספירת דוגמאות של [3H] המבוצעות עם פרוטוקול זה מתוארות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.</a>
איור משלים 2: דוגמה מייצגת לנורמליזציה של נתונים. צילום מסך של גליון עבודה מציג את כל השלבים והנוסחאות המשמשים לנרמל את ריצות SAX-HPLC זו לזו. לצורך פישוט, מוצגים רק שברים 25-35 של דגימות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.</a>
איור משלים 3: קביעת שיא, חיסור רקע ואינטגרציה באמצעות תוכנת ניתוח. (א)נתונים מניתוח SAX-HPLC נטענים לתוך התוכנה (דקות 28-96) וכלי מנתח השיא נבחר. (B\u2012E) התוכנית הבסיסית מוגדרת באופן ידני על-ידי הגדרת נקודות בין שיאים בודדים והרקע חסר. (F)פסגות נקבעות באופן ידני על בסיס מראה ופורסם ניידות כרומטוגרפית5,,7. (G) טווחי שיא מוגדרים באופן ידני על-ידי ערכי cpm. (H)פסגות משולבות ומחושבות כ% מכל הפסגות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.</a>

כאן אנו מתארים חילופי אניון חזקים כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים של [3H]-מיו-אינוזיטול תווית שתילים אשר היא שיטה רגישה מאוד כדי לזהות ולכומת פוליפוספטים אינוזיטול בצמחים.

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

הפרוטוקול המודגם כאן יכול לעזור להחריג את הביוסינתזה של אינוזיטול פוליפוספטים של צמחים ול לענות על שאלות לגבי תפקידם בהיבטים מסוימים של חילוף החומרים וההתפתחות של הצמח. שיטה זו רגישה מאוד מכיוון שהשימוש במבשר הרדיואקטיבי של אינוזיטול פוספטים מאפשר זיהוי אמין של כל מיני הפוספט אינוזיטול בצמחים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה מכיוון שרוב הביולוגים הצמחיים אינם מכירים את ניתוח HPLC ואת ההתקנה הדרושה.בנוסף, צעדים קריטיים של פרוטוקול זה, כמו החילוץ של אינוזיטול פוספטים, קשה לעקוב ללא הדגמה נאותה. התחל בהגדרת מערכת המורכבת משתי משאבות HPLC עצמאיות, אחת עבור מאגר A ואחד עבור מאגר B.Two משאבות צריך להיות נשלט יחד באמצעות מחשב או משאבת אב. יש ליישם שטיפת חותם בוכנה עבור שתי המשאבות, בין אם באמצעות כוח כבידה או באמצעות משאבת לחץ נמוך שלישית.חבר את שתי המשאבות למיקסר דינמי, ולאחר מכן חבר את המיקסר לשסתום הזרקה עם לולאת דגימה בעלת קיבולת מיליליטר אחת לפחות. השתמש נימים כדי לחבר את שסתום ההזרקה לעמודה ואת העמודה לאספן השבר. לזרוע זרעי לוטוס בשורה אחת על מנות פטרי מרובע מלא מדיה צמיחה מוצקה המורכבת 0.8% אגר בקטריולוגי במים deionized.אפשר לזרעים לשכבות לפחות שלושה ימים בארבע מעלות צלזיוס בחושך. מניחים את הזרעים באינקובטור צמיחה. העבר 10 עד 20 שתילים לתוך באר אחת של צלחת תרבות תאים תחתונה שטוחה 12 היטב מלא שני מיליליטר של תוסף מלח MS חצי כוח כי הוא בתוספת 1% סוכרוז ומותאם pH 5.7.מוסיפים לצלחת 45 מיקרו-קוורי של מיו-אינוזיטול 3H ומערבבים אותו בעדינות. מכסים את הצלחת במכסה ואוטמים אותה בקלטת כירורגית מיקרופורית. ואז למקם אותו בחזרה לתוך חממת הצמיחה.לאחר חמישה ימים של תיוג, להסיר שתילים מהתקשורת ולשטוף אותם בקצרה עם מים deionized. מייבשים אותם במגבות נייר ומעבירים אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, ומוודאים לא למילוי יתר של הצינור. הצמד להקפיא את הצינור בחנקן נוזלי ולאחסן אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס עד החילוץ.קח את הדגימות מהמקפיא ולשמור אותם בחנקן נוזלי עד מוכן לשימוש. טוחנים אותם עם עלה צינור מיקרוצנטריפוגה עד שהם מתחילים להפשר, ואז מוסיפים 500 מיקרוליטרים של חיץ מיצוי קר כקרח. ממשיכים לטחון עד שהדגימה הומוגנית והפתרון נצבע.צנטריפוגה הדגימות במשך 10 דקות ב 18, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. ואז להעביר את supernatant לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר. הצינורות המשמשים לחילוץ נחשבים לפסולת רדיואקטיבית מוצקה ויש להיפטר מהם בהתאם.בזהירות להוסיף 300 microliters של חיץ נטרול לתמצית, אשר מיד יגרום משקעים של חלבונים מבעבע. לאחר דקה, מערבבים את המדגם עם טיפ פיפטה ופיגט חמישה מיקרוליטרים על נייר pH כדי לוודא כי ה- pH הוא בין שבע לשמונה. במידת הצורך, להוסיף כמויות קטנות של חיץ נטרול או חיץ החילוץ עד pH הרצוי הוא הגיע ולתת את הדגימות לנוח על הקרח לפחות שעה אחת עם מכסה פתוח.ואז צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לתוך צינור טרי 1.5 מיליליטר. לצייד את אספן שבר עם 96 בקבוקונים scintillation קטן ולמלא כל בקבוקון עם שני מיליליטר של קוקטייל scintillation מתאים כי הוא תואם מאגרי pH נמוכים ריכוזי אמוניום פוספט גבוה. הפעל את מערכת HPLC ולאחר מכן הפעל את שטיפה חותם הבוכנה ולשמור אותו מופעל במהלך כל הריצה.להזריק באופן ידני את המדגם עם מזרק מתאים. הפעל את המשאבות ואת המילוי ההדרגתי. בזמן שהפעלת HPLC נמשכת, בדוק את הלחץ באופן קבוע.הלחץ ההתחלתי צריך להיות סביב 18 עד 24 בר צריך לאט לעלות ל 50 עד 60 בר פעם 100%מאגר B הוא הגיע. לאחר הריצה, סגרו את הבקבוקונים בחוזקה ובמרץ לנער את השברים עם קוקטייל scintillation לערבב. אם לא להמשיך ישירות עם המדידה, לשמור את הבקבוקונים במצב זקוף בחושך.כדי למדוד את השברים, הכנס את הבקבוקונים לתוך ארונות התקשורת של מונה ההיתוך באמצעות מתלים שמתאימים לבקבוקונים הקטנים ולמדוד כל בקבוקון במשך חמש דקות בדלפק תכלת נוזלי. הכן תרשים קו דו-ממדי שבו הספירות הנמדדות לדקה או CPM מותוות כנגד זמן השמירה. כדי להשוות דגימות זו עם זו, נרמל את הנתונים על-ידי סיכום העלות לאלף חשיפות מכל שבר בודד מדקה 25 עד 96 עבור כל מדגם בודד ועל-ידי חלוקת העלות לאלף חשיפות הכוללת מדגם זה לפי העלות הכוללת של הדוגמאות האחרות.כדי לבצע כימות יחסי של פסגות פוליפוספט אינוזיטול מסוימות ולאחר מכן ליצור גרפי עמודות המכילים נתונים של שכפולים לניתוחים סטטיסטיים, להמשיך את הניתוח עם תוכנה מיוחדת שיכולה לחשב אזורי שיא של כרומטוגרמות. ספקטרום אינוזיטול פוליפוספט שלם המתקבל מתמציות A.thaliana לאחר ספירת נבלות מוצג כאן. הפסגות מופרדות יפה ו ניתן להקצות אותן לאיסומרים שונים.כאשר נעשה שימוש בעמודה מיושנת, ניכרת הפחתה ברורה של אינוזיטול הקסאקיפוספט והיעדר אינוזיטול פירופוספט. ניתוח SAX-HPLC בוצע גם על שתילי L.japonica שגודלו ותויגו באותם תנאים כמו שתילי Arabidopsis. בעוד ככל הנראה כל מיני אינוזיטול פוליפוספט ופסגות הידועים מן Arabidopsis ניתן לראות, ישנם הבדלים בכמויות היחסיות של isomers אינוזיטול פוליפוספט ספציפי בין שני המינים.כדי להוכיח כי אין לנתח דגימות מיד לאחר החילוץ, דגימה אחת פוצלה לשניים וחצי ממנו נותחה למחרת לאחר אחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. ההבדלים בין פרופילי SAX-HPLC של הדגימות הטריות והקפאות לא היו משמעותיים, מה שמוכיח כי מחזור הפשרת הקפאה אחד אינו פוגע בדגימה וכי השיטה עצמה מייצרת תוצאות לשחזור. בעת ניסיון פרוטוקול זה, תמיד לטחון את הדגימות ביסודיות, קפוא עם מאגר החילוץ, ולכוון קרוב pH ניטרלי לאחר נטרול כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של רדיו שכותרתו אינוזיטול פוספט לניתוח SAX-HPLC.ניתן לטהר רדיו שכותרתו מתוך SAX-HPLC לרוץ לשימוש מאוחר יותר, למשל בתגובות הדדיות על ידי איסוף שברים ללא קוקטיילים scintillation ומדידת aliquots קטן בלבד.

extraction-quantification-soluble-radiolabeled-inositol

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

Pyrophosphates אינוסיטול לשחק תפקיד חשוב פתולוגיות אדם כגון סרטן, סוכרת, והשמנה, אך מנגנון הפעולה המדויק אינו עניין של מחלוקת. חוסר pyrophosphates אינוסיטול זמינים מסחרית הופכת מחקרים מפורטים בעייתי. כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לייצר ולבודד מיליגרם של pyrophosphates אינוסיטול.

הכנת Pyrophosphates אינוסיטול איכות

פרוטוקול זה ידגים מיצוי וניתוח של חומצות שומן ביו-אקטיביות חופשיות ואסטריות מהתאים. חומצות שומן מכומתות במדויק באמצעות דילול איזוטופים יציב, כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית, לכידת אלקטרונים, יינון כימי אטמוספרי, ספקטרומטריית מסה לניטור תגובות מרובות (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

ביומסה במפעל מציע משאב מתחדש למספר רב של מוצרים, כוללים דלק, מזון, מזון ומגוון רחב של חומרים. במאמר זה אנו לחקור את המאפיינים של עץ טבק (Nicotiana glauca) ומקורות מתאימים כמו צפצפה לצינור biorefinery.

תמליל והמטבוליט Profiling להערכת של טבק ועץ צפצפה כחומר גלם לתעשייה המבוססת על ביו

פרוטוקול זה מפרט את המיצוי האופטימלי של נוזל כביסה אפופלסט מעלי צמחים, תוך שימוש בצמחי שעועית צרפתית (Phaseolus vulgaris) כדוגמה למודל.

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש Vulgaris Phaseolus כדוגמה

Phosphoinositides מאותת שומנים שיחסית שפע במהירות משתנה בתגובה לגירויים שונים. מאמר זה מתאר שיטה למדידת השפע של phosphoinositides ידי תאים מטבולית תיוג עם -inositol מיו 3 H-, ואחרי חילוץ וdeacylation. glycero-inositides חולץ אז מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים ולכמת ידי זרימת נצנץ.

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

כאן, אנו מתארים בפירוט רב פרוטוקול מבוסס וחזק למיצוי גלוקוזינולטים מחומרים צמחיים טחונים. לאחר טיפול בסולפטאז על העמודה של התמציות, הדסולפוגלוקוזינולטים נפלטים ומנותחים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה.

שיטה פשוטה עבור Glucosinolate הפקה וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC)

פרוטוקול מיצוי מקיף של שומנים, מטבוליטים חלבונים מ רקמות ביולוגיות באמצעות מדגם אחד מוצג.

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

כאן, אנו מציגים בפרוטוקול כדי לכמת ויגדיר לכל מין ספינגומיילין באמצעות ניטור התגובה מרובים ומצב MS/MS/MS, בהתאמה.

שיטת ואיכותני ספינגומיילין מאת LC-MS באמצעות שני אורווה Isotopically שכותרתו מינים ספינגומיילין

פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של חלבונים התאגד כדי אינוזיטול פוספטים או פוספופנוסיידים. היא משתמשת בכרומטוזיקה באמצעות מלחי הביוטיטול או פוספופנוסידים הנמצאים בדרך streptavidin לחרוזים או חרוזי מגנטים. אינוזיטול פוספט או פוספוליזיסיטייז מחייב חלבונים מזוהים על ידי בלוק מערבי או ספקטרומטריה מאסיבית.

זיהוי של אינוזיטול פוספט או זרחן אינטראקציה חלבונים על-ידי כרומטוגרפיה של אהדה מצמידים לאבן חשופה מערבית או ספקטרומטר המסה

שיטה מדויקת הניתנת לשחזור לכימות נוקלאוזידים/נוקלאוטידים בצמחים מתוארת כאן. שיטה זו משתמשת ב- HPLC-MS/MS.

הכנת דגימת צמח למדידת תוכן נוקליאוסיד/נוקלאוטידים עם HPLC-MS/MS

מתואר הליך לאלקטרופורזה נימית אלקטרופורזה ספקטרומטריית מסת יינון עבור הכמות המוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים מתמציות תאי יונקים.

כמות מוחלטת של אינוזיטול פירופוספטים על ידי אלקטרופורזה נימית אלקטרוספריי ספקטרומטריית מסה יינון

למדו שיטת SAX-HPLC לזיהוי וכימות פוליפוספטים לאנוזיטול בצמחים באמצעות תיבול רדיו. הפרוטוקול מספק רגישות גבוהה לניתוח מטבוליזם צמחי ותהליכי פיתוח.

מיצוי וכימות של פוליפוספטים לאנוזיטול מסיסים עם תיבול רדיו ממין צמחי שונים באמצעות SAX-HPLC

גלה סרטונים נוספים