Name: מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: למד ליצור מודל קסנוגרפט ממטופל ללימוד מומים ורידיים באמצעות תאי אנדותל ממטופלים. שיטה זו מאפשרת ניטור יומיומי של צמיחת התאים ותגובה לטיפול ניסיוני בחולדות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לנורה לייקס על ההגהה. מחקרים שדווחו בכתב יד זה נתמכו על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם, תחת פרס מספר R01 HL117952 (E.B.), חלק מהכונים הלאומיים לבריאות. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+malformation%3A+update+on+aetiopathogenesis%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Phlebology%3A+The+Journal+of+Venous+Disease%22%5BJournal%5D)">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li>
<li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li>
<li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).</li>
<li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li>
<li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+%28PDX%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889(2019).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen%2C+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).</li>
<li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen%2C+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).</li>
<li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li>
<li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li>
<li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xenograft+model+for+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li>
<li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li>
<li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל של VM. מודל murine זה מציג מערכת מצוינת המאפשרת לחוקרים להשיג הבנה עמוקה יותר של הגדלת לומן פתולוגית ויהיה אינסטרומנטלי בפיתוח טיפולים יעילים יותר ממוקדים לטיפול VM. זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור סוגים אחרים של חריגות כלי דם כגון מום ורידי נימים16. ישנם מספר צעדים החיוניים לדור המוצלח של נגעים כלי דם לשחזור. ראשית, תאי אנדותל הנגזרים ממטופל חייבים להיות טהורים (ללא נוכחות של סוגי תאים אחרים) וגדלים באופן אקספוננציאלי בזמן ההזרקה. מזהם פיב...

פגמים בהתפתחות כלי הדם הם הגורם הבסיסי למחלות רבות, כולל מום ורדי (VM). VM היא מחלה מולדת המאופיינת מורפוגנזה חריגה והרחבה של ורידים1. מחקרים חשובים על רקמת VM ותאי אנדותל (EC) זיהו מוטציות רווח-של-תפקוד בשני גנים: TEK, אשר מקודד את קולטן קינאז טירוסין TIE2, ו PIK3CA, אשר מקודד p110α (תת-יחידת קטליטית) איזופורם של PI3-kinase (PI3K)2,,3,,4,,5. מוטציות סומטיות אלה לגרום היפר-הפעלה עצמאית ליגנד של מסלולי איתות אנגיוגני/צמיחה מפתח, כולל PI3K / AKT, וכתוצאה מכך ורידים אקתטייםמורחבים 3. למרות תגליות גנטיות חשובות אלה, המנגנונים הסלולריים והמולקולריים הבאים המפעילים אנגיוגנזה חריגה והיווצרות של ערוצי כלי דם מוגדלים עדיין אינם מובנים במלואם.
במהלך אנגיוגנזה רגילה ופתולוגית, כלי חדשים צומחים מרשת כלי דם קיימת מראש ו-EC עוברים רצף של תהליכים תאיים חשובים כולל התפשטות, הגירה, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית (ECM) והווצרות לומן6. שניים ותלת מימדיים (2D/3D) בתרבויות המבחנה של EC הם כלים חשובים לחקור כל אחד ממאפייני הסלולר האלה בנפרד. אף על פי כן, יש דרישה ברורה עבור מודל העכבר recapitulating הרחבת כלי פתולוגי בתוך microenvironment המארח תוך מתן פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קלינית של תרופות ממוקדות למחקר תרגום.
עד כה, מודל murine transgenic של VM המשויך TIE2 רווח של פונקציה מוטציות לא דווח. מודלים הנוכחיים עכבר VM transgenic להסתמך על הביטוי בכל מקום או רקמה מוגבלת של המוטציה הפעלת PIK3CA p.H1047R3,5. בעלי חיים טרנסגנים אלה מספקים תובנה משמעותית על כל הגוף או רקמה ספציפית השפעות של מוטציה PIK3CA נקודה חמה זו. המגבלה של מודלים אלה היא היווצרות של רשת כלי דם פתולוגית מאוד וכתוצאה מכך קטלניות מוקדמת. לפיכך, מודלים אלה של העכבר אינם משקפים באופן מלא את המופע הספורדי של אירועי מוטציה ואופי מקומי של פתולוגיית VM.
להיפך, מודלים xenograft נגזר המטופל מבוססים על השתלה או הזרקה של רקמה פתולוגית או תאים נגזר מחולים לעכברים immunodeficient7. מודלים Xenograft הם כלי רב עוצמה כדי להרחיב את הידע על התפתחות מחלות וגילוי של סוכנים טיפוליים רומן8. בנוסף, שימוש בתאים הנגזרים ממטופל מאפשר למדענים להפיק מחדש הטרוגניות מוטציה כדי לחקור את הספקטרום של פנוטיפים המטופל.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול שבו מטופל נגזר VM EC אשר מבטאים צורה מוטציה פעילה באופן זמני של TIE2 ו / או PIK3CA מוזרקים תת עורית בחלק האחורי של עכברים עירום אתימי. תאי כלי דם מוזרקים מושעים במסגרת ECM על מנת לקדם אנגיוגנזה כמתואר בדגמים xenograft כלידם קודמים 9,10,11. אלה VM EC לעבור מורפוגנזה משמעותית וליצור מוגדל, כלי פתולוגיים סוטה בהיעדר תאים תומכים. מודל xenograft המתואר של VM מספק פלטפורמה יעילה להערכה פרה-קולינית של תרופות ממוקדות על יכולתם לעכב התרחבות בלתי מבוקרת של לומן.

<table><tbody><tr><td>עכברים עירומים אתימיים, (Foxn1-nu); 5-6 שבועות, זכרים</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>הזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>ביוטינילציה Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>מסנן עליון בקבוק (500 מ"ל; 0.2 ומיקרו; M)</td> <td>תרבית תאים תרמו פישר</td><td>974106</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>תרבית תאים; ניתוח היסטולוגי</td></tr><tr><td>סידן קלוריד דיהידראט (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>קליפר</td><td>מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי</td><td>50996491</td><td>מדידת פקק נגע</td></tr><tr><td>CD31-חרוזים מגנטיים מצומדים (Dynabeads)</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>הפרדת EC</td></tr><tr><td>מסננת תאים (100 &mu; M)</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>קולגנאז A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>צינור חרוטי ; פוליפרופילן (15 מ"ל)</td><td>גריינר</td><td>07 000 241</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>צינור חרוטי ; פוליפרופילן (50 מ"ל)</td><td>גריינר</td><td>07 000 239</td> צנצנת צביעה של <td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>קופלין</td><td>טד פלה</td><td>21029</td><td>אנליזה</td></tr> <tr>היסטולוגית<td>Coverglass (50 X 22 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagent (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>שינוי מדיום הנשר של דולבקו (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>הפרדת EC</td></tr><tr><td>אגרוף אוזניים</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>הזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M, pH 8.0)</td> <td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>גידול תאי אנדותל Medium-2 (EGM2) Bulletkit (מדיום בסיסי ותוספי מזון)</td> <td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Eosin Y (על בסיס אלכוהול)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td> סרום בקר עוברי <td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>(FBS) , HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td> קצה מסנן <td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>1,250 &mu; L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td> קצה מסנן <td>מרובה שלבים</td></tr><tr><td>20 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td> קצה מסנן <td>מרובה שלבים</td></tr><tr><td>200 &mu; L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה חוצצת פורמלין מרובת שלבים (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>דיסקציה של פקק נגע</td></tr><tr><td>Hemacytometer (INCYTO; חד פעמי)</td> <td>SKC FILMS</td><td>DHCN015</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>המטוקסילין</td><td>וקטור המטוקסילין</td><td>H-3401</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>חלבון מטוהר פלזמה אנושית פיברונקטין (1 מ"ג/מ"ל)</td><td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>תמיסת מי חמצן (30% w/w)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td> <td>ImageJניתוח</td></tr><tr><td>איזופלורן, USP</td><td>Akorn בריאות בעלי חיים</td><td>59399-106-01</td><td>הזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט הפטאהידרט (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת קרום מרתף תרבית תאים (פנול ללא אדום; ללא LDEV)</td><td>קורנינג</td><td>356237</td><td>הזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>EC הפרדת</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שקופית סופרפרוסט (75 מ"מ X 25 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1255015-CS</td><td>מחטי אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>, 26G x 5/8 אינץ' Sub-Q מחטים סטריליות</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>הזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>רגילה סרום סוסים</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין-L-גלוטמין (100X)</td><td>קורנינג</td><td>30-009-CI</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה קבוע (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>עלי גודל C, רגיל</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>3431F55</td><td>EC בידוד</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ תמיסת מלח (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>סולם תרבית תאים</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>הזרקה תת</td></tr><tr><td>עורית פיפטות סרולוגיות (10 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>תרבית</td></tr><tr><td>תאים פיפטות סרולוגיות (5 מ"ל)</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>נתרן פחמתי (Na2CO3)</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>תרבית</td></tr> <tr><td>תאיםסטרפטווידין, חזרת פרוקסידאז, תרכיז, עבור IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td> מזרק <td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>(60 מ"ל)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>מסנן מזרק תרבית Cel</td></tr><tr><td>(0.2 ומיקרו; M)</td> מזרקי <td></td><td>תרבית תאים</td> <td>431219 קורנינג</td></tr><tr><td>(1 מ"ל עם Luer Lock)</td><td>בקטון דיקינסון (BD)</td><td>BD-309628</td><td>הזרקה תת עורית</td></tr><tr><td>צלחת מטופלת בתרבית רקמות (100 X 20 מ"מ)</td><td>גריינר</td><td>664160</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>צלחת מטופלת בתרבית רקמות (145X20 מ"מ)</td><td>גריינר</td><td>639160</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>צלחות שטופלו בתרבית רקמות (60X15) מ"מ</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>טריס-בסיס (בסיס טריזמה)</td><td>סיגמא</td><td>T6066</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה (0.4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>טריפסין EDTA, 1X (0.05% טריפסין/0.53 מ"מ EDTA)</td><td>קורנינג</td><td>25-052-Cl</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Biorad</td><td>170-6531</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr><tr><td>בקבוק Wheaton</td><td>VWR</td><td>16159-798</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td>אנליזה היסטולוגית</td></tr></tbody></table>

מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

מום ורידים (VM) היא אנומליה כלי דם הנובעת מהתפתחות לקויה של הרשת ורידים וכתוצאה מכך ורידים מורחבים ולעתים קרובות תפקודיים. מטרת מאמר זה היא לתאר בקפידה את הקמתו של מודל xenograft murine המחקה VM אנושי והוא מסוגל לשקף הטרוגניות המטופל. Hyper-activating לא בירושה (סומטי) TEK (TIE2) ומוטציות PIK3CA בתאי אנדותל (EC) זוהו כנהגים העיקריים של הגדלת כלי פתולוגיים ב VM. הפרוטוקול הבא מתאר את הבידוד, הטיהור וההרחבה של EC הנגזר ממטופל המביעים מוטציה TIE2 ו/או PIK3CA. EC אלה מוזרקים תת עורית לתוך החלק האחורי של עכברים אתיים immunodeficient כדי ליצור ערוצים כלי דם אקטוטיים. נגעים שנוצרו עם TIE2 או PIK3CA-מוטציה EC הם כלי דם באופן ניכר בתוך 7\u20129 ימים של הזרקה ולתווך מחדש תכונות היסטופתולוגיות של רקמת חולה VM. מודל VM xenograft זה מספק פלטפורמה אמינה לחקור את המנגנונים הסלולריים והמולקולריים המניעים היווצרות VM והרחבה. בנוסף, מודל זה יהיה אינסטרומנטלי עבור מחקרי תרגום בדיקת היעילות של מועמדים לסמים רומן במניעת הגדלת כלי חריג לראות VM האנושי.

פרוטוקול זה מתאר את התהליך של יצירת מודל xenograft murine של VM בהתבסס על הזרקה תת עורית של EC נגזר החולה לתוך הגב של עכברים עירומים immunodeficient. מושבות תא אנדותל ניתן לקצור בתוך 4 שבועות לאחר בידוד תאים ראשוניים רקמת VM או דם נגע(איור 1A, B). יום לאחר ההזרקה, תקע הנגע xenograft מכסה שטח פנים של כ 80\u2012100 מ"מ2. בידיים שלנו, תקעים נגע עם TIE2/PIK3CA-מוטציה EC הם כלי דם באופן ניכר וsperized בתוך 7\u20129 ימים מן הזרקה 14,,15 (<st...

אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל קסנוגרפט murine של מום ורדי. מודל זה מבוסס על הזרקה תת עורית של תאים אנדותל נגזר המטופל המכיל HYPER-activating TIE2 ו / או מוטציות גן PIK3CA. נגעים Xenograft מקרוב לסיכום התכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת חולה VM.

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת קסנוגרפטים שמקורם במטופלים, המאכלסים מחדש את ההיסטופטולוגיה של מומים הוורידיים. זה הורשה עוד יותר לשאת את הבדיקות הטיפוליות הקדם קליניות שלנו. טכניקה זו מספקת מערכת NVivo מהירה ואמינה המאפשרת ניטור יומי של הצמיחה של תאי אנדותל ישירים למטופל ואת התגובה לטיפול ניסיוני.שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות כדי לחקור סוגים אחרים של אנומליות כלי דם או הלימפה. התחל על ידי הכנת ההשעיה התא להזרקה. טריפסיניזציה של תאי ה אנדותל עם חמישה מיליליטר של 0.05% מחומם מראש-tripsin-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.לנטרל את הנסיעות ועל ידי הוספת חמישה מיליליטר של EGM ולאסוף את התאים לתוך צינור חרוט 150 מיליליטר. צנטריפוגה זה 400 פעמים G במשך חמש דקות ואז לשאוף את supernatant ולתלות את התאים בשלושה מיליליטר של EGM. לספור את התאים עם המוציטומטר.סיכון נפח עם מספר התא הרצוי לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר גלולה התאים שוב על ידי צנטריפוגה. שאפו את העל-טבעי והשאירו נפח קטן כדי לשחרר את גלולת התא. תן שימוש חוזר לכדור התא עם 220 מיקרוליטרים של BMEM לכל זריקה.מערבבים את ההשעיה התא ביסודיות על הקרח הקפדה להימנע מיצירת בועות. שאף את תרבות התאים BMEM לערבב לתוך פתיחת מזרק מיליליטר אחד על ידי משיכת הבוכנה. אתה תנעל מחט סטרילית 26 מד למזרק ולשמור את המזרקים מוכנים שטוח על קרח לפני ההזרקה.לאחר הבטחת העכבר יש הרדמה כראוי למקם אותו על הבטן שלה לחטא את אזור ההזרקה עם 70%אתנול. מגלגלים בעדינות את המזרק המוכן כדי לעכל מחדש את כל התאים המיושבים. פתית בועות עד סוף המזרק ולגרש נפח קטן של ההשעיה התא.צבוט את העור באתר ההזרקה כדי ליצור אוהל כמו מבנה. ואז להכניס את המחט ממש מתחת לעור ולוודא כי המחט היא רק עור עמוק על ידי שחרור עור צביטה כדי למנוע הזרקה לתוך רקמת השריר. מחזיק את המחט בהתמדה להזריק 200 microliters של ההשעיה התא כדי ליצור מסה כדורית קטנה.יש לדאוג כדי למנוע הזרקת ההשעיה התא לתוך השריר. למדוד את האורך והרוחב של כל תקע עם caliper. יישר את תקעי הקסנוגרפט המנותלים על קרש חיתוך ליד סרגל וקח תמונה כדי לתעד את כלי הדם הגולמיים של הנגעים.לאחר מכן תקן את התקעים על ידי שקוע אותם 10% פורמלין לילה בטמפרטורת החדר. לאחר הניתוח, תקעי הנגע מעובדים לניתוח היסטולוגי ומוכתמים עבור UEA-1 כדי לזהות תאים אנדותל שמקורם בבני אדם בתוך התקע. קח חמש תמונות HPF לכל קטע נגע עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה של 20 X בתבנית מישור X בתוך מקטע ההנעה כדי למנוע חפיפה.הקפד לכלול סרגל קנה מידה בתמונות שצולמו. פתח את תמונות HPF בתמונה J.To את הפיקסלים של סרגל קנה המידה, השתמש בכלי הקו הישר ועקף את סרגל קנה המידה. לאחר מכן המירו את הפיקסלים שנמדדו למילימטרים על-ידי לחיצה על נתח וגדיר קנה מידה.לאחר מכן לחצו על 'נתח מדידות מוגדרות' ובחרו אזור והוסיפו לשכבות-על. למדוד את שטח השדה הכולל של HPF באמצעות לנתח ולמדוד שמירה של מדידה זו לכמות. שימוש בכלי בחירות היד החופשית מתאר ידנית את ערוץ כלי הדם החיובי UEA-1.לחץ על נתח ולמדוד כדי לכמת את האזור המתואר. למדוד את כל תעלות כלי הדם בתוך HPF. חזור על התהליך עבור חמשת HPF שצולמו בתוך כל מקטע והעבר את הערכים ל- Excel לצורך ניתוח נוסף.לאחר מכן לחשב את אחוז שטח כלי הדם וצפיפות כלי הדם על פי הוראות כתב היד. באמצעות פרוטוקול זה תקעי ההנעה עם תאי אנדותל מוטנטים היפראקטיביים TIE2 או PIK3CA הם כלי דם בעליל ומפרפרים בתוך שבעה עד תשעה ימים לאחר ההזרקה. תקעי ההנעה דומים מאוד לתכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת VM אנושית ותעלות כלי דם גדולות המיושרות על ידי שכבה דקה של תאי אנדותל גלויים.מבני כלי דם אלה מכילים בדרך כלל אריתוציטים המאשרים אנסטומוזיס תפקודי עם כלי הדם של העכבר המארח. כתמים אימונוהיסטוכימיים באמצעות Lectin UEA-1 הספציפי האנושי מאשר כי התאים רירית אזורי כלי הדם נגזרים תאים מושתלים אנושיים ולא כלי דם של העכבר. בעקבות הליך זה, כתמים נוספים של מקטעי הנגע עבור סמנים של התפשטות או אפופטוזיס ניתן לבצע כדי לנתח השפעות ספציפיות של טיפולים ניסיוניים.מודל scenographic זה שימש למחקרים פרה-קליניים של טיפולים חדשים עבור מום ורידי, כגון מעכב mTOR rapamycin, אשר הראה יעילות במספר ניסויים קליניים עבור חולי VM.

a-patient-derived-xenograft-model-for-venous-malformation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון זה, תאי מלנומה שמקורם בבני אדם מושתלים באופן תת-עורי באזור האגף של עכבר מדוכא חיסון. מודל PDX מאפשר חקירה פרה-קלינית של תאי מלנומה המשחזרים טוב יותר את ההטרוגניות של הגידול ואת אגרסיביות המלנומה שנצפתה בתנאי in vivo.

מידול Xenograft הנגזר מהמטופל: טכניקה ליצירת מודלים של עכברי מלנומה

אנו מתארים שיטה ליצירת מודל אמין של יתר לחץ דם ורידים במוח בעכבר הבוגר. מודל זה תואר בהרחבה ונבדק בחולדה. עמית החדש בעכברים פותח את האפשרות של שימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטיים ובכך מרחיב את היישומים של המודל.

למבוגרים עכבר ורידי יתר לחץ דם דגם: עורק תרדמה משותף לחיצוני הצוואר וריד השקה.

כלי דם הוא מפתח לגישות בהנדסת רקמות מוצלחת. לכן, טכנולוגיות אמינות נדרשות כדי להעריך את ההתפתחות של רשתות כלי דם ברקמות מבנים. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, יעיל וחסכונית כדי לחזות ולכמת כלי דם בגוף חי.

עור מלא פגמים דגם להערכת כלי דם של Biomaterials<em&gt; בVivo</em

כדי לשפר את הידע של היווצרות neotissue תאית ומולקולרית שלנו, מודל עכברי של TEVG פותח לאחרונה. השתלים הושתלו שתלי כחציצת וריד נבוב infrarenal בעכברי C57BL / 6. מודל זה משיג תוצאות דומות לאלה שהושגו בחקירה הקלינית שלנו, אבל לאורך זמן כמובן הרבה מקוצר.

השתלה של וריד נבוב חציצת שתל נחותה בעכבר דגם

אנו מתארים גישה מיקרו עבור הדור של בלופ arteriovenous (AV) כמודל לניתוח כלי דם in vivo בסביבה מבודדת היטב מאופיין. מודל זה הוא לא רק שימושי עבור חקירת אנגיוגנזה, אלא גם מתאים באופן אופטימלי עבור הנדסה vascularized axially ורקמות להשתלה.

Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם

סרטון זה מדגים מודל לחקר התפתחות היפרפלזיה מיואינטימלית לאחר ניתוח אינטרפוזיציה ורידית בחולדות.

וריד ביון דגם: מודל מתאים ללמוד patency מעקף

המטופל נגזר מבע (pdx) דגמים נוספים ביותר בסדר מלנומה מולקולרית תכונות ביולוגיות, הם ניבוי יותר של תגובת הטיפול לעומת רקמה פלסטית מסורתית התרבות מבוסס assays. כאן אנו מתארים את פרוטוקול ההפעלה הסטנדרטית שלנו להקמת דגמי PDX חדשים ואפיון/ניסויים של דגמי PDX קיימים.

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

Aortocaval פיסטולה נוצר על ידי לפרוץ את העורקים מורנה אינפרא כליות באמצעות שני הקירות לתוך הורקאווה הנחותים ולאחר מכן הבריאה של היצרות בתוך הזרימה שלה באמצעות הארכה חלקית של האובורד הנחותים. מודל זה ניתן לשימוש כדי ללמוד היצרות הורידים המרכזי.

מודל מורנה של היצרות הורידים המרכזית באמצעות Aortocaval פיסטולה עם היצרות זרימה יוצאת

הפרוטוקול הנוכחי שואפת ניסויים ליצור היפרפלזיה של הוורידים ורידים על ידי הקרבת ורידים ללחץ דם עורקי לפיתוח אסטרטגיות להחליש את היפרפלזיה בתוך ורידים בעקבות ניתוח revascularization באמצעות שתלי וריד.

ורידי ארנב מודל האינטרפוזיציה מחקה ניתוח מחדש באמצעות שתלי וריד כדי להעריך את היפרפלזיה באמצעות לחץ דם עורקי

אנו מתארים מודל עכבר xenograft של גרורות במוח של סרטן השד שנוצרו באמצעות הזרקת ורידים בזנב של קו תאי סרטן שד דלקתי מוגבר אנדוגניים HER2.

מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

בפרוטוקול זה, השתלת מעקף ורידים חזיר חדשה בוצעה דרך חתך קטן בדופן החזה השמאלית ללא מעקף לב-ריאה. נעשה מחקר פתולוגי לאחר הניתוח, שהראה עיבוי אינטימי.

הקמה והערכה של מודל מחלת השתלת ורידים חזיריים

למד ליצור מודל קסנוגרפט ממטופל ללימוד מומים ורידיים באמצעות תאי אנדותל ממטופלים. שיטה זו מאפשרת ניטור יומיומי של צמיחת התאים ותגובה לטיפול ניסיוני בחולדות.

מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

גלה סרטונים נוספים