Name: הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: למד הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית. שיטה זו מאפשרת צפייה במבנים אנטומיים ללא פגיעה ברקמות ובאיברים בדגימות שלמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

כל זה לא היה אפשרי ללא תמיכתו של נאצר רוסאן. אני רוצה להודות לדאג מוריס, דניאל דונהיו וברנדה קלונברג ממתקן הדמיית העכברים של NIH ובן אצ'ה ממיקרו פוטוניקס על האימונים והדיון המועיל. אני גם מודה למנסורה נורוזי ראד מזאייס על סריקת דגימות בטן בקסרדיה 520 ורסה. גם לורן סמית', סמנתה סמית ורייצ'ל אנג עזרו בסריקה. מייק מארש ממערכות מחקר אובייקטים סיפק תמיכה טכנית שפירית. אני גם אסיר תודה על התמיכה של מכון הלב, הריאות והדם הלאומי (1K22HL137902-01) וקרנות סטארט אפ מאוניברסיטת ויומינג. אני גם מודה לסוקרים האנונימיים על ההצעות וההערות המועילות שלהם.

המחבר אינו מצהיר על אינטרסים מתחרים או פיננסיים.

הדמיית Drosophila melanogaster שלם בכל השלבים ההתפתחותיים נותרה אתגר, בעיקר בשל חוסר תאימות של מיקרוסקופיה אור עם עבה, פיגמנט חותך נמצא בחיה זו. בעוד שיטות הדמיה של בעלי חיים שלמים אחרות, כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) ו ultramicroscopy בשילוב עם ניקוי רקמות שימשו בהצלחה זבובים50,51,52,53,54, μ-CT מציג מספר יתרונות שהופכים אותו אידיאלי עבור הדמיה חיה שלמה של אורגניזם זה13,15,30 . צילומי רנטגן חודרים בקלות את החתך הפיגמנטי ואורך הגל הקטן שלהם מאפשר הדמיה תת-מיקרונית. תיוג דורש השקעה מינימלית בכימיקלים זמינים נרחבים וללא כישורי ספסל מיוחדים13. סורקי μ-CT זמינים גם הם מסחרית, והעלויות דומות לפלטפורמות מיקרוסקופיות קלות, ובמקביל אטרקטיביות יותר למגוון רחב יותר של דיסציפלינות (גיאולוגיה, פליאונטולוגיה, הנדסה וכו ') שיכולות גם ליהנות לזמינותה במוסד. ניתן להשתמש במקורות רנטגן סינכרוטרון גם להדמיית μ-CT ברזולוציה גבוהה של חרקים קבועים וחיים31,55,56, אך הם נגישים פחות מסורקים מסחריים.
פרוטוקול זה מספק דרך יעילה להשיג תמונות μ-CT של מבוגרים מעופפים, גלמים, זחלים ועוברים תאיים. שים לב כי עבור רבים מהצעדים המתוארים לעיל, ניתן להחיל שיטות חלופיות גם כדי להכין דוגמאות להדמיה. מחקרים אחרים סיפקו השוואה מפורטת של של שלבי קיבעון, תיוג וייבוש שונים לשימוש בחרקים ואלה המעוניינים לאמץ טכניקה זו מוזמניםלהעריךאת היתרונות של כל גישה 1,4,13,29,30,57. בעוד פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, כמה הצעות מועילות מוצגות.
ראשית, יש לנקוט זהירות בעת שיבוש חתך של דגימות שלמות, כך שבבית רקמות רכות אינן משובשות באופן משמעותי. חשוב לתת לשלבי זחלים ופופאלים מוקדמים לעבור קיבעון במשך שעתיים בפתרון של בוין לפני לחטט. זה יקשיח את הרקמה ויגביל את כמות המולימפ כי יהיה למטלג מתוך חורי נקב, אשר יכול לשנות את ארכיטקטורת האיברים. מקטעי גוף בודדים (ראש, בית חזה ובטן) של המבוגר ניתן להפריד אם המבנה של עניין ממוקמים שם. מומלץ להשתמש באזמל כדי לחתוך בצורה נקייה את המקטעים האלה במקום להפריד אותם עם מלקחיים, אשר יכול לשבש את הארכיטקטורה 3D של המעיים או מערכת העצבים המרכזית, למשל. באשר לתזמון, מבוגרים בדרך כלל צריכים רק 16 שעות. עבור קיבוע מלא, בעוד שלבים זחל וגופל צריך 24 שעות. כמו כן, אם כתמי יוד או PTA נראה לא אחיד, המדגם יכול להיות ממוקם בחזרה בתמיסה לדגור זמן רב יותר עד אפילו כתמים מושגת. לבסוף, דגימות hydrated לא צריך להיות ממוקם ב 4 °C (50 °F), כמו זה נראה לגרום להיווצרות של בועות אוויר בתוך חלל הגוף לאחר התחממות לטמפרטורת החדר.
שנית, הרכבה מדגם ישתנה לפי מכשיר, סוג שלב והאם המדגם צריך להישאר hydrated או כבר נקודה קריטית מיובשת. אם hydrated, להבטיח את המדגם לא לדלוף ואולי להרוס את הסורק. בעת הרכבת הדגימה בתוך קצה פיפטה, הקפידו לדחוף בעדינות עם חפץ קהה עד שהדגימות נתקלות בהתנגדות קלה ולא יכולות לזוז. לחיצה קשה מדי עלולה להוביל לעיוות בקצרה ולפגמים מבניים. כמו כן, ודא כי המדגם מיושר במחזיק קרוב ככל האפשר לציר הסיבוב. כל תנודה תגדיל את זמני הסריקה בשל שדה הראייה הגדול יותר ותפחית את הרזולוציה של טומוגרמה הסופית לאחר השחזור.
שלישית, הגדרות הסורק לרכישת תמונות הקרנה ישתנו גם הן לפי מכשיר. כדי למקסם את יכולות הרזולוציה של הסורק, גודל ספוט קרן הרנטגן צריך להיות קטן ככל האפשר (5-10 מיקרומטר). ניתן להשיג זאת על ידי איזון מתח רנטגן והגדרות זרם, כך שההספק הכולל הוא 3-4 W. עם הגדרות אלה וזמן החשיפה המתאים במצלמה, ניתן להשיג חיווי נכון של קרן הרנטגן על ידי הדגימה וניגודיות תמונה אופטימלית. השימוש במסנני אלומיניום או נחושת בין האובייקט למקור הרנטגן יכול לשמש לכוונון הגדרות אנרגיית הרנטגן האופטימליות לניגודיות התמונה הטובה ביותר או להחלשת הקרן מספיק כדי להשתמש במקורות בעלי עוצמה גבוהה יותר. באשר לרזולוציית התמונה, הדבר יהיה תלוי במשתנים רבים ושונים, כולל סוג כתם, מספר תמונות הקרנה, גודל פיקסל תמונה, מיקום המצלמה, תנועת הדגימה, תנודות הסורק ופרמטרים של שחזור. פנטום תבנית סרגל (QRM GmbH) המכיל סמני גודל ידועים יכול לסייע בהערכת רזולוציה מרחבית עבור הגדרת סורק ומצלמה נתונה.
כדאי גם להעריך את היתרונות של הדמיה נקודה קריטית מיובש או hydrated דגימות. Sombke ואח ' ביצע הערכה השוואתית של שתי השיטות ומצא ייבוש נקודה קריטית להיות מעולה עבור יישומי μ-CT מעורבים פרוקי רגליים30. עם זאת, היתרונות של דגימות hydrated הם כי בעלי חיים חשופים פחות חשיפה כימית ומכאנית שיכול להוביל הן כמותי ומורפולוגית. זה גם נוטה לשמר רקמות עדינות טוב יותר מאשר CPD. עם זאת, דגימות hydrated יש חיי מדף קצרים בהרבה צריך להיות התמונה לא יאוחר מחודש לאחר קיבעון מאז השפלת רקמות ואיכות תמונה מופחתת הופך ברור בשלב זה. כמו כן, הרזולוציה של דגימות hydrated יהיה קצת פחות מדגם מיובש נקודה קריטית, כי צילומי רנטגן חייבים לחדור גם דרך קצה פיפטה פלסטיק ואת הנוזל שמסביב (מים או חוצץ). דגימות מיובשות נקודה קריטית ניתן לשמר במשך פרקי זמן ארוכים בהרבה, במיוחד כאשר נשמר על Drierite. הם גם יכולים להיות ממוקמים ישירות בנתיב קרן הרנטגן פשוט על ידי הדבקת הכנפיים או הרגליים סיכת חרקים והצבתו על צ'אק הבמה, פישוט תהליך ההרכבה. עם זאת, התייבשות האתנול הנרחבת של דגימות אלה יכולה להוביל להתכווצות רקמות ואובדן ארכיטקטורת רקמות עדינה, ולכן חשוב לבצע מגוון של ריכוזי EtOH גוברים כדי למזער את ההשפעות האלה. עם זאת, יש לציין כי כל צורות הטיפול הכימי, כולל קיבעון paraformaldehyde ואפילו כתמי יוד יכול לגרום התכווצותרקמות 58,59. אף על פי שאף אחת מהשיטות לא תספק מדידות של 'גודל איברים בפועל' בזבוב חי, מדידות מורפוטיות עדיין תקפות בעת השוואת בעלי חיים מוטנטיים וטיפוסי בר כל עוד שלבי הקיבעון, הכתמים והייבוש מתבצעים באופן זהה עבור שתי קבוצות הדגימות – רצוי במקביל.
לסיכום, μ-CT מספק כלי הדמיה בעל חיים שלם שימושי עבור Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. מחקרים רבים אחרים הציגו את כוחה של טכנולוגיה זו להבנת היבטים שונים של טקסונומיה חרקים, אקולוגיה, פיזיולוגיה, פיתוח ואנטומיה שיכולים לעזור ליידע מחקרים עתידיים זבובים1,28,30,31,32,55,56,57 . בשילוב עם כלי מיקרוסקופיה גנטית ואור כבר בשימוש נרחב באורגניזם זה, μ-CT יכול למקם את עצמו בתוך צינור ניסיוני המאפשר הבנה עמוקה יותר בין גנוטיפ פנוטיפ.

שיטות הדמיה המאפשרות חקירה מפורטת של מבנים פנימיים של אובייקט מבלי להרוס את הארכיטקטורה התת-ממדית הכוללת שלו הוכיחו את עצמם כמועילות באופן נרחב למספר דיסציפלינות שונות, כולל פיזיקה, הנדסה, מדע החומרים, ארכיאולוגיה, פליאונטולוגיה, גיאולוגיה וביולוגיה1,2,3,4,5,6,7,8,9 . בין שיטות הדמיה לא הרסניות אלה, פלטפורמות מבוססות רנטגן שימושיות במיוחד בשל היכולת של צילומי רנטגן באנרגיה גבוהה לחדור סוגים וחומרים שונים רבים עם פיזור מינימלי בהשוואה לגלי אור נראים. טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (μ-CT), טומוגרפיה ננו-ממוחשבת (ננו-CT) ומיקרוטומוגרפיה של סינכרוטרון התגלו, אם כן, כטכנולוגיות העיקריות להדמיה מבוססת קרני רנטגן של דגימות הנעות בין מטרים למיקרונים, עם יכולות רזולוציה מילימטריות עד תת-מיקרון10,11,12,13,14.
בעוד פלטפורמות אלה שונות בעיצובן, בגיאומטריית קרני הרנטגן וברכיבים שלהן כדי לאזן בין גודל דגימה לרזולוציה, כולן מסתמכות על אותו עיקרון בסיסי ללכידת תמונה: מקור לצילומי רנטגן העוברים דרך האובייקט ונלכדים על ידי גלאי. חיכוך דיפרנציאלי של קרן הרנטגן כשהיא עוברת דרך דחיסויות שונות בתוך האובייקט יוצרת ניגודיות תמונה. נתונים תלת-ממדיים מתקבלים על ידי סיבוב המדגם או הגלאי, איסוף סדרה של תמונות הקרנה 2D כי הם משוחזרים לאחר מכן באמצעות אלגוריתמים לתוך טומוגרמה המכילה מידע 3D שהרזולוציה שלהם היא איזוטרופית x, y,z15. עבור סורקי μ-CT רבים המשתמשים בגיאומטריית רנטגן של קרן חרוט כדי להקרין צילומי רנטגן באובייקט שממוצל, אלגוריתם פלדקמפ משמש לשחזור מדויק של האובייקט עם שגיאות מינימליות16.
הרזולוציה של פלטפורמה נתונה נקבעת בעיקר על ידי פרמטרי מערכת כגון גודל קרן הרנטגן (גודל ספוט), גיאומטריית סורק (מרחק מאובייקט למקור רנטגן), גודל הפיקסלים בגלאי ואלגוריתם השחזור המועסק. גורמים נוספים, כגון תנודות סורק, תנודות קרן רנטגן, תנועת מדגם, סוג החומר או כתם כימי המשמש לדמיין את האובייקט יכול גם להשפיע באופן משמעותי על רזולוציה מרחבית תחת condidtions הדמיה בעולם האמיתי15.
עבור יישומים ביו-רפואיים, CT ו- μ-CT מילאו תפקיד מרכזי בקידום הבנתנו מנגנוני אנטומיה, פיזיולוגיה, פיתוח ומחלות, המשמשים ככלי הן לאבחנות המטופלים האנושיים והן כפלטפורמת הדמיה פרה-אקלינית עבור אורגניזמים מודל17,18. לדוגמה, קונסורציום פנוטיפינג הבינלאומי עכבר, שמטרתו לזהות את הפונקציה של כל גן בגנום העכבר, משתמש μ-CT כחלק צינור פנוטיפינגשלהם 19. התוצאות שלהם היו קריטיות להבנת גנים המעורבים בתהליכי התפתחות ומחלות, ובמקביל שימשו אטלס לאנטומיה ופיתוח שלעכברים 20. אורגניזמים מודל אחרים, כגון דגי זברה וחולדות, אימצו גם את השימוש μ-CT לביצוע פנוטיפינג של בעלי חיים שלמים של מספר מוטציותגנים 17,21,22,23.
היתרון של שילוב הדמיה של בעלי חיים שלמים עם אורגניזמים לדוגמה הוא שניתן לחקור באופן מלא הבנה מכנית של תפקוד הגנים לתהליך ביולוגי נתון. זה אפשרי בגלל הגנומים המאופיינים היטב וכלים גנטיים רבים הזמינים באורגניזמים מודל המאפשרים מניפולציה מדויקת של תפקוד הגנים בנקודות זמן התפתחותיות ברורות, רקמות ספציפיות, תאים בודדים, ואפילו אברונים תת-תאיים. אלה כוללים מערכות ביטוי בינאריות כגון מערכת UAS /GAL4 (ונגזרותיה הרבות), CRISPR/Cas9 ו- RNAi24,25,26. כאשר כלים גנטיים אלה משמשים בשילוב עם צינור הדמיה רב עוצמה המורכב ממיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה (פלואורסצנטית ולא פלואורסצנטית), והדמיה של בעלי חיים שלמים כגון μ-CT, הערכה יסודית של מולקולות, תאים, רקמות, איברים והאורגניזם כולו ניתן להשיג, המאפשר הבנה עמוקה הרבה יותר של תפקוד הגנים.
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש μ-CT באורגניזם המודל הלא יונקי Drosophila melanogaster, שכליו הגנטיים הרבים עזרו להדגיש מנגנונים מולקולריים רבים26,27. הוא אומץ מפרוטוקולים קודמים בחרקים שאינם מודל1,28,29,30,31,32, ובונה ממחקרים קודמים μ-CT בדרוסופילים כדי לקבוע פרוטוקול סטנדרטי לשימושו בחיה זו 33 ,34,35,36,37,38,39 ,40,41. השלבים להכנה מוצלחת של מדגם, הדמיה וניתוח של ערכות נתונים fly μ-CT באמצעות סורקים זמינים מסחרית מפורטים. עם פרוטוקול זה, ניתן לדמיין את כל השלבים ההתפתחותיים של הזבוב ברזולוציה גבוהה הן עבור מחקרים תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה, כולל טקסונומיה, אנטומיה, פיתוח, פיזיולוגיה ומחלה27. פרוטוקול זה יהיה שימושי גם להדמיה כמעט כל חרק ואפילו חומרים שאינם חיים הדורשים כתמים כימיים עבור ניגודיות תמונה כדי לשפר את ההדמיה על ידי μ-CT.

<table><tbody><tr><td>100% אתנול</td><td></td><td></td><td>לייבוש נקודה קריטית</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>לקיבוע בעלי חיים</td></tr><tr><td>מייבש</td><td></td><td></td> נקודות <td>קריטיות מייבש דגימות בשיטת הנקודה הקריטית; אפשרויות מרובות זמינות (Balzers CPD 020 או Leica EMCPD300)</td></tr> <tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>להדמיה ופילוח של מערכי נתונים של מיקרו-CT; בלוק</td></tr><tr><td></td><td></td><td>חום</td><td>https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html לצינורות מיקרופוגה</td></tr><tr><td>תחנת</td><td></td><td></td> עבודה לניתוח תמונה <td>צריכה להכיל מספיק זיכרון RAM וכרטיס גרפי איכותי לעיבוד תלת מימד</td></tr><tr><td>תמיסת יוד (I2KI)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>לצביעה</td></tr><tr><td>סורק טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>גיאומטריית רנטגן של קרן חרוט; הגלאי הוא מצלמת Hamamatsu 10 MP עם 11.54 ומיקרו; גודל פיקסל מ '.</td></tr><tr><td>תוכנת סורק טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת</td><td>Bruker</td><td></td><td>לשליטה בסורק עצמו (למשל, ביצוע תיקוני שדה שטוח, כוח צינור רנטגן, זמני חציית מצלמה, רכישה וכו')</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>לתקיעה חור בציפורן</td></tr><tr><td>NRecon תוכנת שחזור תמונה</td><td>Bruker</td><td></td><td>משמש לשחזור תמונות חתך מתמונות הקרנה דו-ממדיות שצולמו עם גיאומטריית רנטגן קרן חרוט</td></tr><tr><td>P10 קצות פיפט</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>הרכבה לדוגמא</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח Resarch מוצרים בינלאומיים</td><td>P32060-4000.0</td><td>לדלל ל-1X במים לפני השימוש</td></tr><tr><td>חומצה פוספוטונגסטית הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>79690-25 גרם</td><td>לצביעה</td></tr><tr><td>מחזיק סיכות</td> כלי <td>מדע עדינים</td><td>26018-17</td><td>לסיכות קטנות</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>111036</td><td>להסרת ציפוי שעווה מזבובים בוגרים (כ-0.5% PBST)</td></tr> <tr><td>מיקרוסקופ רנטגן</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 </td><td>גיאומטריית רנטגן של קרן חרוט Versa הכוללת עדשות אובייקטיביות של צלחת אזור פרנל עבור Resoluton במרחק (RaaD&trade;)</td></tr></tbody></table>

הדמיה חיה שלמה של drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

כלי הדמיה ביו-רפואיים מאפשרים חקירה של מנגנונים מולקולריים על פני קשקשים מרחביים, גנים ועד אורגניזמים. Drosophila melanogaster, אורגניזם מודל מאופיין היטב, נהנה משימוש במיקרוסקופיה אור ואלקטרון כדי להבין את תפקוד הגנים ברמה של תאים ורקמות. היישום של פלטפורמות הדמיה המאפשרות הבנה של תפקוד הגנים ברמה של האורגניזם השלם כולו ישפר עוד יותר את הידע שלנו על מנגנונים גנטיים. כאן מוצגת שיטת הדמיה מלאה של בעלי חיים המתארת את השלבים הדרושים כדי לדמיין את Drosophila בכל שלב התפתחותי באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (μ-CT). היתרונות של μ-CT כוללים מכשור זמין מסחרית וזמן מעשי מינימלי כדי לייצר מידע תלת-ממדי מדויק ברזולוציה ברמת מיקרון ללא צורך בשיטות ניתוח רקמות או ניקוי. בשילוב עם תוכנה המאיצה ניתוח תמונה ועיבוד תלת-ממדי, ניתן לבצע ניתוח מורפומטרי מפורט של כל מערכת רקמות או איברים כדי להבין טוב יותר מנגנוני פיתוח, פיזיולוגיה ואנטומיה הן למחקרי בדיקה תיאוריים והן למחקרי בדיקת השערה. על ידי שימוש בתהליך הדמיה המשלבת שימוש במיקרוסקופיה אלקטרונית, מיקרוסקופיה קלה ו- μ-CT, ניתן לבצע הערכה יסודית של תפקוד הגנים, ובכך לקדם את התועלת של אורגניזם מודל רב עוצמה זה.

איור 2 מציג תמונות של עובר, זחלי אינסטאר3, גלמים בשלב הבוגרים של פארה (P7), וזבוב מבוגר מוכתם ביוד ודמותו מיובשת במים באמצעות סורק ספסל מסחרי. שימור מעולה ואפילו כתמים של רקמות עדינות נראים לעין, ומאפשרים לזהות בקלות את כל האיברים העיקריים ולהשתמש בהם לניתוח מורפומטרי והדמיה תלת ממדית.
בדרך כלל, סריקות שרוכשות פחות תמונות הקרנה של הדגימה מספקות רזולוציה נמוכה יותר מאשר סריקות שרוכשות יותר תמונות הקרנה, כאשר ההחלפה היא זמן שהוקדש לסריקה. למרות זמני הסריקה ישתנו על ידי מכשיר ופרמטרים אחרים סריקה, סריקות לרכוש כמה מאות תחזיות (~ 3 מיקרומטר גודל פיקסל תמונה) לוקח בערך 30 דקות לכל דגימה, בעוד סריקות המורכבות אלפי תמונות הקרנה (700 nm-1.25 μm גודל פיקסל תמונה) יכול לקחת 8-16 שעות. השוואה של אותה כיסוי ראש זבוב למבוגרים שצולם הן במצב סריקה 'איטי' (אלפי תחזיות) והן במצב סריקה 'מהיר' (מאות תחזיות) מוצגת באיור 3. חשוב לציין, ניתוחים מורפומטריים אינם שונים בין סריקות 'איטיות' ו'מהירות' (איור 3C)40. צינור ההדמיה שלנו, אם כן, משתמש בסריקות מהירות כדי ליצור גודל מדגם גדול מספיק לניתוח מורפומטרי, וסריקות איטיות כדי לדמיין פגמים מורפולוגיים או אנטומיים ברזולוציה גבוהה יותר. באמצעות התוכנה (שלב 7), כל רקמה או מערכת איברים של עניין ניתן לפלח ולהשתמש לניתוח מורפומטרי ודמיינו בתלת-ממד באמצעות יוצר הסרטים (סרט 1).
איור 4 מראה דוגמה של הבטן הזבוב מוכתם עם PTA ו התמונה hydrated (מים) או בעקבות ייבוש נקודה קריטית (CPD) על מיקרוסקופ רנטגן (שולחן החומרים). הפרטים המוענקים על ידי שילוב של ועד ההורים והיכולות של פלטפורמה זו ניכרים בקלות בתמונות אלה, כך שתאי אפיתליה בודדים של מידגוט וחבילות זרע בתוך האשכים נפתרים בקלות. בעוד שתמונת CPD מראה רזולוציה מוגברת שולית בהשוואה לדגימה hydrated, שימור טוב יותר של אולטרה מבנה של רקמות עדינות (כגון תאי השומן ליד החתך) מושגת עם דגימות hydrated(סרט 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> איור 1: מבט כולל על עיצוב הסורק והרכבת הדגימה עבור μ-CT. (A)ספסל מסחרי μ-CT סורק. (B)הצג בתוך הסורק. מקור הרנטגן (מימין) פולט צילומי רנטגן העוברים דרך המדגם הממוקם על שלב מסתובב (חץ צהוב). ההנחיה של צילומי רנטגן אלה יוצרת ניגודיות תמונה כאשר הם עוברים דרך המדגם אל הגלאי, המורכב ממסך נוצץ הממיר צילומי רנטגן לפוטונים ומצלמת CCD סטנדרטית (משמאל). (ג)הרכבה של זבוב פירות בוגר להדמיה מיובשת במים. נקודות החיבור בין קצה הפיפטה למחזיק הפליז עטופים בסרט פרפין למניעת דליפה ונזק פוטנציאלי לסורק. גם צ'אק הבמה מודגש. שימו לב שקצה הפיפטה היה ממוקם מעט מחוץ לציר, מה שהוביל לזמן סריקה ארוך יותר ולצמצום הרזולוציה בשחזור הסופי. (D)תמונת הקרנה דו-ממדית אחת של זבוב נקבה בוגר; מאות עד אלפי תחזיות אלה נרכשות במהלך סריקה לאורך ציר הסיבוב ומשמשות לשחזור כדי ליצור טומוגרמה המכילה רזולוציה איזוטרופית ומידע תלת-ממדי מדויק. מוטות קנה מידה (C) = 2 מ"מ. P, אחורי; וי, גחון. נתון זה שונה מ Schoborg ואח'40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> איור 2: כל שלבי מחזור החיים של Drosophila melanogaster, בתמונה על ידי μ-CT. דגימות מוכתמות ביוד ותמונה hydrated במים. מוצג פרוסה 2D יחיד. (א)עובר שהשלים את השלבים המוקדמים של גסטריולציה (כוכבית). (B)זחל כוכב שלישי. (C)P7 pharate מבוגר במהלך מטמורפוזה. (ד)נקבה בוגרת. איברים שונים מודגשים: BWM, שרירי דופן הגוף; בר, מוח; דיסק, קרדיה; Cr, יבול; DLMs, שרירי אורך שרירי גלשית שרירים; DVM, שרירי גחון גחון שרירים; E-AD, דיסק אנטנה לעיניים; אם, עובר; FB, גופים שמנים; FBCs, תאי גוף שומן; ח', לב; ה"ג, הינדגוט; לה, למינה; L, רגל; מ"ג, מידגוט; OL, אונה אופטית במוח; אוב, ovipositor; PC, ציפורניים pupal; ס"ג, בלוטות רוק; VNC, כבל עצב גחוני; W, כנף; WD, דיסק כנף. מוטות קנה מידה (A) = 100 מיקרומטר; (B)-(D) = 500 מיקרומטר. D, דורסל; א' ל', שמאלה. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A, D) 350, (B, C) 285. גודל פיקסל מצלמה (מיקרומטר): (A-D) 11.6. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A, D) 1.2, (B) 1.9, (C) 1.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> איור 3: פרמטרי סריקה ורזולוציית תמונה אינם משנים ניתוחים מורפומטריים. ראש מבוגר נסרק באמצעות הגדרות הסורק 'מהיר'(A, A') (מאות תחזיות) והגדרות הסורק 'איטי' (אלפי תחזיות) ו-(B, B') (אלפי תחזיות). המוח מתואר בצהוב. (C)מדידות נפח המוח מסריקות איטיות ומהירות. מבנים מודגשים: אל על; אונת האנטנה; CB, מוח מרכזי; FB, גוף בצורת מאוורר; FCs, תאי שומן; לה, למינה; לו, לובולה; LoP, צלחת לובולה; אני, מדולה; רי, רשתית. n = 5, מבחן t של וולש. ns = לא משמעותי. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 44.4, (B) 36.5. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 348 (B) 350. גודל פיקסל מצלמה (מיקרומטר): (A-B) 11.6. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A) 2.95, (B) 1.2. נתון זה שונה מ Schoborg ואח'40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> איור 4: הבטן של דרוזופילה מלנוגאסטר בתמונה של מיקרוסקופיה של קרני רנטגן. הבטן הוכתמה עם 0.5% PTA ותמונה hydrated (מים) או בעקבות ייבוש נקודה קריטית (CPD). (A)נקודה קריטית בטן מיובשת, מוצג מנקודת המבט YZ ו (A') XZ בפרספקטיבה. (B)בטן מיובשת, מוצג מנקודת המבט של YZ ו -(B') XZ בפרספקטיבה. איברים שונים מודגשים: FC, תאי שומן; ה"ג, הינדגוט; מ"ג, מידגוט; SP, משאבת זרע; טה, אשכים. מוטות קנה מידה (A) = 250 מיקרומטר. D, דורסל; א' ל', שמאלה. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 6.7, (B) 7. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 28 (B) 29.5. מטרה: (A-B) 4X. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A-B) 0.65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
סרט 1: זחל כוכב שלישי, שניתן בתלת-ממד באמצעות יוצר הסרטים בדרקון. איברים מודגשים כוללים את המוח (צהוב), דיסקים דמיוניים עיניים-אנטנה (אדום), גוף השומן (כחול) ואת שרירי דופן הגוף (ירוק). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>
סרט 2: השוואה בין דוגמאות שתמונות במים או מעקב אחר ייבוש נקודות קריטי. בטן מוכתמת עם 0.5% PTA מוצגים. שתי הבטן נסרקו עם הגדרות זהות בגודל פיקסל תמונה (0.65 מיקרומטר). סדרה של פרוסות דו-ממדיות מוצגות בתבנית 'Z-stack' (YZ) החל ממשטחת הגדש וכלה במשטח הגחון של הבטן. איברים מודגשים: FC, תאי שומן; מ"ג, מידגוט; SP, משאבת זרע; טה, אשכים. פרמטרי סריקה: מקור למרחק דגימה (מ"מ): (A) 6.7, (B) 7. מקור למרחק מצלמה (מ"מ): (A) 28 (B) 29.5. מטרה: (A-B) 4X. גודל פיקסל תמונה (מיקרומטר): (A-B) 0.65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.</a>

פרוטוקול מוצג המאפשר הדמיה של Drosophila melanogaster שלם בכל שלב של פיתוח באמצעות טומוגרפיה מיקרו מחשב.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה לא הרסנית של רזולוציית מיקרון מעבדה שלמה או רכה. ניתן להשתמש בו כדי להבין מנגנונים של פיזיולוגיה, אנטומיה והתפתחות של בעלי חיים. מכיוון שהזבובים מצולמים במצב שלם ללא צורך בדיסקציה של רקמות, הארכיטקטורה המרחבית של רקמות ואיברים נשמרת במצבם המקורי וניתן לצפות בהם בקלות.מיקרו CT הוא כלי אידיאלי למחקרים שמטרתם מידול מחלות אנושיות בזבובים, או להבנת פגמים התפתחותיים המשפיעים על איכות החיים. זה הוכיח את עצמו גם כשימושי בדיסציפלינות אחרות, כגון הנדסה, פיזיקה, מדעי החומרים, גיאולוגיה ואנתרופולוגיה. לאחר בחירת נקודת הזמן ההתפתחותית המעניינת להדמיה, העבירו 5 עד 20 בעלי חיים למיליליטר אחד של PBST בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ודגרו את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם הקשה תקופתית כדי לסייע בהסרת הציפוי ההידרופובי ולאפשר לבעלי החיים לשקוע במלואם.בתום הדגירה, החליפו את ה-PBST במיליליטר אחד של תמיסת בואין והקישו על הצינור כדי להטביע את הזבובים במלואם. לדגימות זחלים וגולמים, לאחר דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר, שטפו את בעלי החיים שלוש פעמים למשך חמש דקות ומיליליטר אחד של PBS טרי בכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הדגימות לכלי ניתוח רב בארות המכיל PBS טרי לכל באר תחת מיקרוסקופ ניתוח, והשתמשו בסיכה קטנה המחוברת למחזיק כדי לתקוע חור בציפורן הקדמית והאחורית של כל דגימה, תוך הקפדה לא לשבש את הרקמה הרכה הבסיסית.לאחר חדירת הציפורניים, דגרו את הדגימות במיליליטר אחד של תמיסת Bouin טרייה בשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הדגימה שלוש פעמים למשך 30 דקות ומיליליטר אחד של מאגר שטיפה מיקרו CT אחד בכל כביסה. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו מיליליטר אחד מתמיסת הצביעה המתאימה לצינור ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך יומיים עד שבעה ימים. אם יש צורך בשימור תמונה ארוך יותר, יבש את הדגימות בסדרת אתנול עולה במיליליטר אחד של אתנול למשך שעה אחת לכל ריכוז כפי שמצוין, כדי להכין את הדגימות לייבוש נקודה קריטית.כדי להרכיב דגימות מיובשות בנקודה קריטית, הנח את הדגימות בצינורות נימי פלסטיק או זכוכית לפני הרכבת הצינורות על מחזיק הבמה המסתובב. להרכבת דגימה מיובשת, מלאו קצה פיפטה P10 במים ואבטחו את הקצה הצר בסרט פרפין. השתמש במלקחיים כדי להעביר דגימה בודדת לקצה הפיפטה והשתמש בחפץ ארוך ודק כדי לדחוף בזהירות את הדגימה כלפי מטה לתוך הקצה עד שהיא פשוט נוגעת בדופן הקצה כדי להחזיק את הדגימה במקומה.לאחר כיסוי הקצה הפתוח של הפיפטה, הרכיב את הפיפטה P10 על מחזיק שנועד להתאים לתוך הצ'וק של הסיבובtagה. לסריקה, לחץ על דלת פתוחה סמל בתוכנת הסורק כדי לקבל גישה לסיבוב tagחסימה ולהדק את הצווארון סביב בסיס מחזיק הדגימה כדי לחבר את הדגימה. הגדר את פרמטרי הסריקה בתוכנה לרזולוציה וניגודיות אופטימליים ולחץ על אפשרויות ומקור רנטגן כדי לפתוח את בקרת הכוח של מקור הרנטגן.השתמש בסרגלי המחוון כדי להגדיר את מתח קרני הרנטגן ל-30 עד 40 קילו-וולט ואת הזרם ל-100 עד 110 מיקרו אמפר כדי לייצר קרן רנטגן עם שלושה עד ארבעה וואט של הספק וגודל נקודה קטן. כדי להגדיר את מספר תמונות ההקרנה שיש להשיג במהלך הסריקות, בחר אפשרויות ומצבי רכישה כדי להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה ל-500 עד 800 אלפיות השנייה והשתמש בפס המחוון כדי להגדיר את גודל הפיקסלים הרצוי של התמונה בהתאם להגדרות המצלמה ולמיקומה. לחץ וגרור את פס המחוון כדי להזיז את הדגימה לאורך נתיב הסיבוב של 360 מעלות, תוך שמירה על הדגימה בשדה הראייה.לחץ על הסמל התחל רכישה. תופיע תיבת דו-שיח המאפשרת להגדיר פרמטרי סריקה נוספים. תן שם לקובץ ולתיקיית הפלט שבה תישמר הסריקה.הגדר את התנועה האקראית ל-10 ואת הממוצע לארבע עד שש פריימים. שלב הסיבוב יחושב אוטומטית בהתאם להגדרות המצלמה בהן נעשה שימוש, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להתחיל ברכישה. תיבת דו-שיח של סרגל התקדמות המציגה את זמן הסריקה תופיע והסורק יתחיל לקבל סדרה של תמונות הקרנה של הדגימה לאורך נתיב הסיבוב.כדי ליצור את הטומוגרמות, פתח את תמונות ההקרנה בתוכנת השחזור ובחר באלגוריתם תיקון ההזזה כדי לבצע יישור תמונה ראשוני. בחר את הערך הטוב ביותר ליישור נכון של תמונות ההקרנה ולחץ על Fine tuning כדי לכוונן כל פרמטר שחזור. תיווצר סדרה של תצוגות מקדימות שניתן להשתמש בהן כדי לבחור את הערכים הנכונים.ודא שערכי הפרמטרים האופטימליים מוצגים בכרטיסייה הגדרות, ובכרטיסייה פלט, התאם את פרמטרי הקובץ כגון עומק סיביות, שם קובץ ותיקיה שבה יישמרו הנתונים. ניתן להשתמש באזור מעניין כדי לשחזר רק את המבנים המעניינים. אם נדרשים שחזורים מרובים, לחץ על התחל והוסף לאצווה כדי להוסיף את התמונה הנוכחית למנהל האצווה ולחזור על השחזור של התמונות הנותרות.לניתוח מורפומטרי של התמונות המשוחזרות, תחת הכרטיסיה פלח, בתוכנה מתאימה לניתוח מורפומטרי, לחץ על בסיסי וחדש, תן לתמונה שם חדש ובחר צבע מתאים. סמן את התיבה הגדר טווח והתאם את המחוון כדי להתאים את טווח הסף המקיף את מבנה העניין. כדי לצבוע אזור המוגדר על-ידי הסף, לחץ והחזק את מקש Control תוך כדי לחיצה ממושכת על מקש העכבר השמאלי.כדי להסיר אזור, לחץ/י והחזק/י את מקש Shift תוך כדי לחיצה ממושכת על מקש העכבר השמאלי. ודא שהמדידות של אזור הרשת המעניין מוצגות בלוח המידע לניתוח מורפומטרי בסיסי. עבדו את עצם רשת השינוי ואת תמונת הטומוגרמה כולה, והדמיינו את התמונה המתקבלת בתלת-ממד, ולאחר מכן לחצו לחיצה ימנית כדי לבחור Show Movie Maker כדי ליצור וידאו של האובייקט באמצעות מסגרות בודדות מהמציג.בתמונות אלה ניתן להבחין בעובר, זחל כוכב שלישי, גולם בשלב הבוגר המוסס, וזבוב נקבה בוגר מוכתם ביוד ומצולם במים באמצעות סורק ספסל מסחרי. ניתן לראות שימור מצוין ואפילו צביעה של הרקמה העדינה, מה שמאפשר לזהות בקלות את כל האיברים העיקריים. כאן, מוצגת השוואה של אותו כיסוי ראש של זבוב בוגר, שנרכש במצב סריקת הקרנה איטית ומהירה כאחד.חשוב לציין, למרות שהרזולוציה בתמונות האיטיות גבוהה יותר, הניתוח המורפומטרי אינו שונה בין הסריקות האיטיות והמהירות. באמצעות תוכנת העיבוד, ניתן לפלח כל מערכת רקמות או איברים מעניינים ולהשתמש בה לניתוח מורפומטרי והדמיה תלת מימדית. בתמונות אלה, ניתן לראות בטן זבוב מוכתמת בחומצה פוספוטונגסטית ומצולמת בזמן לחות מים או לאחר ייבוש נקודה קריטית במיקרוסקופ רנטגן.באמצעות חומצה פוספוטונגסטית, תאי אפיתל בודדים של המעי האמצעי וצרורות הזרע בתוך האשכים נפתרים בקלות. בעוד שתמונות ייבוש הנקודה הקריטית מראות רזולוציה מוגברת באופן שולי בהשוואה לדגימה המימית, שימור טוב יותר של מבנה האולטרה-מבנה של רקמות עדינות מושג עם דגימות מיובשות, כגון תאי השומן ליד הציפורן. לקבלת הרזולוציה הטובה ביותר, הגבל את תנועת הדגימה ואת הרעידות העודפות.אבטחת הדגימה לבמה היא קריטית לשם כך, אם כי ייתכן שתידרש יצירתיות ותושייה על מנת להשיג זאת. שיטות הדמיה נוספות, כגון מיקרוסקופ אור ואלקטרונים, יכולות לשמש כחלק מתהליך הדמיה על מנת להבין מוטציה גנטית נתונה מקנה המידה הננומטרי לאורגניזם כולו.

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

Mesoscopic הקרינה טומוגרפיה פועלת מעבר לגבולות חדירה של מיקרוסקופיה רקמות חתך פלואורסצנטי. הטכניקה מבוססת על תאורה השלכה רב ותיאור תחבורה פוטון. אנו להדגים ב-vivo כל הגוף 3D להדמיה של המורפוגנזה ה-GFP-לבטא דיסקים דמותי האגף...

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

ניגודיות משופרת כלי שיט קטן בעל חיים הדמיה על ידי microCT היא מהירה, חסכונית תפוקה גבוהה טכניקה...

כלי משופר ניגודיות הדמיה באמצעות MicroCT

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

ב פרוטוקול זה, נדגים היישום של אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה להבהיר את מבנה מיטוכונדריאלי בשריר טיסה עקיף דרוזופילה .

Ultrastructure מיטוכונדריאלי תלת-ממד של שריר טיסה עקיף דרוזופילה התגלה על ידי אלקטרון סדרתי-סעיף טומוגרפיה

כאן אנחנו מדגימים כיצד מולקולה בודדת לוקליזציה מופעל צילום מיקרוסקופ יכול להתבצע על הטרמינל עצבים מוטוריים של חיים דרוזופילה melanogaster השלישי instar זחל.

אין ויוו מעקב אחר בתחנת האוטובוסים Presynaptic עצבים מוטוריים דרוזופילה מולקולה בודדת

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

אנו מציגים שיטה המותאמת במיוחד כדי לדמות את המוח כולו של Drosophila הבוגר במהלך ההתנהגות בתגובה לגירויים. הראש ממוקם כדי לאפשר גישה אופטית לכל המוח, בעוד הזבוב יכול להזיז את רגליו ואת האנטנות, את קצה הפרובוסיס, והעיניים יכולות לקבל גירויים חושיים.

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

כאן מוצג פרוטוקול ליישום מיקרוסקופ הרחבה בעוברי דרוזופילה מוקדמים להשגת הדמיה ברזולוציית על באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונפוקלי קונבנציונלי לסריקת לייזר.

שימוש במיקרוסקופ הרחבה להגדלה פיזית של עוברי דרוזופילה שלמים לצורך הדמיה ברזולוציית על

למד הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית. שיטה זו מאפשרת צפייה במבנים אנטומיים ללא פגיעה ברקמות ובאיברים בדגימות שלמות.

הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

גלה סרטונים נוספים