הדמיה חיה שלמה של Drosophila melanogaster באמצעות טומוגרפיה מיקרו-מחשבתית

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה לא הרסנית של רזולוציית מיקרון מעבדה שלמה או רכה. ניתן להשתמש בו כדי להבין מנגנונים של פיזיולוגיה, אנטומיה והתפתחות של בעלי חיים. מכיוון שהזבובים מצולמים במצב שלם ללא צורך בדיסקציה של רקמות, הארכיטקטורה המרחבית של רקמות ואיברים נשמרת במצבם המקורי וניתן לצפות בהם בקלות.

מיקרו CT הוא כלי אידיאלי למחקרים שמטרתם מידול מחלות אנושיות בזבובים, או להבנת פגמים התפתחותיים המשפיעים על איכות החיים. זה הוכיח את עצמו גם כשימושי בדיסציפלינות אחרות, כגון הנדסה, פיזיקה, מדעי החומרים, גיאולוגיה ואנתרופולוגיה. לאחר בחירת נקודת הזמן ההתפתחותית המעניינת להדמיה, העבירו 5 עד 20 בעלי חיים למיליליטר אחד של PBST בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, ודגרו את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר עם הקשה תקופתית כדי לסייע בהסרת הציפוי ההידרופובי ולאפשר לבעלי החיים לשקוע במלואם.

בתום הדגירה, החליפו את ה-PBST במיליליטר אחד של תמיסת בואין והקישו על הצינור כדי להטביע את הזבובים במלואם. לדגימות זחלים וגולמים, לאחר דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר, שטפו את בעלי החיים שלוש פעמים למשך חמש דקות ומיליליטר אחד של PBS טרי בכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, העבירו את הדגימות לכלי ניתוח רב בארות המכיל PBS טרי לכל באר תחת מיקרוסקופ ניתוח, והשתמשו בסיכה קטנה המחוברת למחזיק כדי לתקוע חור בציפורן הקדמית והאחורית של כל דגימה, תוך הקפדה לא לשבש את הרקמה הרכה הבסיסית.

לאחר חדירת הציפורניים, דגרו את הדגימות במיליליטר אחד של תמיסת Bouin טרייה בשפופרת חדשה של 1.5 מיליליטר למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר לפני שטיפת הדגימה שלוש פעמים למשך 30 דקות ומיליליטר אחד של מאגר שטיפה מיקרו CT אחד בכל כביסה. לאחר הכביסה האחרונה, הוסיפו מיליליטר אחד מתמיסת הצביעה המתאימה לצינור ודגרו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך יומיים עד שבעה ימים. אם יש צורך בשימור תמונה ארוך יותר, יבש את הדגימות בסדרת אתנול עולה במיליליטר אחד של אתנול למשך שעה אחת לכל ריכוז כפי שמצוין, כדי להכין את הדגימות לייבוש נקודה קריטית.

כדי להרכיב דגימות מיובשות בנקודה קריטית, הנח את הדגימות בצינורות נימי פלסטיק או זכוכית לפני הרכבת הצינורות על מחזיק הבמה המסתובב. להרכבת דגימה מיובשת, מלאו קצה פיפטה P10 במים ואבטחו את הקצה הצר בסרט פרפין. השתמש במלקחיים כדי להעביר דגימה בודדת לקצה הפיפטה והשתמש בחפץ ארוך ודק כדי לדחוף בזהירות את הדגימה כלפי מטה לתוך הקצה עד שהיא פשוט נוגעת בדופן הקצה כדי להחזיק את הדגימה במקומה.

לאחר כיסוי הקצה הפתוח של הפיפטה, הרכיב את הפיפטה P10 על מחזיק שנועד להתאים לתוך הצ'וק של הסיבובtagה. לסריקה, לחץ על דלת פתוחה סמל בתוכנת הסורק כדי לקבל גישה לסיבוב tagחסימה ולהדק את הצווארון סביב בסיס מחזיק הדגימה כדי לחבר את הדגימה. הגדר את פרמטרי הסריקה בתוכנה לרזולוציה וניגודיות אופטימליים ולחץ על אפשרויות ומקור רנטגן כדי לפתוח את בקרת הכוח של מקור הרנטגן.

השתמש בסרגלי המחוון כדי להגדיר את מתח קרני הרנטגן ל-30 עד 40 קילו-וולט ואת הזרם ל-100 עד 110 מיקרו אמפר כדי לייצר קרן רנטגן עם שלושה עד ארבעה וואט של הספק וגודל נקודה קטן. כדי להגדיר את מספר תמונות ההקרנה שיש להשיג במהלך הסריקות, בחר אפשרויות ומצבי רכישה כדי להגדיר את זמן החשיפה של המצלמה ל-500 עד 800 אלפיות השנייה והשתמש בפס המחוון כדי להגדיר את גודל הפיקסלים הרצוי של התמונה בהתאם להגדרות המצלמה ולמיקומה. לחץ וגרור את פס המחוון כדי להזיז את הדגימה לאורך נתיב הסיבוב של 360 מעלות, תוך שמירה על הדגימה בשדה הראייה.

לחץ על הסמל התחל רכישה. תופיע תיבת דו-שיח המאפשרת להגדיר פרמטרי סריקה נוספים. תן שם לקובץ ולתיקיית הפלט שבה תישמר הסריקה.

הגדר את התנועה האקראית ל-10 ואת הממוצע לארבע עד שש פריימים. שלב הסיבוב יחושב אוטומטית בהתאם להגדרות המצלמה בהן נעשה שימוש, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להתחיל ברכישה. תיבת דו-שיח של סרגל התקדמות המציגה את זמן הסריקה תופיע והסורק יתחיל לקבל סדרה של תמונות הקרנה של הדגימה לאורך נתיב הסיבוב.

כדי ליצור את הטומוגרמות, פתח את תמונות ההקרנה בתוכנת השחזור ובחר באלגוריתם תיקון ההזזה כדי לבצע יישור תמונה ראשוני. בחר את הערך הטוב ביותר ליישור נכון של תמונות ההקרנה ולחץ על Fine tuning כדי לכוונן כל פרמטר שחזור. תיווצר סדרה של תצוגות מקדימות שניתן להשתמש בהן כדי לבחור את הערכים הנכונים.

ודא שערכי הפרמטרים האופטימליים מוצגים בכרטיסייה הגדרות, ובכרטיסייה פלט, התאם את פרמטרי הקובץ כגון עומק סיביות, שם קובץ ותיקיה שבה יישמרו הנתונים. ניתן להשתמש באזור מעניין כדי לשחזר רק את המבנים המעניינים. אם נדרשים שחזורים מרובים, לחץ על התחל והוסף לאצווה כדי להוסיף את התמונה הנוכחית למנהל האצווה ולחזור על השחזור של התמונות הנותרות.

לניתוח מורפומטרי של התמונות המשוחזרות, תחת הכרטיסיה פלח, בתוכנה מתאימה לניתוח מורפומטרי, לחץ על בסיסי וחדש, תן לתמונה שם חדש ובחר צבע מתאים. סמן את התיבה הגדר טווח והתאם את המחוון כדי להתאים את טווח הסף המקיף את מבנה העניין. כדי לצבוע אזור המוגדר על-ידי הסף, לחץ והחזק את מקש Control תוך כדי לחיצה ממושכת על מקש העכבר השמאלי.

כדי להסיר אזור, לחץ/י והחזק/י את מקש Shift תוך כדי לחיצה ממושכת על מקש העכבר השמאלי. ודא שהמדידות של אזור הרשת המעניין מוצגות בלוח המידע לניתוח מורפומטרי בסיסי. עבדו את עצם רשת השינוי ואת תמונת הטומוגרמה כולה, והדמיינו את התמונה המתקבלת בתלת-ממד, ולאחר מכן לחצו לחיצה ימנית כדי לבחור Show Movie Maker כדי ליצור וידאו של האובייקט באמצעות מסגרות בודדות מהמציג.

בתמונות אלה ניתן להבחין בעובר, זחל כוכב שלישי, גולם בשלב הבוגר המוסס, וזבוב נקבה בוגר מוכתם ביוד ומצולם במים באמצעות סורק ספסל מסחרי. ניתן לראות שימור מצוין ואפילו צביעה של הרקמה העדינה, מה שמאפשר לזהות בקלות את כל האיברים העיקריים. כאן, מוצגת השוואה של אותו כיסוי ראש של זבוב בוגר, שנרכש במצב סריקת הקרנה איטית ומהירה כאחד.

חשוב לציין, למרות שהרזולוציה בתמונות האיטיות גבוהה יותר, הניתוח המורפומטרי אינו שונה בין הסריקות האיטיות והמהירות. באמצעות תוכנת העיבוד, ניתן לפלח כל מערכת רקמות או איברים מעניינים ולהשתמש בה לניתוח מורפומטרי והדמיה תלת מימדית. בתמונות אלה, ניתן לראות בטן זבוב מוכתמת בחומצה פוספוטונגסטית ומצולמת בזמן לחות מים או לאחר ייבוש נקודה קריטית במיקרוסקופ רנטגן.

באמצעות חומצה פוספוטונגסטית, תאי אפיתל בודדים של המעי האמצעי וצרורות הזרע בתוך האשכים נפתרים בקלות. בעוד שתמונות ייבוש הנקודה הקריטית מראות רזולוציה מוגברת באופן שולי בהשוואה לדגימה המימית, שימור טוב יותר של מבנה האולטרה-מבנה של רקמות עדינות מושג עם דגימות מיובשות, כגון תאי השומן ליד הציפורן. לקבלת הרזולוציה הטובה ביותר, הגבל את תנועת הדגימה ואת הרעידות העודפות.

אבטחת הדגימה לבמה היא קריטית לשם כך, אם כי ייתכן שתידרש יצירתיות ותושייה על מנת להשיג זאת. שיטות הדמיה נוספות, כגון מיקרוסקופ אור ואלקטרונים, יכולות לשמש כחלק מתהליך הדמיה על מנת להבין מוטציה גנטית נתונה מקנה המידה הננומטרי לאורגניזם כולו.