Name: כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למד את פרוטוקול ויטריפיקציה בנפח מינימלי לשימור זרעוני חתולים לא בוגרים. השיטה מאפשרת הקמת בנקי גמטות לשימור מגוון ביולוגי של חתוליים בסכנת הכחדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו היתה נתמכת באופן חלקי על ידי EVSSAR (האגודה האירופית וטרינרית עבור רבייה בעלי חיים קטנים) גרנט 2016 ועל ידי אוניברסיטת הווסטאה degli Studi די מילאנו, פסנתר די Sostegno אלה Ricerca 2019 (לינאה 2 Azione A). כמו כן, אנו רוצים להודות לד ר מרידעגיה מורסלי על תרומתו לניסויים המתוארים בזאת ולרכישת תמונה.

ההליכים מתוארים בזאת לא עברו אישור מוסרי מאז שחלות החתול נאספו במרפאות וטרינרי כמו תוצרי לוואי של הבעלים-כריתת שגרתית המבוקש או ovarioכריתת רחם.
1. אוסף אוקינטה
<ol><li>לפני תחילת הניסויים, להכין פתרונות עבור שחלות ואוסף oocyte. הכנת הפתרון של אוסף שחלות עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) עם תערובת של אנטיביוטיקה ו antimycotics (100 IU/mL של פניצילין G נתרן, 0.1 mg/mL של סטרפטומיצין סולפט, 0.25 μg/mL של אמפוריטיצין B). הכינו פתרון אוסף oocyte (כלומר, PBS/PVA) עם PBS עם 100 IU/mL של פניצילין G נתרן, 0.1 mg/mL של סטרפטומיצין סולפט ו 0.1% (w/v) פוליוויניל אלכוהול (PVA).</li>
	<li>לאחסן פתרונות עבור השחלה ואוסף oocyte ב 4 ° צ' עד השימוש.</li>
	<li>ביום העיקור של מלכות, כמה שעות לפני עיבוד הדגימות, לקחת חלק מפתרונות איסוף שחלות והשחלה ולתת להם להתחמם בטמפרטורת החדר (RT; 25 ± 2 ° c).</li>
	<li>כאשר מגיעים דגימות למעבדה, מבודדים את השחלות מרקמת החיבור שמסביב ומצינור ההטלה ורוחצים אותם בתוך מדיום של אוסף שחלות טריות בצלחת פטרי.</li>
	<li>מילוי 1 35 mm צלחת פטרי עבור כל מלכה עם כ 3 מ ל RT PBS/PVA, ועוד מנה אחת כדי לאסוף את oocytes.</li>
	<li>מניחים זוג שחלות בצלחת פטרי ומכלים את קליפת המוח עם אזמל כירורגי. ודא שכל הזקיקים שבורים בעזרת stereomicroscope (הגדלה 8x).</li>
	<li>לאסוף את COCs עם פיפטה ולהעביר אותם PBS חדש/PVA בצלחת פטרי שהוקצתה. בחר תכונות טובות COCs, עם הומוגנית, ציטופלסמה כהה מוקף מספר שכבות קומפקטיות של תאים קומולוס (כיתה I18).</li>
</ol>2. ויטריפיקציה
<ol><li>הכן את התקשורת הויטריפיקציה והתקשורתית.<ol>
<li>הכנת פתרון equilibration (ES) עם 7.5% (v/v) אתילן גליקול (EG) ו 7.5% (v/v) (DMSO) ב בינונית 199, עם 20% סרום בקר עוברי (FBS).</li>
		<li>להכין פתרון ויטריפיקציה (VS) עם 15% (v/v) לדוגמה, 15% (v/v) DMSO ו 0.5 M סוכות ב בינונית 199, עם 20% FBS (שונה מ 19).</li>
		<li>תן ES ו VS לחמם ב-RT לפני השימוש. הערה: Cryoprotectants (g., למשל, DMSO) ידועים כרעילים ציטוטוקסיים. אסטרטגיה לקונטרה רעילות שלהם היא להפחית את הטמפרטורה שבה התאים חשופים להם20, ו oocytes חשופים בדרך כלל לcryoprotectants ב RT. כך, את כל ההליך, מן האוסף oocyte כדי ויטריפיקציה, מבוצע ב-RT בפרוטוקול זה כדי למנוע תנודות בטמפרטורה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכן את המנה הויטריפיקציה (כלומר, מנה מיוחדת המורכבת משש בארות חרותיים מחולקות בשתי שורות, הידועות בשם "Repro פלייט"). הכן שורה אחת (שלוש בארות) עבור כל תמיכה ויטריפיקציה.<ol>
<li>הוסף 20 μL של ES בתחתית הבאר הראשונה.</li>
		<li>הוסף 300 μL של VS בתחתית השני (כלומר, 1VS) והשלישי (כלומר, 2VS) בארות.</li>
	</ol></li>
	<li>משקל השפה הבין-מדעי ב-ES.<ol>
<li>עם פיפטה קטן ומשעמם (למשל, פיפטה פסטר ששלף על מקור בונזן לעשות את זה דק יותר-קוטר צריך להיות לפחות 200 μm), להעביר אחד (או יותר) COC (s) בתחתית הבאר הראשונה. הערה: בחר את גודל הפיפטה לפי מספר השכבות של תאי קומולוס המקיפים את האוציטים, כך שבממדים של COCs, במטרה להקטין ככל האפשר את נפח המדיה המועבר עם COCs בכל שלב. עם הפרוטוקול הנוכחי, מפעילים מאומנים יכולים לסייע בהצלחה של עד שמונה חתולים בעלי מדעי החתול לכל תמיכה ויטריפיקציה.</li>
		<li>הוסף באיטיות 20 μL של ES בגבול המסירה. . חכו 3 דקות</li>
		<li>הוסף לאט את 20 μL של ES בגבול המסירה. . חכו 3 דקות</li>
		<li>הוסף באיטיות 240 μL של ES בגבול המסירה. . חכה 9 דקות</li>
		<li>בזמן ההמתנה, הכן קופסה עם חנקן נוזלי (LN2), סמן תמיכה ויטריפיקציה עם קוד זיהוי הניסוי/חתול והשאר אותו פתוח. שים את שניהם ליד stereomicroscope, כך שהם יכולים להיות נגישים בקלות בעת העבודה. זהירות! לבשו ציוד הגנה אישי בעת טיפול LN2.</li>
		<li>לחילופין, אם יש מספר מקרי החלקה של COCs, התחל בצעד האמצעי הראשון (ראה step 2.3.1-2.3.2) עבור קבוצה אחרת של COCs (שתיטען על תמיכה ויטריפיקציה חדשה).</li>
	</ol></li>
	<li>Vitrify COCs ב VS בתוך פחות מ 90 שניות.<ol>
<li>באמצעות אותו מנשא קטן, למלא אותו עם 1VS, לקחת את COCs מהחלק התחתון של הטוב הראשון (ES) ולהעביר אותם אל פני השטח של הבאר השנייה (1VS).</li>
		<li>רחץ את הפיפטה באמצעות 1VS.</li>
		<li>קח את מחשבי ה-COCs והעבר אותם לאזור אחר (בתחתית) של הבאר; ערבב את המדיום המקיף אותם עם הפיפטה.</li>
		<li>למלא את הפיפטה עם 1VS באזור אחר של הבאר, לקחת את COCs, להזיז אותם ולערבב את המדיום המקיפים אותם עם הפיפטה.</li>
		<li>חזור על שלב ה2.4.4.</li>
		<li>שטוף את הפיפטה עם 2VS.</li>
		<li>קח את מחשבי ה-COCs והזז אותם בתחתית הבאר השלישית (2VS); ערבב את המדיום המקיף אותם עם הפיפטה.</li>
		<li>למלא את הפיפטה עם 2VS באזור אחר של הבאר, לקחת את COCs, להזיז אותם ולערבב את המדיום המקיפים אותם עם הפיפטה.</li>
		<li>חזור על שלב ה2.4.8.</li>
		<li>למלא את הפיפטה עם 2VS באזור אחר של הבאר, לקחת את COCs ולטעון אותם על רצועת התמיכה ויטריפיקציה, קרוב ככל האפשר לקצה. מפחית מדיום עודף כדי להפחית את עוצמת הקול של VS ככל האפשר.</li>
		<li>לצלול מיד את התמיכה הויטריפיקציה. ב-LN2, הזזת המקום סגור אותו בעזרת מלחציים מסוימים, וודא שהוא תמיד נשאר שקוע ב-LN2. הערה: שמירה על התזמון הנכון היא חיונית עקב רעילות כימיות cell. בגלל הריכוז הגבוה שלהם בתקשורת ויטריפיקציה, צריך לשלוט בחשיפה לתאים, גם על ידי ביצוע מושלם של הטכניקה21. אם הדגימות שופע, שקול לחלק אותם כדי לעבד אותם במהירות רבה יותר ולמזער את כמות הזמן מאוסף oocyte כדי ויטריפיקציה.</li>
	</ol></li>
	<li>אחסן את התמיכה ויטריפיקציה טעון בגביע ולשמור אותם באחסון LN2 טנק עד התחממות. הערה: ניתן להחיל את כל השלבים הקודמים של הפרוטוקול גם בתנאי שדה אם LN2 זמין. מוביל יבש יהיה צורך להעביר את הדגימות למעבדה בביטחה ולאחר מכן להמשיך שם עם השלבים הבאים.</li>
</ol>3. התחממות
<ol><li>. הכן מדיה מחממת<ol>
<li>הכינו את התמיסה (TS) עם סוכרוז 1 מ 199 בינונית, עם 20% FBS.</li>
		<li>הכנת תמיסת דילול (DS) עם 0.5 מ ' סוכות ב בינונית 199, עם 20% FBS.</li>
		<li>הכנת פתרון כביסה (WS) עם בינוני 199 עם 20% FBS.</li>
		<li>לפני השימוש, לחמם את TS עד 38 ° צ' ו DS ו-WS ב RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במידת הצורך, הכינו את מדיום התרבות לשימוש הבאים של מחשבי ה-COCs התחממו (לדוגמה, התבגרות מחוץ לגוף, IVM).</li>
	<li>הציבו את שלב החימום קרוב לstereomicroscope והפעל אותו (38 ° c). שים את המכסה של צלחת פטרי כדי לחמם.</li>
	<li>כאשר הכל מוכן, להעביר את התמיכה ויטריפיקציה אשר צריך להתחמם ממיכל האחסון לקופסה עם LN2, ולשים את התיבה ליד stereomicroscope.</li>
	<li>הכינו את "הצלחת Repro". הכן שורה עבור כל אחת מהתמיכה הויטריפיקציה שיש לחמם.<ol>
<li>הוסף 300 μL של DS בתחתית הבאר הראשונה.</li>
		<li>הוסף 300 μL של WS בתחתית השניה (כלומר, 1WS) ושלישית (כלומר, 2WS) ובארות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לבצע ירידה של TS (100 μL) על המכסה של צלחת פטרי.</li>
	<li>עם מלחציים, פתח תמיכה. ויטריפיקציה אחת ב-LN2</li>
	<li>שים את הירידה TS מתחת stereomicroscope עם תנועה מהירה אחת לקחת את התמיכה הויטריפיקציה מתוך LN2 ולטבול את הרצועה שלו בירידה, הזזת אותו עד כולם לנתק את כל cocs. הסר את התמיכה מהשחרור ברגע שהוא ריק, אך השאר את ה-COCs ב-TS במשך דקה אחת בסך הכל (מטבילה עד השלב הבא).</li>
	<li>קחו פיפטה דומה לזה ששימש לויטריפיקציה ומלאו אותו ב-DS. קח את ה-COCs מהשחרור (TS) והעבר אותם לתחתית הבאר הראשונה (DS). . חכו 3 דקות</li>
	<li>שטוף את הפיפטה עם 1WS. קח את ה-COCs והזז אותם בתחתית הבאר השנייה (1WS). . חכה 5 דקות</li>
	<li>שטוף את הפיפטה עם 2WS. קח את ה-COCs והזז אותם על פני השטח של הבאר השלישי (2WS). לחכות להם לגעת בתחתית הבאר.</li>
	<li>חזור על שלב 3.11 באמצעות אזור אחר של הבאר.</li>
	<li>שטוף את הפיפטה עם המדיום התרבותי והזיזו את האוציטים לצלחת התרבות לשימוש הבא (למשל, IVM).</li>
</ol>

<ol><li>Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+social+implications+of+embryo+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">The social implications of embryo cryopreservation.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).</li>
<li>Saragusty, J., Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+oocyte+and+embryo+cryopreservation+by+slow+freezing+and+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.</a> Reproduction. 141 (1), 1-19 (2011).</li>
<li>Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamete+cryopreservation+in+the+domestic+cat%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Gamete cryopreservation in the domestic cat.</a> Theriogenology. 66 (1), 101-111 (2006).</li>
<li>Thongphakdee, A., Tipkantha, W., Punkong, C., Chatdarong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+controlling+ovarian+activity+in+wild+felids%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Monitoring and controlling ovarian activity in wild felids.</a> Theriogenology. 109, 14-21 (2018).</li>
<li>Parks, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothermia+and+mammalian+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Tissue+Banking%22%5BJournal%5D)">Hypothermia and mammalian gametes.</a> Reproductive Tissue Banking. , 229-261 (1997).</li>
<li>Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-granulosa+cell+heterologous+gap+junctions+are+required+for+the+coordination+of+nuclear+and+cytoplasmic+meiotic+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence.</a> Developmental Biology. 226 (2), 167-179 (2000).</li>
<li>Murakami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocysts+derived+from+in+vitro-fertilized+cat+oocytes+after+vitrification+and+dilution+with+sucrose%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Blastocysts derived from in vitro-fertilized cat oocytes after vitrification and dilution with sucrose.</a> Cryobiology. 48 (3), 341-348 (2004).</li>
<li>Merlo, B., Iacono, E., Regazzini, M., Zambelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cat+blastocysts+produced+in+vitro+from+oocytes+vitrified+using+the+cryoloop+technique+and+cryopreserved+electroejaculated+semen%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cat blastocysts produced in vitro from oocytes vitrified using the cryoloop technique and cryopreserved electroejaculated semen.</a> Theriogenology. 70 (1), 126-130 (2008).</li>
<li>Luciano, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+different+cryopreservation+protocols+on+cytoskeleton+and+gap+junction+mediated+communication+integrity+in+feline+germinal+vesicle+stage+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes.</a> Cryobiology. 59 (1), 90-95 (2009).</li>
<li>Comizzoli, P., Wildt, D. E., Pukazhenthi, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+compaction+of+germinal+vesicle+chromatin+is+beneficial+to+survival+of+vitrified+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">In vitro compaction of germinal vesicle chromatin is beneficial to survival of vitrified cat oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 44, SUPPL. 2 269-274 (2009).</li>
<li>Alves, A. E., Kozel, A. C., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+with+DAP+213+and+Cryotop+of+ex+situ+and+in+situ+feline+cumulus-oocyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification with DAP 213 and Cryotop of ex situ and in situ feline cumulus-oocyte complexes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 47 (6), 1003-1008 (2012).</li>
<li>Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+for+cryopreservation+of+human+oocytes+and+embryos%3A+The+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification for cryopreservation of human oocytes and embryos: The Cryotop method.</a> Theriogenology. 67 (1), 73(2007).</li>
<li>Pope, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+survival+of+domestic+cat+oocytes+after+vitrification%2C+intracytoplasmic+sperm+injection+and+embryo+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vivo survival of domestic cat oocytes after vitrification, intracytoplasmic sperm injection and embryo transfer.</a> Theriogenology. 77 (3), 531-538 (2012).</li>
<li>Galiguis, J., Gómez, M. C., Leibo, S. P., Pope, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+domestic+cat+kitten+produced+by+vitrification+of+lipid+polarized+in+vitro+matured+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Birth of a domestic cat kitten produced by vitrification of lipid polarized in vitro matured oocytes.</a> Cryobiology. 68 (3), 459-466 (2014).</li>
<li>Fernandez-Gonzalez, L., Jewgenow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+feline+oocytes+by+vitrification+using+commercial+kits+and+slush+nitrogen+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of feline oocytes by vitrification using commercial kits and slush nitrogen technique.</a> Reproduction in Domestic Animals. 52, 230-234 (2017).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Tavares, M. R., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+competence+of+domestic+cat+vitrified+oocytes+in+3D+enriched+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Animals%22%5BJournal%5D)">Developmental competence of domestic cat vitrified oocytes in 3D enriched culture conditions.</a> Animals. 9 (6), 329(2019).</li>
<li>Colombo, M., Morselli, M. G., Apparicio, M., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulosa+cells+in+three-dimensional+culture%3A+A+follicle-like+structure+for+domestic+cat+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Granulosa cells in three-dimensional culture: A follicle-like structure for domestic cat vitrified oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. , (2020).</li>
<li>Wood, T. C., Wildt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+quality+of+the+cumulus-oocyte+complex+in+the+domestic+cat+on+the+ability+of+oocytes+to+mature%2C+fertilize+and+develop+into+blastocysts+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Effect of the quality of the cumulus-oocyte complex in the domestic cat on the ability of oocytes to mature, fertilize and develop into blastocysts in vitro.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 110 (2), 355-360 (1997).</li>
<li>Cobo, A., Kuwayama, M., Pérez, S., Ruiz, A., Pellicer, A., Remohí, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+concomitant+outcome+achieved+with+fresh+and+cryopreserved+donor+oocytes+vitrified+by+the+Cryotop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Comparison of concomitant outcome achieved with fresh and cryopreserved donor oocytes vitrified by the Cryotop method.</a> Fertility and Sterility. 89 (6), 1657-1664 (2008).</li>
<li>Mullen, S. F., Critser, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+cryobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncofertility+-+Fertility+preservation+for+Cancer+Survivors%22%5BJournal%5D)">The science of cryobiology.</a> Oncofertility - Fertility preservation for Cancer Survivors. , 83-109 (2007).</li>
<li>Fahy, G. M., Wowk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation+by+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation by vitrification.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 21-82 (2015).</li>
<li>Apparicio, M., Ruggeri, E., Luvoni, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+immature+feline+oocytes+with+a+commercial+kit+for+bovine+embryo+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Vitrification of immature feline oocytes with a commercial kit for bovine embryo vitrification.</a> Reproduction in Domestic Animals. 48 (2), 240-244 (2013).</li>
<li>Brambillasca, F., Guglielmo, M. C., Coticchio, G., Mignini Renzini, M., Dal Canto, M., Fadini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+challenges+to+efficient+immature+oocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">The current challenges to efficient immature oocyte cryopreservation.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (12), 1531-1539 (2013).</li>
<li>Moussa, M., Shu, J., Zhang, X., Zeng, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mammalian+oocytes+and+embryos%3A+current+problems+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives.</a> Science China Life Sciences. 57 (9), 903-914 (2014).</li>
<li>Luvoni, G., Pellizzari, P., Battocchio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+slow+and+ultrarapid+freezing+on+morphology+and+resumption+of+meiosis+in+immature+cat+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Effects of slow and ultrarapid freezing on morphology and resumption of meiosis in immature cat oocytes.</a> Journal of Reproduction and Fertility. Supplement. 51, 93-98 (1997).</li>
<li>Calvo, J. J., Robert, D., Viqueira, M., Lombide, P., Calvo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrified+and+in+vitro+matured+oocytes+viability+from+adult+housecat+%28Felis+catus%29+in+reproductive+season%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">Vitrified and in vitro matured oocytes viability from adult housecat (Felis catus) in reproductive season.</a> International Journal of Morphology. 33 (4), (2015).</li>
<li>Nowak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viability+of+Serval+%28Leptailurus+serval%29+and+Pallas+Cat+%28Felis+manul%29+oocytes+after+cryopreservation+using+the+Rapid-I+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Cryo+Letters%22%5BJournal%5D)">The viability of Serval (Leptailurus serval) and Pallas Cat (Felis manul) oocytes after cryopreservation using the Rapid-I Method.</a> Cryo Letters. 40 (4), 226-230 (2019).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

הקפאה הקריוגנית היא טכניקת שימור מכרעת, במיוחד בתחום המינים בהם מינים רבים בסכנת הכחדה, כגון משפחת פליקס. בכתב יד זה, פרוטוקול פשוט וידידותי לשדה לויטריפיקציה של החתול הילדותי אוציטים הוצג. מדיה מתוצרת מעבדה, אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה תומך ועובדים מיומנים הם גורמי מפתח להצלחת שיטה זו, אשר מאפשר קבלת האוציטים קיימא בעקביות ושוב, כפי שמוצג על ידי תוצאות הנציגים דיווחו בזאת.
החל בהכנה תקשורתית, יש לעקוב אחר הפרוטוקול באופן מדויק כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר, אך מיומנויות המפעיל הן הסו...

הקפאה הקריוגנית הפכה לשלב מפתח של טכניקות שעתוק בסיוע (אומנויות). בבני אדם, היא מאפשרת שימור פוריות או דחייה של ההורות מסיבות רפואיות או אישיות. בבעלי חיים, יש צורך להתגבר על מרחק וזמן במקצועות מתוכננים, בעיקר בבעלי חיים חקלאיים ובחיות מחמד, או לשמר חומר גנטי של נושאים יקרי ערך בתוכניות שימור, במיוחד במינים פראיים בסכנת הכחדה. שמירת המשחק היא הבחירה הטובה ביותר כאשר אנשים להיות מתרבה לא נבחרו עדיין או על מנת למנוע בעיות אתיות הקשורות לקיפאון העובר, במיוחד ברפואה האנושית1. הזרע קל יחסית לשמר ולתת תוצאות משביע רצון לאחר הפשרה, אבל oocytes, בשל התכונות הקונסטרוקטיביות שלהם, יכול להיות מורכב יותר לאחסן. ואכן, היחס הנמוך של פני השטח/נפח, כמו גם הנוכחות של הסונה pellucida סביב האופלמה, מגביל את התנועה של הcryoprotectants והמים על פני התא2. יתר על כן, בעלי חיים ביתיים כולל felids, הם מאופיינים על ידי ציטופלסמה עשיר ליפיד, אשר נחשב להפוך אותם רגישים יותר לקריוגנית3.
רוב הפלאידים מאוימים, והחתול המקומי משמש כמודל לפיתוח פרוטוקולים לשימור גארפלמטר בזכות הזמינות של הגונדות מניתוח שגרתי. בחיות בר, הגונדות ניתן להשיג לאחר ניתוחים בחירה או (לעתים קרובות יותר) לאחר המוות, ולא בוגר (בתוספת vesicle לפוחית) מגיים ניתן לאחזר. גירוי הורמונלי שנועד לקבל בוגרת (מטאמשלב II) oocytes אינו נפוץ כמו באמנויות האדם בגלל הסוגיות המוסריות ואת התגובה הספציפית מיני לטיפולים4.
לכן, ההתפתחות של אסטרטגיות הקריואופרסטית התמקדה gametes בוגרים, אשר בדרך כלל ניתן לאחזר לאחר מוות בלתי צפוי או פתאומי של אנשים נדירים. מבחינה ביולוגית של השקפה, ישנם כמה הבדלים הקריוגנית של משחטים בוגרים או מבוגרים, כל אחד בעל יתרונותיה. ראשית, ה-DNA הוא מוגן יותר oocytes בוגר, אשר שלפוחית נבטי מכיל כרומוזומים מוקפת קרום גרעיני, בעוד הציר meiotic של השנייה oocytes יכול להיות פגיע יותר לקריופציעות5. שנית, נזק הנגרמת על ידי הצטננות השלד עשוי להשפיע על סיבוב ציר, הגוף שחול הקוטב, הגירה ברורה ו ציטוקינזה, אשר יכול להיות השפעות שונות על פי השלב ההתפתחותי oocyte, השפעה על התקדמות מיוזה או לאחר הפריה אירועים. בסופו של דבר, ואולי החשוב ביותר, בעוד oocytes בוגרת מוכנים להיות מופרית, בוגרים גמטות להסתמך על התמיכה של תאי קומולוס המקיפים לעבור התבגרות גרעינית cytoplasmic6, וזו הסיבה מדוע תלולית השלם מתחמי oocyte (cocs) הם cryopreserved. עם זאת, אובדן של תאים קומולוס ו/או אובדן של חיבור פונקציונלי בין תא רבייה והתאים הסומטיים שמסביב הם כנראה ההשפעה הפוגעת ביותר של הקריוגנית של cocs בלתי מפותחים.
בין טכניקות הקפאת שיריון, ויטריפיקציה הוא אחד כי ניתן להחיל בקלות רבה יותר בתנאי שדה. לעומת איטי (או שיעור מבוקר) קופא, ויטריפיקציה הוא מהיר יותר אינו דורש ציוד ספציפי, כגון מקפיא לתכנות. על מנת לספק את שלושת העקרונות הבסיסיים של ויטריפיקציה (כלומר, צמיגות גבוהה, מחובר לריכוז כימיות גבוה, כרכים קטנים וירידה בטמפרטורה מהירה), מספר מדיה ותמיכה במיוחד פותחו ובשימוש אצל חתולים עבור האוזציטים הן בוגרות והן בוגרת. החל עם קשיות פשוטה7, התקנים פותחו אז כדי להגיע "נפח מינימלי" המטרה. קריולופ8, פתח משכו קשיות (OPS)9, מרזבים פלסטיק (שונה קש)10 ו קריוצינוריות11 כבר בשימוש, עד מכשיר יעיל יותר (כלומר, קריוטופ) היה מועסק11, שיפור הישרדות ו היוסיס חידוש. קריוטופ (משלים איור 1) היא תמיכה מסחרית הפכה להיות מערכת פתוחה בחירה עבור ויטריפיקציה. פותח עבור הויטריפיקציה של האדם האוציטים ועוברים, הוא מורכב רצועת סרט קטן המצורפת בעל פלסטיק קשיח, מוגן על ידי כובע צינור פלסטיק במהלך אחסון12. בזכות השימושיות שלה ועל הפחתת הקיצונית ויטריפיקציה volume (מעט כמו 0.1 μl), אשר גם מוביל לשיעורי קירור מהירה ביותר ומחמם, זו תמיכה ויטריפיקציה הוחל יותר ויותר במינים מספר, כולל החתול המקומי, שבו הוא שימש עם מגוון רחב של מדיה13,14,15,16,17.
מטרת כתב היד הזה היא לתאר את הפרוטוקול אוסף-ויטריפיקציה-התחממות, עם שינויים קלים מן האחד שפותחה במקור עבור הנגיף האנושי, אשר מעסיקה מעבדות מתוצרת מסחרית ותמיכה מסחריים עבור אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה והוא יכול להיות בקלות להחיל בתנאי שדה עבור קריוגנית של חתולים בלתי מפותחים COCs.

<table><tbody><tr><td>אמפוטריצין B</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2942</td><td>/</td></tr><tr><td>פיפטות אוטומטיות וטיפים</td><td></td>/<td>/</td><td>דרוש לפיפטה 20, 100, 240 ו-300 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>אזמלים כירורגיים</td><td>/</td><td>/</td> <td>מידה 10 זה בדרך כלל בסדר</td></tr><tr><td>מקור בונסן</td> <td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr> <tr><td>מהדקים</td> <td>/</td><td>/</td> <td>חלקם קטנים (מהדק יתושים) לבידוד שחלות, חלקם גדולים יותר (מהדק קלמר) לעבודה בחנקן נוזלי</td></tr><tr><td>Cryotop</td><td>Kitazato (מפיץ: MBT - Medical Biological Technologies)01.CR</td><td></td> <td>המפיצים והמספר הקטלוגי עשויים להשתנות במדינות שונות</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D2650</td><td>/</td></tr><tr><td>אתילן גליקול (EG)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E9129</td><td>/</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F9665</td><td>/</td></tr><tr><td>פיפטות פסטר מזכוכית</td><td></td>/<td>/</td><td>אורך מומלץ 230 מ"מ (100+130)</td></tr><tr><td>גובלט</td><td></td>/<td>/</td><td>על פי מיכלי מיכל האחסון</td></tr><tr><td>חימום stage</td><td>/</td><td>/</td> <td>כל החימום stage בסדר, כל עוד הם יכולים לשמור על 38&; C</td></tr><tr><td>חנקן נוזלי</td> <td>/</td><td>/</td><td>/</td></tr> <tr><td>בינוני 199</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M4530</td> <td>/</td></tr> <tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8662</td> <td>/</td></tr> <tr><td>פניצילין G נתרן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3032</td> <td>/</td></tr> <tr><td>אלכוהול פוליוויניל (PVA)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8136</td> <td>/</td></tr> <tr><td>צלחת</td> <td>ReproKitazato (מפיץ: MBT - Medical Biological Technologies)</td><td>01.K-2</td><td>המפיצים והמספר הקטלוגי עשויים להשתנות במדינות שונות</td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ</td>/<td></td><td>/</td><td>כל עוד המפעיל יכול לבחור את הביציות, סטריאומיקרוסקופים אחרים בסדר</td></tr><tr><td>מיכל אחסון</td><td>/</td><td></td><td>/כל מיכל מלא באופן קבוע הוא בסדר</td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9137</td><td>/</td></tr><tr><td>קלקר / קופסה עמידה בחנקן</td> <td>/</td><td>/</td> <td>כל הקופסאות שיכולות להכיל חנקן נוזלי הן בסדר, כל עוד המפעיל מרגיש בנוח. קופסת Kitazato נקראת "מתלה קירור"</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td>/</td></tr><tr><td>טיימרים</td><td>/</td><td>/</td><td>כל הטיימרים שניתן להגדיר בזמנים עד 9 דקות הם בסדר</td></tr></tbody></table>

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

בתוכניות השימור של חיות הבר, הבנקאות המגיים חיונית לשמירה על משאבים גנטיים של אנשים יקרי ערך ומינים נדירים ולקדם שימור ביולוגי. ב-felids, רוב המינים מאוימים בפני הכחדה, וגזעים ביתיים משמשים כמודל כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולים עבור בנקאות germplasm. בין טכניקות הקפאת הקריוציט, ויטריפיקציה הוא יותר ויותר פופולרי ב אדם וטרינרי בסיוע רבייה. קריוטופ ויטריפיקציה, אשר פותחה לראשונה עבור האדם oocytes ועוברים, הוכיחה להיות מתאים היטב עבור החתול oocytes. שיטה זו מציעה מספר יתרונות, כגון הכדאיות בתנאי שדה ומהירות ההליך, שיכולה להועיל כאשר יש צורך לעבד מספר דגימות. עם זאת, היעילות תלויה מאוד בכישורי המפעיל, ובקביעת הסדר הפנים-מעבדה, ובהתאם לצורך בהכשרה לאנשי צוות. פרוטוקול זה מתאר כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים בתמיכה מסחרית בפרוטוקול צעד אחר צעד ידידותי לשדה, מאוסף oocyte להתחממות. בעקבות הפרוטוקול, שימור שלמות oocyte ויכולת הכדאיות בהתחממות (גבוה ככל 90%) ניתן לצפות, למרות שעדיין יש מקום לשיפור התבגרות שלאחר ההתחממות ותוצאות פיתוח עובריים.

בעקבות החתול oocyte ויטריפיקציה ומתחמם בהתאם לפרוטוקול הנוכחי (איור 1 ומשלים איור 1), הרוב המכריע של גיים לשרוד. לאחר ויטריפיקציה, בין טכניקות אחרות, יכולת הכדאיות ניתן להעריך במיקרוסקופ אופטי כמו שלמות מורפולוגית22 או עם שימוש של כתמים חיוניים. אחד האחרונים הוא fluorescein diacetate/propidium יודיד (ה-FDA/PI), אשר מאפשר זיהוי של קיימא (פלואורסצנטית ירוק בהיר) ותאים מתים (זריחה אדומה). איור 2 מראה תמונה מייצגת של החתול הח...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור אמצעי האחסון המינימלי של ויטריפיקציה של חתולים בלתי בוגרים עם מדיה מתוצרת מעבדה על תמיכות מסחריות. הוא מכסה כל צעד מ oocyte בידוד מ vivo גונדות לשעבר כדי ויטריפיקציה והתחממות.

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

פרוטוקול זה שימושי לשימור ארוך טווח של הביציות החתוליות באמצעות טכניקת קריו-שימור הידועה בשם vitrification, החיונית לשימור פוריות ומגוון ביולוגי במין בעלי חיים. היתרונות העיקריים של vitrification הם המהירות שלה מאז זה יכול להסתיים בתוך פחות מ 17 דקות ואת ההיתכנות שלה בתנאי שדה אם חנקן נוזלי זמין. החתול הביתי הוא מודל בר קיימא לחתולים בסכנת הכחדה פראית.פיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקולי cryopreservation יאפשרו הקמת ביובנקים gamete עבור תוכניות שימור חתולים. התחל על ידי הכנת צלחת vitrification Repro עם שלוש בארות חרוט בשורה אחת. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של פתרון שיווי משקל לבאגם הראשון ו-300 מיקרוליטרים של פתרון ויטריפינציה לבאנות השנייה והשלישית.כדי לצייד את קומפלקסים cumulus oocyte, או COCs, להשתמש פיפטה קטנה נשא להעביר קומפלקס אחד או יותר לתחתית הבאר הראשונה. לאט להוסיף 20 microliters של פתרון שיווי משקל לגבול של הירידה ולחכות שלוש דקות, ולאחר מכן להוסיף עוד 240 microliters של פתרון שיווי משקל ולחכות תשע דקות. בזמן ההמתנה, הכינו קופסה עם חנקן נוזלי ותייגו תמיכה בוויטריפיקציה עם הניסוי או קוד זיהוי החתול.שים את התיבה ותמיכה ליד מיקרוסקופ הסטריאו. לאחר שיווי המשקל של ה- COCs, בצע vitrification בפחות מ- 90 שניות. כדי להפוך את ה- COCs לבלתי מוסריים, מלאו את הפיפיטה הקטנה בתסרון הוויטריפיקצי

minimum-volume-vitrification-of-immature-feline-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כתב יד זה מתאר גישה ניסיונית מורפולוגית וביוכימית לאפיין ביציות סוסים. באופן ספציפי, העבודה הנוכחית מדגימה כיצד לאסוף ביציות של בוגר בוגרת ובוגרת על ידי אולטראסאונד מונחה איסוף ביצית (OPU) וכיצד לחקור הפרדה כרומוזום, מורפולוגיה ציר, acetylation היסטון גלובלי, ביטוי mRNA.

ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

שימור קריופרציה של Oocyte מוכר על ידי מספר חברות מדעיות בינלאומיות כסטנדרט הזהב לשימור פוריות אצל נשים לאחר הפוסט-פוסט-פוריות. אסטרטגיות קליניות ומעבדות מתאימות מבטיחות יעילות מרבית, יעילות ובטיחות של טיפולי שימור פוריות.

שימור פוריות באמצעות ויטריפיקציה של אוציט: פרספקטיבות קליניות ומעבדתיות

הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.

ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים

צוות ייעודי יכול להציע למטופלות מאייר-רוקיטנסקי-קוסטר-האוזר את האפשרות לבצע גירוי שחלות מבוקר ושימור ביציות בהקפאת בזמן הווגינופלסטיקה הלפרוסקופית.

שליפת ביציות לפרוסקופיות ושימור בהקפאה במהלך וגינופלסטיקה לטיפול בתסמונת מאייר-רוקיטנסקי-קוסטר-האוזר

מוצג פרוטוקול לוויטריפיקציה של רקמת השחלה, כשיטת שימור הקפאה חלופית להקפאה איטית הנפוצה.

ויטריפיקציה של רקמת קליפת המוח השחלתית להשגת מצב זגוגי של צבירה

פרוטוקול זה מתאר שיטות סטנדרטיות לבידוד ועיבוד נוזל זקיקים, תאים סומטיים וביציות לא בשלות מהליכי הפריה חוץ גופית, המאפשרים ניתוחים מולקולריים ותאיים באיכות גבוהה. גישות אלו תומכות במחקר תרגומי על פוריות, הזדקנות רבייה ותפקוד לקוי של השחלות באמצעות חומרים המושלכים בדרך כלל בטיפול קליני.

אוסף נוזל זקיקי אנושי, תאים סומטיים של זקיקים וביציות לא בשלות מאנשים העוברים הפריה חוץ גופית

פרוטוקול זה מתאר הליכים לבשלות חוץ-גופית של ביציות עכברים, הפריה חוץ-גופית , ותרבות עוברים לשלב הבלסטוציסט.

ביציות עכברים בבגרות במבחנה, הפריה ותרבות עוברים לפני ההשתלה

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

למד את פרוטוקול ויטריפיקציה בנפח מינימלי לשימור זרעוני חתולים לא בוגרים. השיטה מאפשרת הקמת בנקי גמטות לשימור מגוון ביולוגי של חתוליים בסכנת הכחדה.

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

גלה סרטונים נוספים