בידוד וטיפוח של תאי גזע מסנכימליים במח עצם מנדיבול בחולדות

מחקרים הראו כי BMSCs שמקורם בעצם הפנים הגולגולתית מציגים יכולות טובות יותר מאלו של עצמות ציריות ותוספתן. לכן, BMSCs של הלסת התחתונה נחשבים למשאב המועדף לפיתוח טיפולים עתידיים במחלות גולגולת. פרוטוקול זה משלב את היתרונות של היצמדות למח עצם שלם ומיון תאים פלואורסצנטיים כדי להשיג מספר משמעותי של BMSCs מטוהרים של הלסת התחתונה תוך זמן קצר.

אם אתם מנסים את הפרוטוקול הזה בפעם הראשונה, אני חושב שחשוב מאוד להבין את המבנה האנטומי ואת התנועה התפקודית של הלסת התחתונה של החולדה, שניתן להשיג על ידי צפייה בסרטון זה או קריאת ספרות קשורה. לאחר המתת חסד של החולדה, הניחו אותה במכסה אדים נקי במצב שכיבה. חותכים את שרירי העור והבוצ'ינטורה מאנגולוס אוריס דו-צדדי לאזור האחורי של הלסת

פתח את פיה של החולדה על ידי דחיפת החותכות המקסילריות והלסתות התחתונות לכיוון ההפוך בשני האגודלים, כדי לחשוף את שיני הלסת התחתונה, המחוברות ללסת התחתונה. נתק לחלוטין את שרירי הבוקאלי והגידים המחוברים לקורקואידים ולגבול התחתון של הלסת התחתונה. לאחר מכן לחץ על השיניים האחוריות של הלסת התחתונה וסובב אותן אחורה ומטה עד שהקונדילים משני הצדדים נחשפים בבירור.

הפרד את גוף הלסת התחתונה מהגולגולת, ונקה את הרקמה הרכה ההדבקה על פני העצם באמצעות גזה רטובה. מניחים את העצם בכלי זכוכית סטרילי בגודל 10 ס"מ מלא במינימום אלפא חיוני מקורר מראש, או PBS על קרח, כדי לשמר את הכדאיות. חתכו את העצם הקדמית לאורך הקצה המזיאלי של הטוחנת הראשונה מגוף הלסת התחתונה, ואז הסירו את ראמוס הלסת התחתונה כולל קורקואיד וקונדיל לאורך הקצה הדיסטלי של הטוחנת השלישית כדי לחשוף את חלל המח.

ממלאים צלחת זכוכית סטרילית בגודל 10 ס"מ ב -10 מיליליטר אלפא-MEM עם 10% FBS. שאפו את המדיום עם מזרק של 10 מיליליטר, ואז הכניסו את המחט לחלל מח העצם ושטפו שוב ושוב את מח העצם לתוך הצלחת. יש לשטוף את חלל העצם לפחות שלוש פעמים משני הצד המזיאלי והדיסטלי של העצם בהתאמה, עד שהעצם הופכת ללבנה.

מעבירים את המדיה המכילה את התאים השטופים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, וצנטריפוגה במהירות של 800 סל"ד ולמשך חמש דקות. השליכו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את התאים עם שלושה מיליליטר של אלפא-MEM עם 10% FBS. צלחת את התאים בצלחת תרבית חדשה של 10 סנטימטרים ודגירה אותם ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני של 5%.

שאפו את מדיום התרבות ושטפו את המנה עם PBS. מוסיפים שני מיליליטר של 0.25% טריפסין עם 0.02% EDTA בצלחת ומעכלים את התאים ב -37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף ארבעה מיליליטר של אלפא-MEM עם 10% FBS כדי לעצור את התגובה.

העבירו את מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה אותו במהירות של 800 סל"ד למשך חמש דקות. השעו מחדש את התאים ב -120 מיקרוליטר PBS עם 10% FBS לאחר צנטריפוגה. העבירו 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרו צנטריפוגה חדש.

חסום את תרחיפי התאים עם מיקרוליטר אחד של נוגדן כנגד CD16 עד CD32 בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, וצבוע את התאים בנוגדנים מצומדים PE כנגד CD45, נוגדן מצומד FITC כנגד CD90 ונוגדני APC כנגד CD29, בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בחושך. השתמש ב-20 המיקרוליטרים האחרים של תרחיף התאים כבקרה שלילית לא מוכתמת. צנטריפוגה את הצינורות ב 800 סל"ד למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים ב-0.5 מיליליטר PBS עם 10% FBS. הוסף 10 מיקרוליטר של 0.01 מיליגרם למיליליטר DAPI 10 דקות לפני הניתוח. השתמש במסננים של 40 ננומטר המונחים על צינורות צנטריפוגה כדי לסנן את התאים, ולאחר מכן נתח את התאים על סדרן תאים המופעל פלואורסצנטי.

ראשית הסר תאים מתים מספירת התאים הכוללת על ידי שער תאים שליליים DAPI, ולאחר מכן שער עבור CD29 חיובי, CD90 חיובי, CD45 שלילי, בתאים שנבחרו כ-mBMSCs ממוקדים. אסוף את ה-mBMSCs הממוינים לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר אלפא-MEM עם 10% FBS. צנטריפוגה את הצינורות ב-800 סל"ד למשך חמש דקות והסר את מאגר האיסוף.

הוסף מיליליטר אחד של מדיום טרי כדי להשעות את התאים, ואז צלחת אותם בצלחת תרבית של שישה סנטימטרים. באמצעות פרוטוקול זה, חלק גדול מהתאים נדבקו לצלחת ביום השלישי לאחר התרבית הראשונית. לאחר שלושה עד ארבעה ימים נוספים של תרבית, מפגש התאים הגיע ל-70 עד 80%מיון תאים פלואורסצנטיים שימש לטיהור mBMSCs שהיוו כ-81.1% בתאי P0.

לאחר תרבית P2 mBMSCs בצלחת של שש בארות במשך שבוע, נצפתה כמות משמעותית של יחידות יוצרות מושבה. כדי להעריך את יכולת ההתמיינות הרב-שושלת של ה-mBMSCs הם הושרו לשושלות אוסטאו-כונדרו ואדיפו. פעילות מוגברת של ALP, גושים אדומים תחת צביעה אדומה של אליזרין, וביטוי מוגבר של גנים ספציפיים אוסטאוגניים Runx2, Alp, Bsp ו-Ocn, הצביעו על אינדוקציה אוסטאוגנית.

צביעת שמן-אדום-O שימשה לזיהוי אדיפוגנזה. ואקואולים עשירים בשומנים רבים ניכרו לאחר תשעה ימים של זירוז. יתר על כן, הביטוי של גנים ספציפיים אדיפוגניים Ppar-gamma-1 ו-Cebpa גדל.

הדגימות הראו צביעה חיובית לכחול אלציאני במהלך תצפית מיקרוסקופית של התמיינות כונדרוגנית. בנוסף, צביעה חיסונית עם נוגדן קולגן אנטי סוג II הראתה הצטברות מוגברת של מטריצת סחוס. הבטחת הכדאיות של mBMSCs חשובה מאוד בפרוטוקול זה.

ניתן להשיג מטרה זו על ידי בחירת חיית ניסוי מתאימה, פעולה על קרח וקיצור זמן הניסוי. באמצעות מודל מבחנה זה, ניתן להשיג מספר גבוה של BMSCs מנדיבולריים מתפשטים, מה שעשוי להקל על חקר המאפיינים הביולוגיים, התגובה שלאחר מכן למיקרו-סביבה ויישומים אחרים של BMSCs מנדיבולריים.