זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים
8 ביולי 2020
מיקרו-רנ"א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאמת בקלות את השינוי של מיקרו-רנ"א בנפרופתיה IGA באמצעות מודל של בעלי חיים קטנים, מה שמאפשר לחקור נפרופתיה IGA ללא ביופסיה של כליה אנושית. הפרוטוקול יכול לספק תובנות חדשות לגבי הגנטיקה של נפרופתיה IGA, מה שעשוי לסייע בגילוי שיטות אבחון וטיפול חדשות למחלת הכליות. לאחר שווידאתם שהעכבר מורדם כראוי, השתמשו במספריים ובמלקחיים כירורגיים כדי לבצע חתך בקו האמצע של שלושה עד ארבעה סנטימטרים בדופן הבטן של העכבר ולזהות את שני צידי הכליה.
חתכו את הצלעות והסרעפת כדי לחשוף את הלב. לאחר חיתוך הפרוזדור הימני, הזריק PBS לחדר השמאלי עד שצבע הכליה משתנה לצהוב חיוור, מה שמצביע על כך שכל גוף העכבר מלא ב-PBS. חותכים את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, ואז מסירים את הכליה.
הומוגניזציה של דגימות הכליה של 30 מיליגרם באמצעות הומוגנייזר סיליקון ו-700 מיקרוליטר של מגיב ליזה מבוסס פנול גואנידין בטמפרטורת החדר. העבירו את הליזאט לעמוד הסיבוב של גריסת הביופולימר וצנטריפוגה אותו בחום של 15, 000 גרם למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. המשך בטיהור RBNA לפי הוראות כתב היד.
לאחר הכביסה הסופית, הוסף 30 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לעמוד הספין המבוסס על קרום הסיליקה וצנטריפוגה אותו ב-8,000 גרם למשך דקה אחת כדי לסלק את ה-RNA. לסינתזת cDNA, הכינו תערובת מאסטר עם שני מיקרוליטרים של תערובת חומצות גרעין, שני מיקרוליטרים של תערובת טרנסקריפטאז הפוכה וארבעה מיקרוליטרים של מאגר בסך הכל שמונה מיקרוליטר לדגימה. הוסף שמונה מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של רצועת צינור של שמונה בארות.
לדלל את סך ה-RNA במים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, הוסף 12 מיקרוליטר מתמיסת ה-RNA הכוללת לכל באר של הרצועה. מניחים את הדגימות בתרמוסייקלר ומדגרים אותן בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות, ולאחר מכן בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.
כדי לבצע PCR כמותי בזמן אמת, הכינו את תערובת המאסטר לפי הוראות כתב היד, ולאחר מכן הוסיפו 22.5 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של לוחית תגובה של 96 בארות. הוסף 2.5 מיקרוליטר של ה- cDNA המוכן לכל באר. הנח את לוחית התגובה במכשיר ה-PCR בזמן אמת.
לאחר מכן, תכנת אותו להפעלה ראשונית ב-95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורי דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לכמת את ביטוי הגנים בשיטת דלתא-דלתא CT. פרוטוקול זה שימש לחקירת רמות הביטוי של מיקרו-רנ"א בכליות של עכברי HIGA באמצעות הכליות של עכברי Balb/c כביקורת.
נמדדו רמות הביטוי של שלושה מיקרו-רנ"א הקשורים לנפרופתיה IGA. רמות ביטוי המיקרו-RNA היחסיות של שתי הקבוצות הושוו באמצעות מבחן T עם P של פחות מ-0.05 מובהק סטטיסטית. miR-155-5p התבטא ברמות גבוהות פי 3.3 בקבוצת HIGA בהשוואה לקבוצת הביקורת, ו-miR-21-5p התבטא ברמות גבוהות פי 1.58.
ביטוי miR-1461-5p לא היה שונה באופן משמעותי בין שתי הקבוצות. כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב ללבוש מסכה, כפפות וכובע ולשמור על שולחן המעבדה וכלי המעבדה נקיים על מנת למנוע מנוקלאז בסביבה להשפיע על הניסוי. שיטה ניסויית זו נמצאת כיום בשימוש מעשי במעבדה שלנו.
מטרתו, לבסס שיטות אבחון וטיפול חדשות לנפרופתיה IGA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה מהימנה לגילוי רמות ביטוי של microRNA בכליות של מודל עכבר עם נפרופתיה מסוג IgA. השיטה מאפשרת לחקור את מעורבותם של microRNAs בנפרופתיה מסוג IgA ללא צורך בביופסיות של כליות אנושיות.
מרכיבי המחקר המרכזיים
תחום מדעי
- נפרולוגיה
- מחקר MicroRNA
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- נפרופתיה IgA היא מחלה של הכליות המאופיינת בשיקוע של IgA בגלומרולי.
- למיקרו-RNA תפקיד משמעותי בפתוגנזה של מחלות שונות, כולל הפרעות בכליות.
- הבנת הביטוי של מיקרו-RNA יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני המחלה.
- שיטות נוכחיות לחקר מיקרו-RNA דורשות לעיתים קרובות פרוצדורות פולשניות.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להערכת רמות של microRNA במודל עכבר של נפרופתיה IgA.
- סיוע למחקר על ההיבטים הגנטיים של נפרופתיה IgA.
- בחינת גישות אבחוניות וטיפוליות פוטנציאליות למחלות כליה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בעכברי HIGA כמודל לנפרופת IgA.
- מתן הרדמה לעכבר לפני הניתוח.
- טכניקות כירורגיות לגישה לכליות, כולל חתך בקו האמצע והוצאת איברים.
- פרפוזיה של העכבר ב-PBS כהכנה להוצאת הכליות.
תוצאות עיקריות
- השיטה שפותחה מאפשרת אימות קל של שינויים ב-microRNA בנפרופת IgA.
- תובנות שיתקבלו משיטה זו עשויות להוביל לכלי אבחנה חדשים.
- פוטנציאל לגילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול בנפרופת IgA.
- ביטול הצורך בביופסיות של כליות אנושיות במחקרים מקדימים.
מסקנות
- שיטה זו מחזקת את ההבנה של מעורבות ה-microRNA בנפרופת IgA.
- היא פותחת נתיבים חדשים למחקר של גנטיקה של מחלות כליות.
- גישה זו עשויה להשפיע באופן משמעותי על פיתוחים אבחנתיים וטיפוליים עתידיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
פרוטוקול זה מאפשר לצוותי מו"פ בביופארמה לאפיין את ביטוי ה-microRNA במודל עכבר מתוקף של nefropathy IgA, ובכך לתמוך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתוכניות למחלות כליות. על ידי אספקת שיטה הניתנת לשחזור לגילוי רמות miRNA משתנות ללא צורך בביופסיות אנושיות, הוא מקל על גילוי מוקדם של סמנים ביולוגיים ומטרות טיפוליות עם ביטחון חיזוי משופר. גישה זו עולה בקנה אחד עם מאמצים בשלב הגילוי לחקירת מנגנוני מחלה ותיעדוף מועמדים לפיתוח פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות שינויים בביטוי של miRNA הקשורים למחלה בעכברי HIGA לעומת קבוצות ביקורת.
- ערך תפעולי: מספק תהליך עבודה אמין לתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות qRT-PCR למדידת רמות miR-155-5p, miR-21-5p ו-miR-146a-5p.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיק פיתוח על ידי זיהוי miRNAs עם שינויים משמעותיים סטטיסטית במכפלה (למשל, פי 3.3 עבור miR-155-5p) כסמנים ביולוגיים או מטרות פוטנציאליים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק נתוני ביטוי miRNA כמותיים וניתנים לשחזור, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות במסגרת קמפיינים של סריקת גילוי.
- ערך תפעולי: קובע פרוטוקול סטנדרטי לטיהור RNA ולסינתזת cDNA התואם לפלטפורמות qRT-PCR של תפוקה גבוהה.
- מוכנות הבדיקה: מייצר ערכי CT מנורמלים באמצעות שיטת delta-delta CT, המאפשרת השוואה בין דגימות ואישור פגיעות (hits).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: משתמש במודל עכברים HIGA הרלוונטי למחלה כדי לגשר בין ממצאי הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני של מסלולים המתווכים על ידי miRNA.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מאפשר להעריך שינויים בביטוי miRNA הקשורים להשקעת IgA, ובכך להפחית עמימות במנגנון המטרה לפני זיהוי המועמד המוביל.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת מדדים עקביים וכמותיים מרקמת הכליה בכל קבוצות המחקר.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, תומכת בבדיקת השערות באישור מטרה ומייצרת פלטים כמותיים עבור תהליכי סריקה ואנליזה המנחים החלטות בזיהוי מובילים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת הבהרה של מסלולים על ידי מדידת שינויים בביטוי miRNA הקשורים לפתוגנזה של נפריופתיה IgA במודל גנטי של עכברים.
- סריקה: מייצרת נתוני miRNA כמותיים וסטנדרטיים המתאימים להערכת השפעות של תרכובות על מסלולים מטרים במבחנים המשכיים.
- אנליטיקה: יוצרת ערכי delta-delta CT ומדדי שינוי (fold-change) המאפשרים לצומי מחקר להשוות בין תנאים ולהעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות T-tests.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאי miRNA משלב הגילוי לרציפות פרה-קלינית באמצעות שימוש במודל מאושר של נפריופתיה IgA בעל רלוונטיות פנוטיפית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פרוטוקול הניתן לשימוש חוזר להפקת RNA ו-qRT-PCR, שניתן להחיל על מטרות miRNA מרובות בפרויקטים של מחלות כליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באמצעות מדידה ישירה של הפרה של miRNA במודל מחלה.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור וסטנדרטיזציה באמצעות פרמטרים מוגדרים לטיהור RNA, סינתזת cDNA ו-qRT-PCR (למשל, סנטריפוגה ב-8,000 G, דגירה ב-37°C).
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) על ידי אספקת נתוני ביטוי בעלי מובהקות סטטיסטית (p<0.05) לצורך תיעוד עדיפות של מטרות בעלות קשר חזק למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של סמני ביולוגיים או מטרות טיפוליות מבוססות miRNA על בסיס גודל השינוי (fold-change) והשחזוריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים במכרסמים, בטיפול ב-RNA וב-qRT-PCR כדי למנוע פירוק על ידי נוקלאז ולהבטיח את שלמות הדגימות.
- תלוי בגישה לציוד הומוגנציה, צנטריפוגה, תרמוסייקלר ומכשיר real-time PCR עם זיהוי פלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור כמות ה-RNA המוכנסת (30 mg כליה), נפחי ריאגנטים (700 μL ריאגנט ליזיס) ותנאי מחזוריות (אקטיבציה ב-95°C, 40 מחזורים).
- דורש התאמה של סטים של פריימרים למטרות miRNA ספציפיות, תוך שמירה על טמפרטורות היברידיזציה (55°C) והארכה (70°C) עקביות.
- מוגבל לניתוח RNA בנקודת סיום; אינו מספק רזולוציה מרחבית או רזולוציית תא בודד בתוך רקמת הכליה ללא מתודולוגיות נוספות.
