דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ההתפתחות והמחלה של צרורות אקסונים באמצעות אורגנואיד עצב מוטורי שמקורו בתאי iPS אנושיים מחוץ לגוף. פשוט על ידי גידול ספרואיד עצבי ושבבי מיקרו-תרבות בהתאמה אישית, ניתן ליצור חבילות אקסונים חד-כיווניות באופן ספונטני ולהשתמש בהן לניסויים שונים במורד הזרם. אורגנואיד עצב מוטורי יכול להקל על סינון ובדיקה של תרופות למחלות נוירונים מוטוריים, כולל LS, על ידי מתן מודל פיזיולוגי יותר שקודמים למערכות מבחנה.

במכסה אדים, ולבוש את ה-PPE המתאים, הוציא שלושה מיליליטר של SU-8 2100 על פרוסת סיליקון נקייה באצטון והנח את הוופל במרכז ציפוי מסתובב. תקן את הוופל בוואקום וסובב את הוופל במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך 10 שניות כדי לצפות את ה-SU-8 באופן אחיד על פני משטח הוופל, ולאחר מכן סובב את הוופל במהירות של 1,500 סיבובים לדקה למשך 30 שניות עם תאוצה של 300 סיבובים לשנייה כדי לקבל שכבה בעובי 150 מיקרון של התנגדות לאור על הוופל. לאחר אפייה רכה, יש להצמיד את מסכת הפוטו לקשתיות היישור של המסכה ולחשוף את הוופל לאור אולטרה סגול למשך 60 שניות.

לאחר האפייה על צלחת חמה, יש לפתח את הוופל למשך 10 עד 20 דקות במפתח פוטו-רזיסט עם תסיסה על שייקר מסלולי, ולשנות את התמיסה המתפתחת פעם אחת במהלך התהליך. להכנת השכבה התחתונה של השבב לתרבית רקמות, שפכו PDMS טריים שהוכנו על הוופל לעובי הרצוי ופרקו את התערובת בתא ואקום. רפאו את ה-PDMS בתנור למשך שלוש שעות לפחות בחום של 60 מעלות צלזיוס.

לאחר הקירור, השתמש בלהב כדי לחתוך את ה-PDMS הנרפא מהרקיק, ולאחר מכן השתמש ב-PDMS לא נרפא עם אפייה כדי לחבר מאגר בינוני לשכבה התחתונה של ה-PDMS כדי להשיג את שבב תרבית הרקמה PDMS המורכב. כדי להכין את שבב ה-PDMS להיווצרות אורגנואידים עצביים מוטוריים, יש לעקר את השבב וכוס מיקרוסקופ בגודל 76 על 52 מילימטר בצלחת פטרי המכילה 70% אתנול למשך שעה לפחות. בתום הדגירה, הניחו את השבב על זכוכית המיקרוסקופ הרטובה.

לאחר ייבוש לילה, השבב צריך להיצמד לזכוכית. הנח טיפה של 30 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף מדוללת ב-DMEM/F12 בצד אחד של כניסת התעלה ושאב את התמיסה מהצד השני של הכניסה כדי לצפות את פני המיקרו-ערוץ במטריצה. לאחר מכן דגרו את שבב ה- PDMS עם תמיסת הציפוי בצלחת פטרי למשך שעה בטמפרטורת החדר.

כדי לגרום להתמיינות תאי iPS תלת מימדיים לנוירונים מוטוריים, זרעו ארבע פעמים 10 לתאי iPS הרביעיים לכל באר לתוך המספר המתאים של בארות של צלחת U תחתונה של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים מזין ונטול סרום בתוספת 10 מיקרו-מולרי Y-27632. למחרת, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרו-SB431542 ו-100 ננו-מולרי LDN-193189. בימים השני והשלישי, החלף את הסופרנטנטים ב-100 מיקרוליטר של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרו-SB431542, 100 ננו-מולרי LDN-193189, חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרומולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד.

בימים הרביעי והחמישי, החליפו את הסופרנטנטים בתערובת של 75% של מדיום KSR ו-25% של מדיום N2 בתוספת 10 SB431542 מיקרו-מולרי, 100 LDN193189 ננו-מולרי, חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרומולרית אחת ואגוניסטים מוחלקים מיקרו-מולאריים אחד. בימים השישי והשביעי, החליפו את הסופרנטנטים בתערובת של 50% מדיום KSR ו-50% מדיום N2 בתוספת חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרו-מולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד. בימים השמיני והתשיעי, החליפו את הסופרנטנטים בתערובת של 25% של מדיום KSR ו-75% של מדיום N2 בתוספת חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרו-מולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד.

בימים 10 ו-11, החלף את הסופרנטנטים במדיום N2 בתוספת חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרו-מולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד. ביום ה-12, החלף את הסופרנטנטים בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום התבגרות בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח לכל באר. כדי לגרום להיווצרות אורגנואידים של עצב מוטורי, החלף את תמיסת הציפוי בשבב ה-PDMS ב-150 מיקרוליטר של מדיום התבגרות בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח והשתמש בקצה מיקרופיפט רחב כדי להוסיף בעדינות נוירונים מוטוריים ספרואידים מבאר אחת של צלחת 96 הבארות לכניסה של המיקרו-ערוץ של השבב.

מניחים מאגר קטן של מים סטריליים ליד שבב תרבית הרקמה בכלי כדי למנוע אידוי בינוני ומניחים את המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כל יומיים-שלושה, החלף מחצית ממדיום התרבית המותש ממרכז מאגר המדיום במדיום התבגרות טרי בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח. אקסונים יגדלו מהנוירון המוטורי לתוך התעלה, ויתאספו באופן ספונטני לצרור יחיד במשך תקופה של שבועיים-שלושה ליצירת אורגנואיד עצב מוטורי.

נוירונים מוטוריים מתמיינים תוך 12 עד 14 ימים בהליכי התמיינות תלת מימדיים. חשוב לציין, יותר מ-60% מהתאים מבטאים את סמן הנוירונים המוטוריים HB9 במהלך ההתמיינות וכ-80% מהתאים בספרואיד הנוירון המוטורי הם חיוביים ל-SMI32. כאשר המיקרו-ערוץ משמש כמדריכים פיזיים, האקסונים מתארכים מהספרואיד של הנוירון המוטורי ויוצרים צרור על ידי אינטראקציה אקסו-אקסונלית תוך 24 שעות מרגע ההחדרה לספרואיד.

האקסונים הגיעו למרכז המיקרו-ערוץ במהלך שלושת עד ארבעה הימים הבאים, והתפשטו לקצה השני של המיקרו-ערוץ לאחר 10 ימים נוספים. ניתן לאסוף אורגנואידים עצביים מוטוריים מהשבב לניתוח ביולוגי על ידי ניתוק ה-PDMS מזכוכית המיקרוסקופ. לאחר מכן ניתן לנתח ולבודד את צרורות האקסונים וגופי התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות סכין כירורגית או פינצטה.

בצרורות אקסונים של אורגנואידים עצביים מוטוריים, חלבוני סמן דנדריטי אינם מזוהים על ידי כתמים מערביים. חשוב לוודא שהספרואידים נופלים לחלוטין לתחתית בתוך שבב התרבית. הראינו בחינה של האתרים והחלק התחתון יכול לעזור לקבוע את מיקום הכדור בשבב.

ניתן לבחון את צרורות האקסונים המבודדים עבור שיטות נוספות שונות. ניתן להשיג כמות גדולה של אקסונים ולהשתמש בהם לבדיקות ביוכימיות הדורשות חומרים משמעותיים.