Name: דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: חקור ייצור אורגנואידי עצב מוטורי תלת מימדי מתאי iPS אנושיים באמצעות שבב PDMS מותאם אישית. שיטה זו מאפשרת מחקר התפתחות אקסונים וסינון תרופות למחלות נוירון מוטורי כמו ALS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקים בסיוע למחקר מדעי 17H05661 ו 18K19903, Core-2-core תוכנית, ומעבר AI המכון.

<ol><li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li>
<li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Src%2Fc-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li>
<li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+axons+tell+each+other%3A+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li>
<li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li>
<li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421(2018).</li>
<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li>
<li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li>
<li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li>
<li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).</li>
<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

במסגרת פרוטוקול זה, פטנט כבר מורשה Jiksak Bioengineering, Inc. אשר נוסדה על ידי ג'ירו קוואדה.

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של אורגנואיד עצב מוטורי (MNO) אשר יש צרור אקסון המורחבת מספרואיד נוירון מוטורי שנוצר מתאי iPS אנושיים. צרור האקסון שנוצר הוא עבה, גמיש ומאורגן היטב במבנים חד-כיווניים. על ידי ניתוח צרור האקסון, ניתן להשיג חלבון אקסונלי ו- RNA בטוהר גבוה מספיק לניתוחים ביוכימיים. פעילות עצבית ניתן למדוד בחבילות אקסון וספרואידים עם הדמיית סידן. זיהום של חלבונים גרעיניים ודנדריטיים בליסט האקסונלי לא זוהה על ידי סופג מערבי, והוכיח שהשיטה שלנו הפרידה ביעילות אקסונים מגופי תאים ודנדריטים.
אחד היתרונות של פרוטוקול זה הוא בידול מהיר ויצירת MNO מצויד צרור אקסון, שבו כל התהליכים יכולים להיעשות ב 4 שבועות עם פרוטוקול 3D ו 5-6 שבועות באמצעות פרוטוקול 2D. זה קצר בהשוואה לפרוטוקולים אחרים אשר בדרך כלל לקחת 3-4 שבועות פשוט להבדיל לתוך MN מתאי גזע עובריים ותאי iPS17 וזה לוקח 2-4 שבועות נוספים כדי לקבל התארכות אקסון. פרוטוקול תלת-ממד מועדף בדרך כלל על-פני פרוטוקול דו-ממדי בשל זמן הבידול הקצר יותר, פחות שלבים והסיכונים הטכניים המופחתים ללא שלב הניתוק בהשוואה לפרוטוקול הדו-ממדי. שבב תרבות הרקמה המבוסס על מיקרופלואידים תוכנן באופן כך שהאקסונים של MNS יוכלו להאריך לכיוון התא השני דרך המיקרו-שאנל, המאפשר היווצרות צרור של אקסונים על ידי גרימת אינטראקציות אקסו-אקסונליות וזיקה בין אקסונים. בגלל ההגדרה הניסיונית הפשוטה, כל הפרוטוקולים המתוארים כאן יכולים להתבצע לא רק על ידי ביו-הנדסה, המכירים את המניפולציה של שבב תרבות רקמות, אלא גם ביולוגים וחוקרי מוח שאינם מכירים מיקרופלואידים וטכניקות מיקרו-פיבריקציה. יש לציין כי שלבים 1 ו- 2 יכולים להתבצע גם באמצעות שירות ייצור חיצוני.
אחד הצעדים הקריטיים להשגת הפרוטוקול הוא שינוי רציף של מדיום תרבותי. מומלץ לשנות לחלוטין את מדיום התרבות בכל שלב במהלך הבידול, כך שגורמים במדיום המושקע לא יפריעו לבידול MN. נקודה קריטית נוספת של פרוטוקול זה היא לשמור על תאי iPS מובחנים באיכות טובה. איכות תרבות התאים הראשונית של iPS משפיעה באופן משמעותי על היעילות להשגת נוירונים מוטוריים ו- MNO. נקודה נוספת היא כי הקוטר של MNS צריך להיות קטן יותר מגודל החור של השבב (1.5 מ"מ). ספרואידים גדולים יותר אינם יכולים להיכנס לתא, ועלולים לחוות נמק היפוקסי חמור בחלק המרכזי. ניתן לשלוט בגודל של MNSs על ידי שינוי מספר זריעה ראשוני של תאי iPS (בפרוטוקול 3D) או נוירונים מוטוריים (בפרוטוקול דו-ממדי). יש למטב את צפיפות הזריעה של תאים עבור כל קו תא iPS.
מכשירים מיקרופלואידיים ממודרים עם מיקרוגרובים ומסנני נקבוביות קטנים שימשו באופן נרחב להפרדת אקסונים מגופי תאים ודנדריטים. טכניקה זו יכולה גם להפריד אקסונים מגופי תאים ודנדריט, עם שפע מעולה של אקסונים ברקמות ארוזות. בהשוואה לשיטות אחרות, מגבלה מרכזית אחת של שיטה זו היא שהיא אינה יכולה להפריד בין שתי מדיה תרבותית שונה בעיצוב הנוכחי של שבב תרבות הרקמה, המעכב את היכולת של תרבות משותפת של שני תאים שונים הדורשים שתי מדיה נפרדת. מגבלה נוספת היא כי שבב PDMS לשים הגבלה קבועה מראש על גודל הרקמה. ספרואיד גדול יותר מהחור לא יכול להיכנס לתא, וחבילת האקסון לא יכולה להיות עבה יותר מרוחב הערוץ המיקרופלואידי.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים אחרים של נוירונים. הקבוצה שלנו הראתה יכולת מודל של מערכת מוחית באמצעות שיטה שונה בשילוב עם טכניקות אורגנואיד מוחי18. ספירואידים קליפת המוח הוכנסו לשני התאים והאקסונים התארכו באופן ספונטני הדדית לכיוון כל ספרואיד, ולאחר מכן צרור אקסון נוצר באופן ספונטני. כתוצאה מכך, ניתן לחבר שני כדוריות קליפת המוח באמצעות צרור אקסון, ואת הרקמה ניתן להשיג כחתיכה אחת. זה מדגים כי הגישה היא מאוד תכליתי כדי ליצור רקמות צרור אקסון ללא קשר לסוגי תאים עצביים. בפרוטוקול זה, תאי iPS אנושיים שימשו, עם זאת, תאי גזע אחרים כולל תאי ES אנושיים ותאי גזע עצביים אנושיים עשויים לשמש עם שינויים בפרוטוקול המוצג. 3D spheroids של נוירונים יכול להיווצר על ידי פרוטוקולים מגוונים19,20. שיטה זו של ביצוע רקמות עם צרור אקסון יכול להיות משולב בעתיד עם פרוטוקולי בידול אחרים להכנת כדורי MN 3D. בנוסף, עובי ואורך צרור האקסון ניתן לשלוט פשוט על ידי שינוי הרוחב והגובה של microchannels של שבב תרבות הרקמה להתפתחויות עתידיות.
אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לשמש בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים שבבסיס הפיתוח והמחלות של fascicles אקסון.

נוירונים מוטוריים בעמוד השדרה (MN) מרחיבים את האקסונים לשרירי השלד כדי לשלוט בתנועת הגוף. המסלולים האקסונליים שלהם מאורגנים ומוסדרים מאוד בתהליך ההתפתחותי. למרות מחקרים רבים על הארכת אקסון והדרכה1, מנגנונים להיווצרות צרור אקסון מאורגן עדיין תחת חקירה. אקסונים של נוירונים מוטוריים נפגעים לעתים קרובות על ידי מחלות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)2, אבל מנגנונים פתופיזיולוגיים של הנזק על fascicles אקסון מובנים היטב. לפיכך, מודל פיזיולוגי ופתולוגי לסיכום היווצרות צרור אקסון ורגרסיה נדרש בתחום.
נוירון מוטורי שמקורו בתאי גזע אנושיים הוא פלטפורמה מבטיחה להבנת ההתפתחות והמחלות כגון ALS3. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (תאי iPS) יכולים לשמש למודל מחלות באמצעות תאים שמקורם בחולה. עד כה, שיטות בידול שונות מתאי גזע פלוריפוטנטיים לתוך MN דווחו4,5,6. עם זאת, אקסונים של נוירונים בתרבות דו מימדית מכוונים באופן אקראי ואינם מסכמים מחדש במיקרו-ווירון vivo בתוך עצבים מתפתחים שבהם אקסונים מורכבים באופן חד כיווני באמצעות אינטראקציות אקסו-אקסונליות צפופות7. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו טכניקה ליצירת רקמה תלת מימדית הדומה לעצב מוטורי מתאי iPS אנושיים8, וקראנו לרקמה אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO). MNO מורכב מגופי תאים הממוקמים בספרואיד נוירון מוטורי (MNS) ו fascicle אקסונלי המורחבת מן הכדוריד. האקסונים ב fascicle הם בעלי אוריינטציה חד כיוונית, אשר דומה אקסונים בפיתוח עצבים מוטוריים. לפיכך, MNOs באופן ייחודי לספק microenvironment אקסונלי פיזיולוגי, אשר לא נעשה על ידי כל שיטות אחרות שפותחו בעבר תרבות עצבית.
בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לייצור שבבי תרבית רקמות, התמיינות נוירון מוטורי מהירה, היווצרות אורגנואיד עצב מוטורי בשבבים מפותחים. שבב תרבית הרקמות שלנו הוא פשוט מאוד, והוא מכיל רק תא לקבלת ספרואיד, מיקרו-שאנל ליצירת צרור אקסון, ותא לדיור מסופי אקסון. המכשיר אינו מכיל מבנים מורכבים כולל microgrooves או מסנני micropore המשמשים לעתיםקרובותכדי להפריד אקסונים וגופי תאים לפי גודל 9,10. לפיכך המכשירים שלנו ניתן לפברק בקלות על ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול זה אם הגדרת פוטוליטוגרפיה זמין.
בידול מהיר של תאי iPS אנושיים מושגת עם שילוב ממוטב של גורמי גרימת ודוגמת (SB431542, LDN-193189, חומצה רטינואית (RA), אגוניסט החלקה (SAG)) וגורמי תאוצה (SU5402 ו- DAPT). דווח כי השילוב של SU5402 ו- DAPT מאיץ את הבידול של נוירונים היקפיים ותאי ציצה עצביים11. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שלוש שיטות שונות ליצירת MNOs, כך שהקוראים יוכלו להחליט על שיטה המתאימה ביותר לצרכיהם. אנו ממליצים לבצע בידול של תאי iPS אנושיים לאחר יצירת ספרואיד (שיטת 3D), שכן MNS מובחן יכול להיות מועבר ישירות לתוך שבב תרבית רקמה. לחלופין, תאי iPS אנושיים יכולים להיות מובחנים לתוך נוירונים מוטוריים בתרבות monolayer (2D), ולאחר מכן נוצר לתוך כדורי נוירון מוטורי תלת מימדי כפי שדיווחנו בעבר8. עדכנו את הפרוטוקול, ועם שיטת הבידול התלת מימדית המתוארת בפרוטוקול זה, ניתן להימנע מהמעבר מד"ד לתלת-ממד וניתן להשיג MNOs עם זמן בידול קצר יותר, פחות שלבים וסיכונים טכניים מופחתים ללא שלב הניתוק. נוירונים זמינים מסחרית יכולים לשמש גם כדי ליצור MNS כדי להפחית את הזמן עבור בידול.
כדי ליצור MNO, אנחנו תרבותיים MNS בשבב תרבות הרקמות. האקסונים מתעלים מהספרואיד ומתרחבים למיקרו-שנל שבו האקסונים מתאספים ומתיישרים באופן חד-כיווני. זה מקל על אינטראקציה אקסו-אקסונלית והיווצרות ספונטנית של רקמת צרור חד כיוונית מורכבת היטב של אקסונים במיקרו-שאנל, אשר מושגת באופן ייחודי על ידי פרוטוקול זה, ואילו היווצרות צרור ספונטני או אוריינטציה אקסונית מודרכת לבדה יכולה להיות מושגת על ידי פרוטוקולים אחרים12,13,14. בניסוי טיפוסי, תאים מעטים נודדים מספרואידים למיקרו-שנל ורוב התאים נשארים ספרואידים סמוכים. שיטה זו מאפשרת להפריד אקסונים באופן ספונטני מהספרואידים מבלי להשתמש במחסומים פיזיים תלויי גודל (למשל, מיקרוגרובים או מסנני מיקרופור) כדי להפריד אקסונים מגופי תאים.
MNO וכתוצאה מכך יכול להיות נתון לבדיקות שונות, כולל ניתוחים מורפולוגיים, ביוכימיים ופיזיים. גוף התא וחבילת האקסון המורחבת יכולים להיות מבודדים פיזית על ידי חיתוך וניתן לנתח אותם בנפרד לניסויים במורד הזרם, למשל, מבחנים ביוכימיים. חומרים ביולוגיים כולל RNA וחלבון ניתן לבודד רק כמה חבילות אקסון עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כולל RT-PCR ו סופג המערבי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד עצבי מוטורי מתאי iPS, המציע מודל פיזיולוגי ופתולוגי אטרקטיבי לחקר המנגנון שבבסיס ההתפתחות והמחלה של שרירי האקסון.

<table><tbody><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה מימית 16% Paraformaldehyde (formaldehyde)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200&micro; l טיפים רחבים לפיפט</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td></td><td>ICT AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף (50X)</td> <td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF)</td><td>Wako</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX תוסף</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת מטריג'ל (מטריצת ממברנת הבסיס)</td><td>קורנינג</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 נוגדן</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>נוירון מוטורי iCell (נוירונים מוטוריים שמקורם בתאי iPS אנושיים זמינים מסחרית)</td><td>דינמיקה תאית</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול (IPA)</td> <td>Wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>החלפת סרום נוק אאוט</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>סיגמא</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה MEA</td><td>Alpha MED Scientific inc</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100x) (NEAA)</td> <td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ זכוכית</td><td>מטסונאמי</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוסף</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist SU-8 2100</td><td>Microchem</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>משטח ראשוני 96U</td><td>Sumitomo Bakelite</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR (מגיב מעבר)</td> <td>Stem Cell Technologies</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>Wako</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת סיליקון</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>סילפוט 184 w/c ערכת</td><td>Dow Toray</td><td>Silpot 184 w/c kit</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 מפתח</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin I נוגדן</td><td>Millipore</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express נוזל ללא פנול אדום (תמיסת דיסוציאציה)</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

צואה של אקסונים היא אחד המוטיבים המבניים העיקריים שנצפו במערכת העצבים. שיבוש של fascicles אקסון יכול לגרום למחלות התפתחותיות ונוירודגנרטיביות. למרות מחקרים רבים של אקסונים נערכו, ההבנה שלנו של היווצרות ותפקוד לקוי של fascicles אקסון עדיין מוגבל בשל היעדר מודלים תלת מימדיים חזקים במבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לדור המהיר של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPS) הנגרמים על ידי בני אדם בשבב תרבות רקמות מבוסס מיקרופלואידי. ראשית, ייצור שבבים המשמשים לשיטה מתואר. מתאי iPS אנושיים, נוצר ספרואיד נוירון מוטורי (MNS). לאחר מכן, מערכת ה-MNS המבודלת מועברת לשבב. לאחר מכן, האקסונים גדלים באופן ספונטני מתוך הכדורית ומתכנסים לתוך שקע בתוך מיקרו-שנל המצויד בשבב, אשר מייצר רקמת MNO הנושאת צרור של אקסונים המורחבים מהספרואיד. לניתוח במורד הזרם, ניתן להוציא MNOs מהשבב כדי להיות קבוע לניתוחים מורפולוגיים או לנתח ניתוחים ביוכימיים, כמו גם הדמיית סידן והקלטות מערך רב אלקטרודות. MNOs שנוצר עם פרוטוקול זה יכול להקל על בדיקות סמים סינון והוא יכול לתרום להבנת מנגנונים הבסיסית פיתוח ומחלות של fascicles אקסון.

נוירונים מוטוריים נבדלו תוך 12-14 ימים בהליכי בידול תלת-ממדיים (איור 4 ואיור 5). חשוב לציין, יותר מ 60% מהתאים הביעו סמן נוירון מוטורי HB9 במהלך הבידול. אימונוהיסטוכימיה גילתה שכ-80% מהתאים במערכת העצבים החוץ-ארגונית היו נוירונים מוטוריים חיוביים SMI32. HB9 ו SMI32 הם הוקמה בשלב מוקדם נוירון מנוע סמנים15,16. הביטוי של HB9 ו- SMI32 הם הפרמטרים העיקריים שיש לאשר כדי להבטיח זהות תאית של נוירונים מוטוריים. לאחר כניסתה של MNS לתוך שבב התרבות, אקסונים להרחיב לתוך הערוץ ואת צורות צרור אקסון. בשל מיקרו-ערוצים המשמשים כמדריכים פיזיים, האקסונים מתעלים מה-MNS ויוצרים חבילה באמצעות אינטראקציה אקסו-אקסונלית(איור 6A). זה חיוני כדי לאשר את היווצרות צרור האקסון על ידי תצפית מיקרוסקופית כדי לאשר את הדור של MNO. MNO מוצלח נושא צרור אקסון רחב יותר מ 50 מיקרומטר וכמה אקסונים מבודדים מתוך החבילה בערוץ. התארכות ראשונית של אקסונים ניתן לראות 24 שעות לאחר כניסתה של ספרואיד. בתוך 3-4 הימים הבאים, האקסונים הגיעו למרכז המיקרו-שנל ואז מגיעים לקצה השני תוך 10 ימים נוספים(איור 6A). כתוצאה מכך, האקסונים התאספו ויצרו צרור ישר וחד כיווני ב 2-3 שבועות בשבב, ופעילויות עצביות נצפו לאחר מכן.
ניתן לאסוף אורגנואידים של עצבים מוטוריים מהשבב על ידי ניתוק ה- PDMS מזכוכית המיקרוסקופ לצורך ניתוח ביולוגי (איור 6B). ניתן לנתח ולבודד חבילות אקסון וגופי תאים באמצעות חיתוך באמצעות סכין כירורגית או פינצטה מתחת למיקרוסקופ (איור 6B). חומרים ביולוגיים אלה כולל RNA וחלבון יכולים לשמש עבור מבחנים ביוכימיים רגילים כגון RT-PCR ו סופג המערבי. בחבילות אקסון של MNOs, חלבונים גרעיניים או יצרנים דנדריטיים אינם מזוהים בנפח המערבי(איור 6C).
בשילוב עם מחוון סידן (Fluo-4 AM), פעילות עצבית ניתן ללכוד שבב תרבות הרקמה. פעילות ספונטנית של נוירונים מוטוריים בספרואיד ובחבילת האקסון נצפתה בתוך MNO. כמו כן, הפעילויות העצביות נצפו באמצעות מערכת מערך רב אלקטרודה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> איור 1: הממד של שבב תרבות הרקמות PDMS. (A)פוטומסק של שבב תרבות הרקמות. (B)מידות של מיקרו-שנל בשבב תרבית הרקמות. קוטר תא הבסיס להחזקת ספרואיד נוירון מוטורי הוא 2 מ"מ והחור של PDMS מעל התא הוא 1.5 מ"מ. הרוחב והגובה של מיקרו-שאנל המגשר בין שני תאים הם שניהם 150 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> איור 2: איור סכמטי של בידול נוירונים מוטוריים. (A) צעדי הבידול כללו אינדוקציה עצבית, דפוס לתוך שושלת נוירון מוטורי, והתבגרות של נוירונים מוטוריים. (B)שתי אפשרויות ליצירת ספירואיד נוירון מוטורי (MNS) מתאי iPS: פרוטוקול תלת-ממד, ופרוטוקול דו-ממדי עם שלב הניתוק של נוירונים מוטוריים. אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) ניתן להשיג על ידי שני הפרוטוקולים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> איור 3: פרוטוקול צעד אחר צעד לציפוי מטריצת קרום מרתף והצגת כדוריות של נוירונים מוטוריים. (A)ציפוי מטריצת קרום מרתף בערוץ של שבב תרבות הרקמות. (B)כניסת MNS לתוך החור של השבב. (ג)שינוי תרבותי בינוני על ידי שאיפה של מדיום מותש. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> איור 4: בידול בין נוירונים מוטוריים דו-ממדיים ותל-ממדיים. (A)קורס זמן של בידול MNS תלת-ממדי מייצג (פרוטוקול תלת-ממד). גודלו של מערכת העצבים המרכזית גדל בהדרגה עם הזמן. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (ב) משך זמן של בידול דו-ממדי ב- -D2, D0, D1, D6, D12 (פרוטוקול דו-ממדי). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> איור 5: אפיון של נוירונים מוטוריים. (A)(משמאל) הקפאה של מערכת MNS מוכתמת בנוגדן SMI-32 וב-DAPI. (אמצע) אני לא יכול לעשות את זה. תמונת ניגודיות פאזה של מערכת MNS שהושלכה מחדש על משטח מצופה מטריצת ממברנה במרתף. התארכות אקסונלית נצפתה. (מימין) אני לא יכול לעשות את זה. אקסונים של MNS replated מוכתם נוגדנים סינפסין I ו Tuj1. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר (שמאל ואמצע) ו 50μm (ימין). (B)תמונה מייצגת של נוירונים מוטוריים דו-מימדיים עם נוגדני Tuj ו- HB9. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> איור 6: אפיון אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) שנוצר בשבב תרבות. (A)תמונות מייצגות של התארכות אקסון והיווצרות צרור אקסון עבה על D32. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B)חיסון של אורגנואיד עצבי מוטורי (MNO) על ידי SMI-32 ו- DAPI. אקסונים וגופי תאים יכולים להיות מבודדים על ידי חיתוך פיזי. סרגל סולם: 1 מ"מ. (C) טוהר החלבון מאקסונים וגופי תאים מכמתים על ידי סופג מערבי. MAP2, סמן דנדריטי, לא זוהה בחלבון אקסונלי, ואילו סמן אקסונלי Tau1 מועשר בחלבון האקסונלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מספק הליך מקיף כדי ליצור אורגנואיד עצב מוטורי iPS האנושי נגזר באמצעות הרכבה ספונטנית של חבילה חזקה של אקסונים המורחבת מספרואיד בשבב תרבית רקמות.

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס ההתפתחות והמחלה של צרורות אקסונים באמצעות אורגנואיד עצב מוטורי שמקורו בתאי iPS אנושיים מחוץ לגוף. פשוט על ידי גידול ספרואיד עצבי ושבבי מיקרו-תרבות בהתאמה אישית, ניתן ליצור חבילות אקסונים חד-כיווניות באופן ספונטני ולהשתמש בהן לניסויים שונים במורד הזרם. אורגנואיד עצב מוטורי יכול להקל על סינון ובדיקה של תרופות למחלות נוירונים מוטוריים, כולל LS, על ידי מתן מודל פיזיולוגי יותר שקודמים למערכות מבחנה.במכסה אדים, ולבוש את ה-PPE המתאים, הוציא שלושה מיליליטר של SU-8 2100 על פרוסת סיליקון נקייה באצטון והנח את הוופל במרכז ציפוי מסתובב. תקן את הוופל בוואקום וסובב את הוופל במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך 10 שניות כדי לצפות את ה-SU-8 באופן אחיד על פני משטח הוופל, ולאחר מכן סובב את הוופל במהירות של 1,500 סיבובים לדקה למשך 30 שניות עם תאוצה של 300 סיבובים לשנייה כדי לקבל שכבה בעובי 150 מיקרון של התנגדות לאור על הוופל. לאחר אפייה רכה, יש להצמיד את מסכת הפוטו לקשתיות היישור של המסכה ולחשוף את הוופל לאור אולטרה סגול למשך 60 שניות.לאחר האפייה על צלחת חמה, יש לפתח את הוופל למשך 10 עד 20 דקות במפתח פוטו-רזיסט עם תסיסה על שייקר מסלולי, ולשנות את התמיסה המתפתחת פעם אחת במהלך התהליך. להכנת השכבה התחתונה של השבב לתרבית רקמות, שפכו PDMS טריים שהוכנו על הוופל לעובי הרצוי ופרקו את התערובת בתא ואקום. רפאו את ה-PDMS בתנור למשך שלוש שעות לפחות בחום של 60 מעלות צלזיוס.לאחר הקירור, השתמש בלהב כדי לחתוך את ה-PDMS הנרפא מהרקיק, ולאחר מכן השתמש ב-PDMS לא נרפא עם אפייה כדי לחבר מאגר בינוני לשכבה התחתונה של ה-PDMS כדי להשיג את שבב תרבית הרקמה PDMS המורכב. כדי להכין את שבב ה-PDMS להיווצרות אורגנואידים עצביים מוטוריים, יש לעקר את השבב וכוס מיקרוסקופ בגודל 76 על 52 מילימטר בצלחת פטרי המכילה 70% אתנול למשך שעה לפחות. בתום הדגירה, הניחו את השבב על זכוכית המיקרוסקופ הרטובה.לאחר ייבוש לילה, השבב צריך להיצמד לזכוכית. הנח טיפה של 30 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף מדוללת ב-DMEM/F12 בצד אחד של כניסת התעלה ושאב את התמיסה מהצד השני של הכניסה כדי לצפות את פני המיקרו-ערוץ במטריצה. לאחר מכן דגרו את שבב ה- PDMS עם תמיסת הציפוי בצלחת פטרי למשך שעה בטמפרטורת החדר.כדי לגרום להתמיינות תאי iPS תלת מימדיים לנוירונים מוטוריים, זרעו ארבע פעמים 10 לתאי iPS הרביעיים לכל באר לתוך המספר המתאים של בארות של צלחת U תחתונה של 96 בארות ב-100 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים מזין ונטול סרום בתוספת 10 מיקרו-מולרי Y-27632. למחרת, החלף את הסופרנטנט בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרו-SB431542 ו-100 ננו-מולרי LDN-193189. בימים השני והשלישי, החלף את הסופרנטנטים ב-100 מיקרוליטר של מדיום KSR בתוספת 10 מיקרו-SB431542, 100 ננו-מולרי LDN-193189, חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרומולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד.בימים הרביעי והחמישי, החליפו את הסופרנטנטים בתערובת של 75% של מדיום KSR ו-25% של מדיום N2 בתוספת 10 SB431542 מיקרו-מולרי, 100 LDN193189 ננו-מולרי, חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרומולרית אחת ואגוניסטים מוחלקים מיקרו-מולאריים אחד. בימים השישי והשביעי, החליפו את הסופרנטנטים בתערובת של 50% מדיום KSR ו-50% מדיום N2 בתוספת חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרו-מולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד. בימים השמיני והתשיעי, החליפו את הסופרנטנטים בתערובת של 25% של מדיום KSR ו-75% של מדיום N2 בתוספת חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרו-מולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד.בימים 10 ו-11, החלף את הסופרנטנטים במדיום N2 בתוספת חמישה מיקרו-מולרי DAPT, חמישה מיקרו-מולרי SU5402, חומצה רטינואית מיקרו-מולרית אחת ואגוניסט מוחלק מיקרו-מולרי אחד. ביום ה-12, החלף את הסופרנטנטים בכל באר ב-100 מיקרוליטר של מדיום התבגרות בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח לכל באר. כדי לגרום להיווצרות אורגנואידים של עצב מוטורי, החלף את תמיסת הציפוי בשבב ה-PDMS ב-150 מיקרוליטר של מדיום התבגרות בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח והשתמש בקצה מיקרופיפט רחב כדי להוסיף בעדינות נוירונים מוטוריים ספרואידים מבאר אחת של צלחת 96 הבארות לכניסה של המיקרו-ערוץ של השבב.מניחים מאגר קטן של מים סטריליים ליד שבב תרבית הרקמה בכלי כדי למנוע אידוי בינוני ומניחים את המנה בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כל יומיים-שלושה, החלף מחצית ממדיום התרבית המותש ממרכז מאגר המדיום במדיום התבגרות טרי בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח. אקסונים יגדלו מהנוירון המוטורי לתוך התעלה, ויתאספו באופן ספונטני לצרור יחיד במשך תקופה של שבועיים-שלושה ליצירת אורגנואיד עצב מוטורי.נוירונים מוטוריים מתמיינים תוך 12 עד 14 ימים בהליכי התמיינות תלת מימדיים. חשוב לציין, יותר מ-60% מהתאים מבטאים את סמן הנוירונים המוטוריים HB9 במהלך ההתמיינות וכ-80% מהתאים בספרואיד הנוירון המוטורי הם חיוביים ל-SMI32. כאשר המיקרו-ערוץ משמש כמדריכים פיזיים, האקסונים מתארכים מהספרואיד של הנוירון המוטורי ויוצרים צרור על ידי אינטראקציה אקסו-אקסונלית תוך 24 שעות מרגע ההחדרה לספרואיד.האקסונים הגיעו למרכז המיקרו-ערוץ במהלך שלושת עד ארבעה הימים הבאים, והתפשטו לקצה השני של המיקרו-ערוץ לאחר 10 ימים נוספים. ניתן לאסוף אורגנואידים עצביים מוטוריים מהשבב לניתוח ביולוגי על ידי ניתוק ה-PDMS מזכוכית המיקרוסקופ. לאחר מכן ניתן לנתח ולבודד את צרורות האקסונים וגופי התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות סכין כירורגית או פינצטה.בצרורות אקסונים של אורגנואידים עצביים מוטוריים, חלבוני סמן דנדריטי אינם מזוהים על ידי כתמים מערביים. חשוב לוודא שהספרואידים נופלים לחלוטין לתחתית בתוך שבב התרבית. הראינו בחינה של האתרים והחלק התחתון יכול לעזור לקבוע את מיקום הכדור בשבב.ניתן לבחון את צרורות האקסונים המבודדים עבור שיטות נוספות שונות. ניתן להשיג כמות גדולה של אקסונים ולהשתמש בהם לבדיקות ביוכימיות הדורשות חומרים משמעותיים.

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הסרטון מדגים היווצרות של צמתים עצביים-שריריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי. תאים מבשרים עצביים ותאי אב שריריים נזרעים לבארות שונות בתוך המכשיר ונשארים להבשיל לנוירונים מוטוריים ולצינורות מיו, בהתאמה. יצירת נפח ושיפוע כימי מובילה להתפתחות של צמתים נוירומוסקולריים פעילים.

יצירת צמתים עצביים-שריריים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי

סרטון זה מדגים את השיטה ליצירת אורגנואידים עצביים מוטוריים על ידי טיפוח תחילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם בתווך מיוחד ליצירת ספרואידים, לאחר מכן התמיינותם לנוירונים מוטוריים באמצעות מעכבים ספציפיים, ולבסוף טיפוחם בשבב מיקרופלואידי כדי להרחיב אקסונים וליצור אורגנואידים עצביים מוטוריים.

פיתוח אורגנואידים עצביים מוטוריים אנושיים שמקורם ב-iPSC באמצעות שבב מיקרופלואידי

סרטון זה מדגים את ההתמיינות של תאי גזע עובריים אנושיים (תאי גזע עובריים) לנוירונים דופמינרגיים, כדי לספק מודל לחקר מחלת פרקינסון. תאי גזע עובריים בתרבית בתווך אינדוקציה עצבי בצלחת מיקרו-באר כדי ליצור נוירוספרות תלת-ממדיות. לאחר מכן הם מתורבתים במדיום אינדוקציה עצבי כדי לקדם את ההתמיינות לנוירוני אב דופמינרגיים. ההבשלה הסופית של תאי העצב מתרחשת בהחדרת תרבית בתנאי ממשק אוויר-נוזל, וכתוצאה מכך אורגנואידים תלת-ממדיים המורכבים מנוירונים דופמינרגיים בוגרים.

יצירת אורגנואידים עצביים דופמינרגיים מתאי גזע עובריים אנושיים

מחקר זה מציג ומתאר פרוטוקולים לגזור שני מסוימים נוירונואידים אנושיים האדם כמודל רלוונטי ומדויק עבור לימוד 1) התפתחות האדם הגלינובלסטומה בתוך אורגנואידים האדם באופן בלעדי בבני אדם ו 2) תא העצב הדואמיאנרגיות בידול היוצר אורגאיד תלת מימדי.

ארגונית עצבית אנושית לחקר סרטן המוח ומחלות ניווניות

אנו מתארים שיטה ליצירת יחידות מוטוריות אנושיות במכשירים מיקרופלואידיים זמינים מסחרית על ידי שיתוף פולחן נוירונים מוטוריים המושרה תאי גזע פלוריפוטנטים עם מיוטיובים ראשוניים אנושיים וכתוצאה מכך היווצרות של צמתים עצביים שריריים פעילים מבחינה תפקודית.

ייצור יחידות מוטוריות אנושיות עם צמתים נוירו-שריריים פונקציונליים במכשירים מיקרופלואידיים

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

במחקר זה, אנו מספקים טכניקה מפורטת למערכת תרבית אורגנואידים פשוטה אך חזקה בקליפת המוח באמצעות תרביות hPSC סטנדרטיות ללא הזנה. זהו פרוטוקול מהיר, יעיל וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים המדגימים היבטים של סנסנציית המוח במבחנה.

דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול סנסנציה עצבית במוח במבחנה

למרות שמערכת העצבים ההיקפית (PNS) היא מסוגלת תיקון משמעותי לאחר פציעה, מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים ומולקולריים הקובעים את התופעה הזאת. שימוש חי, דג הזברה מהונדס וassay חיתוך רוחב עצב לשחזור, אנחנו יכולים ללמוד התנהגויות תא גליה דינמיות במהלך ניוון עצבי והתחדשות.

חיתוך רוחב עצב מוטורי וזמן לשגות הדמיה של התנהגויות תא גלייה בדג הזברה לחיות

אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית משנים את תכונותיהם התפקודיות והמבניות בתגובה לגירויים מזיקים. דוח זה מציג פרוטוקול להערכת מורפולוגיה תלת מימדית של אסטרוציטים במצבי מחלה או לאחר התערבויות טיפוליות.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

פרוטוקול זה משתמש תלת מימדי (3D) טכניקות הדמיה וניתוח כדי להמחיש ולכמת המיטוכונדריה עצבים ספציפיים. הטכניקות ישימות למצבים אחרים שם אות ניאון אחד משמש כדי לבודד ערכת משנה של נתונים מ עוד אות ניאון.

הדמיה תלת-ממדית וניתוח של המיטוכונדריה בתוך סיבי עצב Intraepidermal אנושי

חקור ייצור אורגנואידי עצב מוטורי תלת מימדי מתאי iPS אנושיים באמצעות שבב PDMS מותאם אישית. שיטה זו מאפשרת מחקר התפתחות אקסונים וסינון תרופות למחלות נוירון מוטורי כמו ALS.

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

גלה סרטונים נוספים