בידול של מונוציטים לתוך מקרופאגים שונים Phenotypically לאחר טיפול עם תאי גזע דם חוט אנושי (CB-SC)נגזר אקסוזומים

הטיפול למחנך תאי גזע פותח לטיפול בסוכרת מסוג I ובטיפול במחלה האוטואימונית האחרת. שיטה זו פותחה כדי לחקור את מנגנון המולקולה שבבסיס המתינה החיסונית של טיפול מחנך תאי גזע באמצעות exosomes שוחרר CB-SC. פרוטוקול זה מספק הדרכה כיצד לטהר אקסוזומים מתרבות תאי גזע של תאי גזע של דם אנושי ולקבוע את אפנון החיסון שלהם של מונוציטים.

הדגמת ההליך תהיה וואי הו, דוקטורנטית, מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, צנטריפוגה CB-SC נגזר בינוני מותנה שלוש פעמים כמתואר בכתב היד טקסט, איסוף supernatant לתוך צינור חרוט חדש 50 מיליליטר לאחר כל צנטריפוגה. לאחר הצנטריפוגה השלישית, סנן את העל-טבעי המתקבל באמצעות מסנן מיקרוליטר של 0.22 והעבר 15 מיליליטר מדיה לכל יחידת סינון צנטריפוגלית של 10 קילודלטון.

צנטריפוגות ב 4, 000 x g במשך 30 דקות כדי לבודד את התקשורת exosome מרוכז. מעבירים את האקסוזומים המרוכזים לצינור אולטרה-מרכזי. ואז גלולה exosomes ב 100, 000 x גרם במשך 80 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

ואז להשליך את supernatant ולתלות מחדש את exosomes גלולה ב 10 מיליליטר של PBS. בצע אולטרה-מרכז סופי כדי לאסוף את גלולת האקסום ולתלות אותה מחדש ב-200 מיקרוליטרים של PBS. הוסף 30 מיליון PBMCs אנושיים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

תוסיפו את התאים ל-300 מיקרוליטרים של PBS קר ותוסיפו 60 מיקרוליטרים של חיידקים CD14. מערבבים היטב ו דגירה התאים על הקרח במשך 15 דקות. מוסיפים עוד שישה מיליליטר של PBS קר וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים גלולה ב 500 microliters של מאגר ריצה קר. מניחים את עמוד ההפרדה במפריד המגנט ושוטפים אותו שלוש פעמים עם שני מיליליטר של חיץ ריצה קר. העבר את התאים המתווסתים לעמודת ההפרדה ושחרר אותם.

שוב, לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם שני מיליליטר של חיץ פועל לכל לשטוף. ואז להרים את העמוד ממפריד מגנט ולמקם אותו מעל צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר על קרח. אלוט CD14 תאים חיוביים עם שני מיליליטר של חיץ ריצה קר צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי גלולה את התאים.

תעביר את גלולה בשני מיליליטר של מדיום סרום מוגדר כימי קר ולהעביר 50 microliters של אותו לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הכתם את התאים המתקבלים עם 10 מיקרוליטרים של נוגדנים אנטי-אנושיים CD14 אנטי-אנושיים של Krome Orange במשך 20 דקות. הוסף מיליליטר אחד של PBS וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות כדי גלולה את התאים.

תן שימוש חוזר לכדור התא ב-200 מיקרוליטרים של PBS ותעביר אותו לצינור של חמישה מיליליטר. קבע את הטוהר של CD14+מונוציטים לפי ציטומטריית זרימה. זרע מיליון מונוציטים מטוהרים המתקבלים בתרבות רקמות טיפלו צלחת שש באר דגירה במשך שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני.

לאחר הדגירה להשליך את supernatant בעדינות להוסיף שני מיליליטר של 37 מעלות מראש מחומם כימי מוגדר סרום תרבות בינונית, ולאחר מכן להוסיף 80 מיקרוגרם של exosomes CB-SC נגזר לתרבות מונוציטים בצלחת שש באר עם נפח כולל של שני מיליליטר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה עד ארבעה ימים. לאחר מכן תדמיין את מורפולוגיה התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך בהגדלה של פי 200.

הוסף מיליליטר אחד של מאגר ניתוק תאים מבוסס PBS כדי לנתק את התאים על-ידי צינור למעלה ולמטה וקצר את התאים הנותרים באמצעות מגרד תאים. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1, 690 x גרם במשך חמש דקות ו resuspend אותם 200 microliters של PBS. הוסף חמישה microliters של חוסם FC כדי לחסום את הכריכה הלא ספציפית, ולאחר מכן להוסיף את הנוגדנים.

דגירה התאים בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. הוסף מיליליטר אחד של PBS לתאים דגירה צנטריפוגה אותם ב 300 x גרם במשך 10 דקות. תוסיפו את גלולת ה-200 מיקרוליטר של PBS ותוסיפו חמישה מיקרוליטרים של פרופידיום יודיד לדגימה.

העבר את התאים לצינור זרימה חדש של חמישה מיליליטר ובצע ציטומטריית זרימה כדי להעריך את רמות הביטויים CD14, CD80, CD86, CD163, CD206 ו- CD209. הפנוטיפ והטוהר של CB-SCs נבדקו על ידי ציטומטריית זרימה עם סמנים הקשורים CB-SC. הניתוח הראה רמות גבוהות של CD45, OCT3/4, SOX2, CD270 ו galectin 9 ביטוי אבל שום ביטוי של CD34 נצפתה.

ניתוח ציטומטריית זרימה גם לאשר את הביטוי של סמנים ספציפיים exome, CD9, CD 81, ו CD63 על exosomes נגזר CB-SC. מורפולוגיה בגודל של אקסוזומים התאפיינה ב- TEM והתפלגות הגודל נקבעה על ידי DLS. כתם מערבי עוד יותר להוכיח את הביטוי של הסמן הקשורים Exome אליקס ללא ביטוי של הסמן הקשורים ER, calnexin.

האינטראקציה הישירה של Dio שכותרתו CB-SC-Exo עם PBMC נצפתה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטי. כדי להגדיר טוב יותר איזו אוכלוסיית תאים קיימה אינטראקציה עם החיוג שכותרתו CB-SC-Exo, תאי תאים שונים היו מגודרים עם סמנים ספציפיים לתאים, כגון CD3 לתאי T, CD11C עבור תאים דנדריטיים מיאלואידיים, CD14 עבור מונוציטים, CD19 עבור תאי B ו- CD56 עבור תאי NK. מונוציטים היו ממוקדים בעיקר על ידי אקסוזומים שמקורם ב- CB-SC מכיוון שהם הציגו רמות פלואורסצנטיות חציוניות גבוהות יותר מאלה של תאים חיסוניים אחרים.

המונוציטים המטופלים האקסוסום הבדילו בהצלחה למורפולוגיות דמויי ציר. הייתה עלייה ברמת סמנים הקשורים M2, כגון CD163, CD206, ו CD209 לאחר הטיפול עם אקסוזומים שמקורם CB-SC. השוואה פנוטיפית בין מקרופאגים M2 קונבנציונליים לבין מקרופאגים M2 הנגרמים על ידי CB-SC לא הראו הבדלים משמעותיים.

הצעד העיקרי בפרוטוקול זה הוא הוספת אקסוזומים שמקורם ב- CB-SC למונוציטים של תרבות בצלחת של שש בארות והדגירה במשך שלושה עד ארבעה ימים, אשר היה צריך את ההתברות של התא למאקרופאגים מסוג 2 אחרים עם מורפולוגיה דמוית ציר. לאחר מכן, אנו הולכים לחקור את רכיבי המולקולה בתוך אקסוזומים שמקורם ב- CB-SC שתרמו להפקת בידול של מונוציטים למאקרופאגים מסוג 2.