Name: אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: למדו אפיון ציטומטרי זרימה של תאי B מוריניים בבלוטות הפריטונאום, הטחול ומח העצם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח הטרוגניות תאית ופיתוח תרפיות אנטי-גוף במודלים עכבריים גנטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למת'יו סלימן על הקריאה הביקורתית של כתב היד. אנו מודים גם למחלקות הליבה של ויווריום וציטומטריה זורמת ברגנרון על תמיכתם במחקר זה.

כל מחקרי העכברים נוהלו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של Regeneron (IACUC). הניסוי נערך על רקמות משלושה עכברים נקבות C57BL/6J (גיל 17 שבועות) ממעבדות ג'קסון. יש לתעד את כל הנוגדנים לפני תחילת הניסוי כדי לקבוע ריכוז אידיאלי. בעת שימוש בחרוזי פיצוי לפיצוי בצבע יחיד, ודא שהם מכתימים בהירים או בהירים יותר מהדגימות שלך. שמור את כל המאגרים, הנוגדנים והתאים על קרח או ב 4 °C (70 °F). לאחר תוספת של צבע הכדאיות, לבצע את כל השלבים ואת הדגירה ב 4°C באור נמוך או בחושך.
1. קציר תאים צפק ובידוד תא בודד
<ol><li>המתת חסד את העכבר באמצעות CO2 או על פי פרוטוקול שאושר.
</li>
	<li>הנח את העכבר על גבו, ריסס עם 70% אתנול, וחתוך עור בטן החוצה עם מספריים, נזהר לא לחתוך את צפק.</li>
	<li>הזריקו 3 מ"ל של חוצץ כביסה קר כקרח (0.5% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב- DPBS [vol/vol]) לחלל הצפק עם מזרק 3 מ"ל המצויד במחט 25 מד.</li>
	<li>יש לעסות בעדינות את הצי בקצות האצבעות.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.</li>
	<li>הכנס מזרק 3 מ"ל מצויד מחט 18 G דרך צפק, נזהר כדי למנוע איברים ושומן.</li>
	<li>לחלץ את חוצץ לשטוף, עכשיו מכיל תאים צפק, ולהעביר צינור חרוט 15 מ"ל על קרח.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.3 ו- 1.4.</li>
	<li>חותכים חור קטן בצפק תוך כדי החזקה עם פינצטה.</li>
	<li>הכנס פיפטה העברה חד פעמית לתוך החור ולאסוף את חוצץ לשטוף הנותר, שוב הימנעות שומן ואיברים.</li>
	<li>העבר את התאים הניטורונים הנותרים שנאספו לצינור החרוט 15 מ"ל על קרח. הערה: יש להשליך דגימה אם זיהום הדם ניכר.</li>
	<li>לדגור על התאים על הקרח עד הטחול ואת מיצוי העצם הושלמו.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.</li>
	<li>resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של חוצץ לשטוף.</li>
	<li>לסנן את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי על קרח.</li>
	<li>קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.</li>
</ol>2. קציר טחול ובידוד תא בודד
<ol><li>הנח את העכבר על בטנו וחתוך דרך צפק על הישבן השמאלי באמצעות מספריים נקיים. חותכים את הטחול, מסירים שומן ורקמת חיבור.</li>
	<li>מעבירים את הטחול לצינור מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חוצץ כביסה על קרח.</li>
	<li>לדגור את הטחול על הקרח עד מיצוי העצם הושלם.</li>
	<li>העבר את הטחול לצינור דיסוציאציה אוטומטי עם 5 מ"ל של חיץ תמה של תאי דם אדומים. מניחים את הצינור על מכשיר דיסוציאטור הרקמה ומנתקים למשך 60 s כדי ליצור השעיה של תא בודד. הערה: מותר גם להשתמש בשיטות שגרתיות אחרות של השגת מתלים טחול חד-תאי כגון ניפוץ בין שקופיות זכוכית חלבית במאגר כביסה. אם נעשה שימוש בשיטה אחרת של דיסוציאציה, בצע את הניתוק עם צנטריפוגה, שאיפה, ולאחר מכן resuspension ב 5 מ"ל של מאגר תמוגה של תאי דם אדומים לפני שתמשיך לשלב 2.5.</li>
	<li>לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה של 4 °C המכיל 2m EDTA.</li>
	<li>מעבירים לצינור חרוט נקי 15 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.</li>
	<li>resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של 4 °C חיץ לשטוף.</li>
	<li>לסנן את התאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל נקי על קרח.</li>
	<li>קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.</li>
</ol>3. קציר BM ובידוד תא בודד
<ol><li>הסר את העור מהחצי התחתון של גוף העכבר. לקצץ את השריר עודף מהרגל. הסר את כל הרגל עם מספריים, נזהר לא לחתוך את עצם הירך. נקה את עצם הירך ואת השוקה על ידי הסרת השרירים, השומן והרגליים הנותרים.</li>
	<li>העבר את העצמות לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ל של חוצץ לשטוף על קרח.</li>
	<li>לנקב את החלק התחתון של צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, משאיר חור קטן מספיק לעצמות הרגל לא לבלוט. הכנס את צינור 0.5 מ"ל לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל נקי. חותכים את קצה עצם הירך והשוקה פרוקסימלי לברך ומניחים את הקצוות החתוכים עם הפנים כלפי מטה לתוך צינור 0.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 6,780 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (7 °F).</li>
	<li>Resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של חיץ תמה של תאי דם אדומים ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל נוספים של חיץ תמותה של תאי דם אדומים.</li>
	<li>דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של מאגר כביסה של 4 °C המכיל 2m EDTA.</li>
	<li>צנטריפוגות התאים ב 300 x גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (50 °F). שאף את סופר-טבעי.</li>
	<li>resuspend גלולה התא ב 3 מ"ל של 4 °C חיץ לשטוף.</li>
	<li>סנן תאים דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי נקי 15 מ"ל על קרח.</li>
	<li>קבע את ריכוז התא באמצעות מכשיר נגד תאים או hemocytometer.</li>
</ol>4. כתם תאים ולהכין פיצוי
<ol><li>Aliquot 106 תאים של כל סוג תא מכל חיה לצלחת תחתית 96 גם U.<ol>
<li>הקפד לכלול מספיק בארות עבור כל הדגימות והפקדים, כולל כתם מלא, פלואורסצנטיות-מינוס אחד (FMO), לא נגוע, ולבסוף את הפיצוי האופציונלי בצבע יחיד עבור כל פלואורופור בשימוש.</li>
		<li>עבור לוח ההתבגרות BM ולוח ההתבגרות הטחול, תאי aliquot לתוך 2 בארות, 106 תאים לבאר, עבור כל דגימת כתם מלאה. עבור פקדי הכדאיות של פיצוי בצבע יחיד, הוסף 2 x 106 תאים מכל סוג תא לבארות בודדות.</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.</li>
	<li>resuspend התאים ב 200 μL של DPBS (ללא BSA או FBS). שלב זה חשוב להסרת חלבון לפני הכתמתו בצבע כדאיות תגובתי לאמין.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.2 ו- 4.3.</li>
	<li>חזור על שלב 4.2.</li>
	<li>resuspend התאים ב 100 μL צביעת הכדאיות מדולל 1:1,000 ב- DPBS. הערה: אם אתם משתמשים בתאים לפיצוי של צבע בודד, אל תוסיפו צבע כדאיות לבארות אלה.<ol>
<li>עבור כל ערכת כתמים, השאירו מספר בארות לא נגועות לדגימה לא מוכתמת לחלוטין ולכל פקד אחר שתצטרכו.</li>
		<li>עבור כל ערכת כתמים, להשאיר באר נוספת לא מוכתמת עבור בקרת FMO הכדאיות.</li>
		<li>עבור פקדי פיצוי הכדאיות של צבע יחיד: Resuspend 2 x 106 תאים, aliquoted בשלב 4.1, ב 200 μL של צבע קיימא מדולל. העבר 100 μL של תאים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, תאי חום במשך 5 דקות ב 65 °C (65 °F), ולהעביר את 100 μL של תאים מוכי חום בחזרה לבאר המקורית עם 100 μL הנותרים תאים חיים.</li>
	</ol></li>
	<li>תאי דגירה ב 4 °C (50 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.</li>
	<li>resuspend התאים ב 200 μL של DPBS (ללא BSA או FBS).</li>
	<li>חזור על שלבים 4.8 ו- 4.9.</li>
	<li>חזור על שלב 4.8.</li>
	<li>resuspend התאים ב 50 μL של בלוק Fc מדולל 1:50 (ריכוז סופי = 10 מיקרוגרם / מ"ל) במאגר כתמים (0.5% BSA ב- DPBS [vol/vol]).<ol>
<li>עבור תאים צפק - גם להוסיף 5 μL של חוסם מונוציטים כדי להפחית כתמים לא ספציפיים.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור על התאים ב 4 °C (55 °F), מוגן מפני אור, במשך 15 דקות.</li>
	<li>הכן תערובות מאסטר כתמים מלאות ו- FMOs במאגר כתמים לנפח סופי של 100 מיקרול לכל 106 תאים. עיין בטבלה 1-טבלה 4 עבור רשימות הנוגדנים. הערה: FMOs מיוצרים על ידי הכללת כל הנוגדנים בערכת כתמים למעט אחת. הכן FMO לכל נוגדן בערכת כתמים. כאשר ערכת כתמים מכילה צבעים מבריקים מרובים, החלף 50 μL של חיץ כתמים מבריק עבור חיץ כתמים לכל דגימה</li>
	<li>מבלי להסיר בלוק Fc, הוסף 100 μL של תערובות כתמים מלאות ו- FMOs לבארות נבחרות.</li>
	<li>הכן פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור כל נוגדן בערכת כתמים.<ol>
<li>אם אתם משתמשים חרוזי פיצוי, עקבו אחר הוראות הייצור לשימוש.</li>
		<li>אם אתם משתמשים בתאים, מוסיפים נוגדן ציצי ל-106 תאים, השמורים בעבר בשלב 4.6.1 ללא צבע כדאיות, במאגר כתמים של 100 μL. אם כל התאים במדגם חיוביים עבור סמן מסוים, להפריש תאים לא נגועים לשמש בעת רכישת נתוני פיצוי על cytometer הזרימה.</li>
	</ol></li>
	<li>לדגור על התאים והחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.</li>
	<li>צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x גרם במשך 2 דקות ב 4 °C (50 °F). דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, נזהר לא לזהם בארות.</li>
	<li>resuspend התאים והחרוזים ב 200 μL של חוצץ כתמים.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.18 ו- 4.19 פעמיים.</li>
	<li>חזור על שלב 4.18.</li>
	<li>כדי לתקן את הדגימות לניתוח בתוך 48 שעות, resuspend תאים וחרוזים ב 200 μL של 2% paraformaldehyde ב- DPBS. זהירות: Parafomaldehyde הוא סכנה בריאותית חמורה ודליק. עיין בגליון הנתונים של Safty לפני השימוש.</li>
	<li>לדגור על התאים והחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, במשך 30 דקות.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.18 ו- 4.19 פעמיים.</li>
	<li>מניחים צלחת מסנן על צלחת U-תחתית נקייה 96. באמצעות ריבוי פיפטות, מעבירים כל דגימה לבאר של צלחת המסנן.</li>
	<li>צנטריפוגה צלחת המסנן-96 היטב הגדרת צלחת U-התחתון ב 845 x g במשך 2 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את צלחת המסנן ואת decant supernatant על ידי היפוך מהיר והבהבה של הצלחת מעל כיור, נזהר לא לחצות לזהם בארות.</li>
	<li>עבור BM ולוחות התבגרות טחול מחדש את התאים מוכתמים לחלוטין 100 μL של חוצץ כתמים. מערבבים את 2 בארות עבור כל חיה לתוך 1 היטב. תגדיל מחדש את הלוחות הנותרים, את ה- FMOs והפקדים ב- 200 מיקרו-אל של מאגר כתמים.</li>
	<li>דגירה תאים קבועים וחרוזים ב 4 °C (5 °F), מוגן מפני אור, לילה.</li>
</ol>5. רכישת נתונים ציטומטריים זרימה
<ol><li>אתחל ו- QC את ציטומטר הזרימה בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>טען את התבנית הספציפית לכל חלונית.</li>
	<li>לפני הקלטת נתונים, ודא שכל האירועים עבור כל מדגם הם בקנה מידה וגלויים על התוויות הנקודות.</li>
	<li>הקלט בקרות פיצוי עבור כל לוח כתמים באמצעות פיצויי כתמים בודדים שהוכנו בשלב 4.16. הגדר שערים חיוביים ושליליים עבור כל מדגם. יש התוכנה לחשב את מטריצת הפיצוי.</li>
	<li>התחל לרכוש את המדגם הראשון, והבטח שהשערים נקבעים כראוי.</li>
	<li>הגדר את המכונה כדי להקליט לפחות 50,000 B אירועים תא עבור לוח תא B הצפק ולוח טחול Igκ ו Igλ; 150,000 אירועי תאי B עבור לוח ההבשלה BM; ו-300,000 אירועי תאי B עבור לוח ההתבגרות של הטחול.</li>
	<li>עבור כל לוח כתמים, הפעל והקלט את הדגימות המוכתמות במלואן עבור כל בעל חיים, מדגם לא נגוע וה- FMOs.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>המשך בניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה. עקבו אחר אסטרטגיות הגטינג המתוארות באיור 1, איור 2, איור 3,איור 4. 
</li>
</ol>

<ol><li>Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+therapy+with+monoclonal+antibodies+and+related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins.</a> Clinical Medicine. 17 (3), London. 220(2017).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).</li>
<li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+in+situ+genetic+humanization+of+6+Mb+of+mouse+immunoglobulin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).</li>
<li>Murphy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+with+megabase+humanization+of+their+immunoglobulin+genes+generate+antibodies+as+efficiently+as+normal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).</li>
<li>Macdonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kappa-on-Heavy+%28KoH%29+bodies+are+a+distinct+class+of+fully-human+antibody-like+therapeutic+agents+with+antigen-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).</li>
<li>Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+biology+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">B-cell biology and development.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).</li>
<li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).</li>
<li>Lund, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine-producing+B+lymphocytes-key+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).</li>
<li>Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pre-B-cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The pre-B-cell receptor.</a> Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).</li>
<li>von Boehmer, H., Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+in+lymphocyte+development+and+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease.</a> Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).</li>
<li>Goodnow, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li>
<li>Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+antigen+tunes+the+responsiveness+of+naive+B+cells+but+not+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells.</a> Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).</li>
<li>Melchers, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints+that+control+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Checkpoints that control B cell development.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).</li>
<li>Henderson, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Rac-dependent+checkpoint+in+B+cell+development+controls+entry+into+the+splenic+white+pulp+and+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).</li>
<li>Pillai, S., Cariappa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+follicular+versus+marginal+zone+B+lymphocyte+cell+fate+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision.</a> Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).</li>
<li>Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Development+in+the+Bone+Marrow+Is+Regulated+by+Homeostatic+Feedback+Exerted+by+Mature+B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells.</a> Frontiers in Immunology. 7, 77(2016).</li>
<li>Nemazee, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+central+tolerance+for+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of central tolerance for B cells.</a> Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).</li>
<li>Petkau, G., Turner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+circuits+that+direct+early+B-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Signalling circuits that direct early B-cell development.</a> Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).</li>
<li>McKinnon, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry: An Overview.</a> Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).</li>
<li>Betters, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Flow+Cytometry+in+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Advanced+Practioner+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Use of Flow Cytometry in Clinical Practice.</a> Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Van Epps, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+order+to+early+B+cell+chaos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bringing order to early B cell chaos.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389(2006).</li>
<li>Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+characterization+of+pro-B+and+pre-pro-B+cell+stages+in+normal+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow.</a> Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).</li>
<li>Allman, D., Pillai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+B+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripheral B cell subsets.</a> Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).</li>
<li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+B+cell-deficient+mouse+by+targeted+disruption+of+the+membrane+exon+of+the+immunoglobulin+mu+chain+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene.</a> Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).</li>
<li>Keenan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Censoring+of+autoreactive+B+cell+development+by+the+pre-B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor.</a> Science. 321 (5889), 696-699 (2008).</li>
<li>Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+B+lymphocyte+populations+in+Lyn-deficient+mice+and+the+role+of+Lyn+in+signal+initiation+and+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation.</a> Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).</li>
<li>Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+CD45+expression+unmask+functions+for+CD45+in+B-cell+development%2C+tolerance%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).</li>
<li>Miyamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proliferation+of+B+cells+and+auto-immunity+in+mice+lacking+protein+kinase+Cdelta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta.</a> Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).</li>
<li>Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+B-cell+survival+by+BAFF-dependent+PKCdelta-mediated+nuclear+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling.</a> Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-engaged+B+cells+undergo+chemotaxis+toward+the+T+zone+and+form+motile+conjugates+with+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells.</a> PLoS Biology. 3 (6), 150(2005).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Biomaterials+and+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry.</a> Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).</li>
<li>Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+analysis+in+flow+cytometry%3A+the+future+just+started%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Data analysis in flow cytometry: the future just started.</a> Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies.</a> European Journal of Immunology. 47 (10), 1584(2017).</li>
<li>Bigos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+index%3A+an+easy-to-use+metric+for+evaluation+of+different+configurations+on+the+same+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1 Unit 1 21(2007).</li>
<li>Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+and+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells and autoimmunity.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).</li>
</ol>

כל המחברים הם עובדים ובעלי מניות של Regeneron תרופות, Inc.

ניתוח ציטומטרי זרימה של רקמות לימפה ולא לימפואידים אפשר זיהוי והספירה בו זמנית של תת-אוכלוסיות תאי B בעכברים ובני אדם מאז שנות השמונים. זה שימש כמדד של חסינות הומוריסטית והוא יכול להיות מיושם עוד יותר כדי להעריך פונקציונליות תא B. שיטה זו מנצלת את זמינות ריאגנט כדי להעריך שלבים שונים של התבגרות תאי B בעכברים ובבני אדם, באמצעות ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים המאפשרים הערכה של הטרוגניות תאי B, אפילו באוכלוסיות נדירות. אם משתמשים בו כדי למדוד דגימות הטרוגניות מורכבות, הוא יכול לזהות אוכלוסיות משנה בתוך דקות, על תאים <sup ...

נוגדנים חד שבטיים הפכו יותר ויותר לטיפול הבחירה במחלות אנושיות רבות כאשר הם הופכים לחלק מהרפואה המיינסטרים1,2. תיארנו בעבר עכברים מהונדסים גנטית המייצרים ביעילות נוגדנים המעניקים מחסה לאזורים משתנים אנושיים לחלוטין עם קבועי עכבר IgH3,4. לאחרונה, תיארנו עכברים מהונדסים גנטית המייצרים מולקולות דמויות נוגדנים שיש להן אנטיגן מחייב מובהק5. נוגדנים מופרשים על ידי תאי B ומהוות את הבסיס לחסינות הומוריסטית אדפטיבית. ישנם שני סוגים שונים של תאי B, B-1 ו- B-2. ביונקים, תאי B-1 מקורם בכבד העוברי ומועשרים ברקמות הרירית ובחללים הפלורליים הצפקיים לאחר הלידה, בעוד שתאי B-2 מקורם בכבד העוברי לפני הלידה ולאחר מכן במח העצם (BM). תאי B-2 מועשרים באיברי לימפה משניים כולל הטחול והדם6,7,8. ב- BM, אבות ההמטויאטי B-2 מתחילים להבדיל לתאי פרו-B עם תחילת ארגון מחדש של שרשרת כבדה Ig mu9,10. סידור מחדש מוצלח של שרשרת כבדה Ig והרכבתה לתוך קולטן התא טרום B (טרום BCR), יחד עם איתות והתרחבות שגשוג, מובילים לבידול לתאי טרום B. לאחר שתאי טרום-B מסדרים מחדש את שרשראות האור של Ig kappa (Igκ), או אם הם אינם יצרניים, שרשראות האור של Ig lambda (Igλ), הם משתלבים עם שרשרת μ כבדה, וכתוצאה מכך ביטוי IgM BCR משטחי. חשוב לציין כי ביטוי פני השטח של IgM ידוע להיות מופחת בתנאים של פעילות אוטומטית, ובכך תורם סובלנות עצמית בתאי B לא מגיבים פונקציונלית או אלרגית11,12. תאי B לא בוגרים נכנסים לשלב מעבר, שבו הם מתחילים לבטא IgD ולעבור מה- BM לטחול. בטחול, ביטוי IgD גדל עוד יותר והתאים מבשילים לשלב שני של תאי B מעבר, ולאחר מכן השלמת מצב ההתבגרות שלהם והתפתחות לתוך אזור שולי (MZ) או תאי זקיקים (Fol)13,14,15. בעכברים בוגרים, בסביבה שאינה חולה, מספר תאי B בוגרים נשאר קבוע למרות 10-20 מיליון תאי B לא בוגרים הנוצרים מדי יום ב- BM. מתוכם, רק שלושה אחוזים נכנסים למאגר של תאי B בוגרים. גודל תא B ההיקפי מוגבל על ידי מוות תאי, בין היתר בשל מספר גורמים כולל תגובה עצמית והתבגרות חלקית16,17,18. ניתוח ציטומטרי זרימה שימש בהרחבה כדי לאפיין ולספור תאים רבים של תאי מערכת החיסון בבני אדם ועכברים. אמנם יש כמה קווי דמיון בין תאים אנושיים מורין B, פרוטוקול זה חל רק על ניתוח של תאי מורין B. פרוטוקול זה פותח במטרה פנוטיפינג עכברים מהונדסים גנטית, כדי לקבוע אם מניפולציה גנטית תשנה את התפתחות תאי B. Cytometry זרימה היה גם פופולרי מאוד ביישומים רבים נוספים, כולל במדידת הפעלת התא, פונקציה, התפשטות, ניתוח מחזור, ניתוח תוכן DNA, אפופטוזיס ומיון תאים 19,20.
ציטומטריית זרימה היא הכלי המועדף לאפיין תאי לימפוציטים שונים בעכברים ובבני אדם, כולל באיברים מורכבים כגון הטחול, ה- BM והדם. בשל ריאגנטים נוגדנים ספציפיים לעכבר עבור ציטומטריית זרימה, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור לא רק חלבונים פני התא, אלא גם פוספורוטאין תאיים וציטוקינים, כמו גם קריאות פונקציונליות21. כאן אנו מדגימים כיצד ריאגנטים ציטומטריה זרימה ניתן להשתמש כדי לזהות תת קבוצות תאי B כפי שהם בוגרים להבדיל באיברים לימפואידיים משניים. לאחר אופטימיזציה של תנאי כתמים, טיפול בדגימות, הגדרת מכשיר נכון ורכישת נתונים, ולבסוף ניתוח נתונים, פרוטוקול לניתוח ציטומטרי זרימה מקיף של תא B בעכברים ניתן להשתמש. ניתוח מקיף כזה מבוסס על המינוח בן עשרות השנים שהומצא על ידי הארדי ועמיתיו, שבו ניתן לחלק תאי BM B-2 מתפתחים לשברים שונים (Fraction) בהתאם לביטוי שלהם של B220, CD43, BP-1, CD24, IgM ו- IgD22. הארדי ואח', הראו כי ניתן לחלק תאי BM BM B B220+ CD43 לארבע קבוצות משנה (שבר A-C') על בסיס ביטוי BP-1 ו- CD24 (30F1), בעוד שתאי B220+ CD43-(עמום עד שלילי) BM B יכולים להיפתר לשלוש קבוצות משנה (שבר D-F) בהתבסס על ביטוי דיפרנציאלי של IgD ו- IgM23 פני השטח. שבר A (תאי טרום-PRO-B) מוגדרים כ- BP-1- CD24 (30F1)-, שבר B (תאים מוקדמים של פרו-B) מוגדרים כ- BP-1- CD24 (30F1)+, שבר C (תאי Pro-B מאוחרים) מוגדרים כ- BP-1+ CD24 (30F1)+, ושבר C' (תאים מוקדמים לפני B) מוגדרים כ- BP-1+ ו- CD24high. יתר על כן, שבר D (תאים לפני B) מוגדרים כתאי B220+ CD43- IgM- B, ו- Fraction E (תאי B שנוצרו לאחרונה, שילוב של תאים לא בוגרים ומעבריים) מוגדרים כתאי B220+ CD43- IgM+ B ו- Fraction F (תאים בוגרים, חוזרים על B) מוגדרים כתאי B220high CD43- IgM + B. לעומת זאת, ניתן לחלק את רוב תאי B הנאיביים שנמצאו בטחול לתאי B בוגרים (B220+ CD93-) B ותאי מעבר (T1, T2, T3) בהתאם לביטוי של CD93, CD23 ו- IgM. ניתן לפתור תאי B בוגרים לתוך אזור שולי ותת-קבוצות זקיקים בהתבסס על ביטוי של IgM ו- CD21/CD35, וניתן לחלק עוד יותר את תת-קבוצות המשנה של הזקיקים לסוג זקיקים בוגרים I ותת-קבוצות תאים מסוג II B מסוג II בהתאם לרמת ביטוי פני השטח IgM ו- IgD24. אוכלוסיות תאי B בטחול אלה מבטאות בעיקר שרשרת אור של איגה. לבסוף, אוכלוסיות תאי B-1 B, שמקורן בכבד העובר ונמצאות בעיקר בחללים הצפקיים והפלורליים של עכברים בוגרים, תוארו בספרות. תאי B צפקיים אלה ניתן להבחין בין תאי B-2 B שתוארו בעבר על ידי חוסר ביטוי CD23 שלהם. לאחר מכן הם מחולקים עוד יותר לאוכלוסיות B-1a או B-1b, כאשר הראשון מוגדר על ידי נוכחות של CD5 והאחרון על ידי היעדרו25. אבות תאי B-1 מצויים בשפע בכבד העוברי, אך אינם נמצאים ב- BM למבוגרים. בעוד תאי B-1a ו- B-1b מקורם באבות צאצא שונים, שניהם זורעים את חללי הצפק והפלורל24. בניגוד לתאי B-2, תאי B-1 מסוגלים באופן ייחודי להתחדשות עצמית ואחראים לייצור נוגדני IgM טבעיים.
פגמים בהתפתחות תאי B יכולים להתעורר במקרים רבים, כולל ליקויים ברכיבי BCR26,27, הפרעות של מולקולות איתות המשפיעות על עוצמת איתות BCR14,28,29, או הפרעה של ציטוקינים המווסתים את הישרדות תאי B30,31 . ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי הלימפה תרם לאפיון של בלוקי פיתוח תאי B בעכברים אלה ורבים אחרים. אחד היתרונות של ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי לימפה הוא שהוא מציע את היכולת לבצע מדידות על תאים בודדים המתקבלים רקמה מנותקת חיה. הזמינות של ריאגנטים במגוון הולך וגדל של פלואורופורים מאפשרת ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים ומאפשרת הערכה של הטרוגניות תאי B. יתר על כן, הספירה של תאי B על ידי ניתוח ציטומטרי זרימה משלימה בדיקות אימונולוגיות אחרות כגון שיטות אימונוהיסטוכימיה המדמיינת לוקליזציה של תאים בתוך איברי לימפה, זיהוי רמות נוגדנים במחזור כמדד של חסינות הומוריסטית, כמו גם שתי מיקרוסקופיה פוטונית למדידת תגובות תאי B במרחב ובזמן אמיתיים.

<table><tbody><tr><td>0.5 מ"ל צינורות אפנדורף נעילה בטוחה</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>22363611</td><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 0.5 מ"ל</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות אפנדורף&nbsp;</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td>22364111</td><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>צינורות בז 15 מ"ל&nbsp;</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>352097</td><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td></tr><tr><td>18 מד מחט</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>25 מחט BD</td><td>&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>305124 מזרק BD 3 מ"ל</td><td></td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>70 מ"מ MACS SmartStrainer&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-110-916&nbsp;</td><td>מסננת תאים 70 מ"מ</td></tr><tr><td>צלחת תחתונה 96 באר U&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה ACK&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td>A1049201</td><td>מאגר ליזה של תאי דם אדומים</td></tr><tr><td>Acroprep Advance 96 באר צלחת סינון</td><td>Pall Corporation</td><td>8027</td><td>לוחית סינון</td></tr><tr><td>B220</td><td>eBiosciences</td><td>17-0452-82</td><td></td></tr><tr><td>BD CompBead נגד עכבר Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552843</td><td>חרוזי פיצוי</td></tr><tr><td>BD CompBead Anti-Rat Ig/&kappa;</td><td>BD</td><td>552844</td><td>חרוזי פיצוי</td></tr> בקר <tr><td>סרום אלבומין</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>A8577</td><td>BSA</td></tr><tr><td>BP-1</td><td>BD</td><td>740882</td><td></td></tr><tr><td>מאגר כתמים מבריק</td><td>BD</td><td>566349</td><td>מאגר כתמים מבריק</td></tr><tr><td>C-Kit</td><td>BD</td><td>564011</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BD</td><td>563168</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>BioLegend</td><td>101222</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560143</td><td></td></tr><tr><td>CD21/35</td><td>BD</td><td></td><td></td>562756</tr><tr><td>CD23&nbsp;</td><td>BD</td><td>740216</td><td></td></tr><tr><td>CD24 (HSA)</td><td>BioLegend</td><td>138504</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>561388</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BioLegend</td><td>100214</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BD</td><td>553270</td><td></td></tr><tr><td>CD43</td><td>BioLegend</td><td>121206</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>BD</td><td>563194</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BD</td><td>740750</td><td></td></tr><tr><td>CD93</td><td>BioLegend</td><td>136504</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td> <td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>eBioscience כדאיות קבועה צבע eFluor 506</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td>צבע כדאיות</td></tr><tr><td>מורחב העברת קצה עדין פיפטה</td><td>Samco</td><td>233</td><td>פיפטת העברה חד פעמית</td></tr><tr><td>FACSymphony A3 זרימה ציטומטר</td><td>BD</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>זרימה ציטומטר</td></tr><tr><td>Fc בלוק, CD16 / CD32 (2.4G2)</td> <td>BD</td><td>553142</td><td>Fc בלוק</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Flowjo</td><td></td><td>תוכנת ניתוח ציטומטר</td></tr><tr><td>זרימה gentleMACS C Tubes&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-096-334</td><td>צינור דיסוציאציה אוטומטי&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS אוקטו דיסוציאטור עם תנורי חימום&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-095-937</td><td>מכשיר דיסוציאטור רקמות</td></tr><tr><td>GR1 (Ly6C/6G)</td><td>BioLegend</td><td>108422</td><td></td></tr><tr><td>IgD</td><td>BioLegend</td><td>405710</td><td></td></tr><tr><td>IgM</td><td>eBiosciences</td><td>25-5790-82</td><td></td></tr><tr><td>Kappa</td><td>BD</td><td>550003</td><td></td></tr><tr><td>Lambda</td><td>BioLegend</td><td>407308</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד, 32%</td><td>אלקטרון תמיסה מדעי המיקרוסקופיה</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>Ter119</td><td>BioLegend</td><td>116220</td><td></td></tr><tr><td>חוסם מונוציטים כתמים אמיתיים</td><td>BioLegend</td><td>חוסם מונוציטים</td><td>426103</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575038</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR</td><td>בקמן קולטר</td><td>731050</td><td>מכשיר מונה תאים&nbsp;</td></tr></tbody></table>

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין b

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

מחקרים מקיפים אפיינו את ההתפתחות וההבחנה של תאי מורין B באיברי לימפה משניים. נוגדנים המופרשים על ידי תאי B בודדו ופותחו לטיפולים מבוססים היטב. אימות התפתחות תאי מורינה B, בהקשר של עכברים נוטים לחיסון עצמי, או בעכברים עם מערכת חיסונית שונה, הוא מרכיב חיוני בפיתוח או בדיקה של חומרים טיפוליים בעכברים והוא שימוש מתאים בציטומטריית זרימה. פרמטרים ציטומטריים של זרימת תאי B מבוססים היטב יכולים לשמש להערכת התפתחות תאי B בצפק המורין, במח העצם ובטחול, אך יש לדבוק במספר שיטות עבודה מומלצות. בנוסף, ניתוח ציטומטרי זרימה של תאי B צריך גם להשלים קריאות נוספות של פיתוח תא B. נתונים הנוצרים בטכניקה זו יכולים לקדם את הבנתנו בסוג פראי, מודלים של עכבר מועד אוטואימוניות, כמו גם עכברים אנושיים שניתן להשתמש בהם כדי ליצור מולקולות דמויות נוגדנים או נוגדנים כטיפולים.

כאן אנו מציגים את אסטרטגיית הגינג לאפיון התפתחות תאי B בצפק העכבר, BM והטחול. הבסיס של הניתוח נוצר סביב הרעיון של הכתמה עם צבע קיימא, ואז gating החוצה מכפילים המבוססים על אזור פיזור קדימה (FSC-A) ו קדימה-פיזור-גובה (FSC-H), ולבסוף gating פסולת על ידי בחירת תאים על פי המאפיינים FSC-A וצד-פיזור-אזור (SSC-A) שלהם, המכונה כאן שער הגודל, אשר משקפים את גודל התא היחסי ואת גרגריות התא, לפני גטינג על אוכלוסייה של עניין.
ניתוח ציטומטרי ש...

אנו מתארים כאן ניתוח פשוט של ההטרוגניות של תא תאי B החיסוניים המוריניים ברקמות הצפק, הטחול ומח העצם על ידי ציטומטריית זרימה. הפרוטוקול יכול להיות מותאם ומורחב לרקמות עכבר אחרות.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

נתונים הנוצרים באמצעות טכניקה זו מקדמים הבנה של מודלים של עכבר נוטה אוטואימוניות, כמו גם עכברים אנושיים, שניתן להשתמש בהם לטיפולים כלליים בנוגדנים או בנוגדנים. הזמינות של ריאגנטים עם מגוון הולך וגדל של פלואורופורים, מאפשרת ניתוח סימולטני של פרמטרים מרובים על תאים בודדים ומאפשרת הערכה של הטרוגניות תאי B. פרוטוקול זה פותח במטרה פנוטיפינג עכברים מהונדסים גנטית.כדי לקבוע אם מניפולציה גנטית תשנה את התפתחות תאי B. היי, אני פיית' האריס. אני אדגים את ההליך היום.התחל על ידי aliquoting מיליון של כל סוג תא מכל חיה לתוך צלחת 96 טוב U-התחתון. ודאו שמספיק בארות זמינות עבור כל הדגימות והפקדים, כולל כתם מלא, דגימות פלואורסצנטיות-מינוס-אחת ודגימות לא מוכתמות עבור כל פלואורופור. עבור לוח ההתבגרות של מח העצם ולוח ההתבגרות של הטחול, תאי aliquot לשתי בארות, 1 מיליון תאים לבאר עבור כל דגימת כתמים מלאה.עבור פקדי הכדאיות של פיצוי צבע יחיד, הוסף שני מיליון תאים בכל סוג תא לבארות בודדות. צנטריפוגות את הצלחת ב 845 x g במשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס. דקאנט סופר-טבעי על ידי היפוך מהיר והטיית הצלחת מעל כיור, תוך דאגה לא לזהם את הבארות.לשטוף את התאים פעמיים ב 200 microliters של DPBS. צנטריפוגה ו decant סופרנט לאחר כל לשטוף. Resuspend התאים ב 100 microliters של צביעת הכדאיות מדולל DPBS ביחס של אחד ל 1000, הימנעות התאים המשמשים לפיצוי צבע יחיד.עבור כל ערכת כתמים, להשאיר כמה בארות לא נגועות עבור מדגם נגוע לחלוטין פקדים אחרים ייתכן שיהיה עליך, כמו גם באר נוספת לא נגועה עבור בקרת FMO קיימא. הוסף PBS לבארות אלה. Resuspend התאים של בקרת הכדאיות פיצוי צבע יחיד ב 200 microliters של צבע קיימא מדולל.העבר 100 מיקרוליטרים של תאים אלה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לחמם אותו במשך חמש דקות ב 65 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להעביר את התאים המחוממים בחזרה לבאר המקורית עם התאים החיים הנותרים. לדגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות מוגן מפני אור. לאחר הדגירה, צנטריפוגות התאים decant supernatant על ידי הבהוב או היפוך הצלחת מבלי לזהם את הבארות האחרות.לשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר ב 200 microliters של DPBS, אז צנטריפוגה decant סופרננט כמו קודם. חזור שוב על שטיפת ה- DPBS. הוסף microliters של בלוק FC מדולל עם חוצץ כתמים ביחס של אחד עד 50 כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר.עבור תאים צפקיים, להוסיף חמישה microliters של חוסם מונוציטים כדי להפחית את הכתמים הלא-זעירים. לאחר מכן, לדגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, מוגן מפני אור. הכן תערובות מאסטר לכתמים מלאות ו- FMOs במאגר הכתמים לנפח סופי של 100 מיקרוליטרים למיליון תאים באמצעות טבלאות הנוגדנים בכתב היד של הטקסט.מבלי להסיר בלוק FC, הוסף 100 מיקרוליטרים של תערובות כתמים מלאות ו- FMOs לבארות נבחרות. הכן פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור כל נוגדן וקבוע כתמים. פעל בהתאם להוראות היצרן אם אתה משתמש חרוזי פיצוי.לדגור על התאים והחרוזים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר מכן, צנטריפוגה ו decant סופר-טבעי על ידי היפוך והבהוב הצלחת. לשטוף את התאים והחרוזים ב 200 microliters של חוצץ כתמים שלוש פעמים, centrifuging ו decanting supernatant בכל פעם.resuspend התאים והחרוזים ב 200 microliters של 2%paraformaldehyde ב DPBS כדי לתקן את הדגימות לניתוח. לדגור על התא והחרוזים בארבע מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, מוגן מפני אור, ואז צנטריפוגה ו decant supernatant על ידי היפוך או הבהוב הצלחת. resuspend התאים והחרוזים ב 200 microliters של חוצץ כתמים.מניחים צלחת מסנן על צלחת U-bottom נקייה של 96 באר ומעבירים כל דגימה לבאר של צלחת המסנן באמצעות פיפטה מרובה. צנטריפוגות צלחת המסנן ו decant סופרנטנט. עבור מח העצם ולוחות ההתבגרות של הטחול, יש להדק מחדש את התאים המוכתמים במלואם ב-100 מיקרוליטרים של חיץ כתמים.מערבבים את שתי בארות עבור כל חיה לתוך באר אחת. יש תגדיל מחדש את הלוחות, ה-FMOs והפקדים הנותרים ב-200 מיקרו-לייטרים של מאגר כתמים. דגירה של תאים קבועים וחרוזים בארבע מעלות צלזיוס בן לילה, מוגנים מפני אור.הקלט פקדי פיצוי עבור כל לוח כתמים באמצעות פיצויי כתם יחיד מוכנים ולהגדיר שערים חיוביים ושליליים עבור כל מדגם. חשב את מטריצת הפיצוי באמצעות התוכנה. התחל לרכוש את המדגם הראשון, ודא שהשערים מוגדרים כראוי.הגדר את המכונה לפעול ולתעד את אירועי התא השונים עבור כל מדגם כפי שהוזכר בכתב היד של הטקסט. המשך בניתוח נתונים באמצעות תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה, בעקבות אסטרטגיות הגינג בכתב היד של הטקסט. ניתוח ציטומטרי זרימה לאפיון תאי B צפק בצפק מראה את התדרים של תאים צפק קיימא, תאי B הכוללים, קבוצות B-1 ו- B-2, כמו גם תאי B-1a ו- B-1b בעכברים.כאשר תאי מח העצם B נותחו, נקבעו תדרים של תאים בני קיימא, תאי B כוללים, שבר A, תאים לפני-B, שבר B, שבר C, שבר C'Fraction D, שבר E לא בוגר, שבר מעבר E, ותאי שבר F B בעכברים. ניתוח של תאי טחול B מראה את התדרים של תאי טחול קיימא, תאי B כוללים, תאי B מעבר, T1, T2, תאי T3, תאי B בוגרים, תאי זקיקים I, תאי זקיקים II, תאי אזור שוליים מבשרים ובוגרים ותאי B-1 בעכברים. התדרים של אימונוגלובולין קאפה ואימונוגלובולין לאמבדה B בעכברים נקבעו עם ניתוח ציטומטרי של הטחול.בעת ביצוע פרוטוקול זה, עליך לפתור אות מגלאי אחד מדמם אל הבא באמצעות פקדי פיצוי. פקדים אלה יכולים להיות מוכתמים באופן בל יתד או עם חרוזי פיצוי זמינים מסחרית. בדיקות נוספות ניתן להשתמש בשילוב עם ציטומטריית זרימה, כמו אימונוהיסטוכימיה כדי לדמיין לוקליזציה של תאים בתוך איברי הלימפה, כמו גם שני מיקרוסקופיה פוטון לנתח תגובות תאי B במרחב ובזמן אמיתיים.ניתוח ציטומטריית זרימה של תאי תאי B מאפשר אפיון של פנוטיפים הקשורים ל- BCR ולליקויים קשורים, הפרעות של מולקולות איתות BCR, או הפרעה של ציטוקינים המווסתים את הישרדות תאי B.

flow-cytometric-characterization-of-murine-b-cell-development

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטת ה-IP FCM מוצג, המאפשר רגיש, הערכה החזקה, ביוכימיות של חלבונים אינטראקציות הילידים, ללא צורך בהנדסה גנטית או גודל מדגם גדול.

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

בעקבות חשיפה לאנטיגן, מופעל subpopulations של תאים B עוברים תהליך הידוע בשם רקומבינציה לעבור מחלקה (CSR) כדי לייצר נוגדנים isotypes עם מפעיל פונקציות שונות. פרוטוקול המתוארים בדוח זה מסביר כיצד CSR יכול להיגרם...

אינדוקציה והערכה של רקומבינציה החלף מחלקה ב מטוהרים תאים B Murine

שיטה זרימה cytometric לזיהוי וניתוח מולקולרית של התמיינות בשלב ספציפי אבות Murine erythroid ומבשרי, ישירות במח שאך שנקטפו עכבר העצם, בטחול או בכבד העובר. Assay מסתמך על פני קרום התא הסמנים CD71, Ter119, וגודל התא.

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

פרוטוקול זה מתאר הפרוצדורות על מנת להעריך את ההתמיינות של תאים הדנדריטים plasmacytoid בתיקון של Peyer מאבות תא הדנדריטי משותפים, תוך שימוש בטכניקות הכוללות בידוד בתיווך FACS תא, העברת גנים הידרודינמית, וניתוח זרימה של תת חיסון בתיקון של Peyer.

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

בעוד מחלחלים מקרופאגים הם גויסו ללא הרף רקמות מבוגר מ מבשר במחזור, מקרופאגים תושב זרע הרקמה שלהם במהלך הפיתוח, שם הם מתוחזקים ללא קלט נוסף של אבות. אבות של מקרופאגים תושב זוהו לאחרונה. כאן, אנו מציגים שיטות למיפוי גורל גנטי של אבות מקרופאגים תושב.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

מאמר זה מתאר ספקטרלי cytometry, גישה חדשה ב cytometry הזרימה המשתמשת צורות של ספקטרום פליטה להבחין fluorochromes. אלגוריתם מחליף פיצויים יכול לטפל קרינה אוטומטית כפרמטר עצמאי. גישה חדשה זו מאפשרת הניתוח הראוי של תאים מבודדים איברים מוצקים.

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

אזור שוליים B תאים (MZBs) להגיב בכוח גזירה זרימה על ידי מחדש המכוונת את נתיב הנדידה שלהם כן. פרוטוקול זה מראה כיצד לתעד ולנתח את ההעברה באמצעות יחידת פלואידיקה, משאבה, מערכת הדמיה במיקרוסקופ, תוכנה חופשית.

ניתוח של הטיה הנוצרות על-ידי זרימת נדידה של תאי B מאתר אזור שולי במבחנה

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לכימות והתמיינות של לימפוציטים B שריר הלב בהתבסס על מיקומם בחלל התוך-וסקולרי או האנדותל באמצעות ציטומטריה של זרימה.

כימות וניתוח מבוססי ציטומטריה של זרימה של תאי B שריר הלב

כאן אנו מתארים שיטה ציטומטרית חדשנית לזרימה לבידוד פרוספקטיבי של אריתרואיד יחידה יוצרת התפרצות מוקדמת (BFU-e) ואריתרואיד יחידה יוצרת מושבה (CFU-e) ישירות ממח עצם וטחול טריים של עכבר. פרוטוקול זה, שפותח על סמך נתוני תעתיק חד-תאיים, הוא הראשון לבודד את כל אבות האריתרואידים של הרקמה בטוהר גבוה.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

למדו אפיון ציטומטרי זרימה של תאי B מוריניים בבלוטות הפריטונאום, הטחול ומח העצם. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח הטרוגניות תאית ופיתוח תרפיות אנטי-גוף במודלים עכבריים גנטיים.

אפיון ציטומטרי זרימה של פיתוח תאי מורין B

גלה סרטונים נוספים