Name: מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: למד מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר. שיטה זו מאפשרת ניטור לחץ וזרימת הדם בעורקים ומספקת פלטפורמה לחקר תפקוד הפריציטים במיקרו-מחזור הדם הלבבי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המרכז להנדסה וטכנולוגיה ביו-רפואית (BioMET); NIH (1U01HL1116321) ו -(1R01HL142290) ואיגוד הלב האמריקאי 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (בג"ץ).

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של אוניברסיטת מרילנד בולטימור והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרה פרוטוקולים.
1. הכנת הפתרונות
הערה: הכינו פתרונות מראש. שני סוגים של פתרונות בסיסיים משמשים בניסויים: (1) פתרונות מלוחים פיזיולוגיים (PSS) עבור superfusate אמבטיה ו (2) הפתרונות של טירודה עבור לומן perfusate. מבעבע מתמשך עם CO 2 ישצורך לשמור על ה- pH של PSS. הפתרון של Tyrode HEPES-אגירה משמש לומן במקום PSS כדי למנוע בועות הולך לתוך כלי, שכן בועות יפגעו בתאי האנדותל7 ולחסן את הזרימה.
<ol><li>פתרון PSS: ראה את הנוסחה וההרכב של פתרון PSS בטבלה 1. הפוך 10 L של Ca2 +ללא גלוקוז PSS מלאי פתרון ולאחסן בטמפרטורת החדר. 1 שעה לפני כל הליך, להוציא 1 L של פתרון המניה בועה עם 5% CO2 (74% N2 ו 21% O2) כדי לשמור על ה- pH של הפתרון ב ~ 7.4. הוסף 1.8 גרם גלוקוז ו 1.8 מ"ל CaCl2 (1 M מלאי)8. הערה: הוסף Ca2+ רק לאחר מבעבע כאשר pH הוא ~ 7.4, אחרת, Ca2 + יהיה זירז.</li>
	<li>הפתרון של Tyrode: ראה את הנוסחה וההרכב של הפתרון של Tyrode בטבלה 1. לסנן את הפתרון (0.22 מיקרומטר) ומאוחסן ב 4 °C (69 °F) לשימוש עתידי9.</li>
	<li>הפתרון של Tyrode עם BDM (2,3-בוטנדיונה monoxime): להוסיף BDM כמעכב myofilament הפיך כדי למנוע התכווצות של myocytes10. לשקול 600 מ"ג BDM ולהוסיף 200 מ"ל של הפתרון של Tyrode. מערבבים את הפתרון עם BDM עד שהוא מומס לחלוטין. אין צורך בסינון נוסף.</li>
	<li>אחסן את הפתרון של Tyrode המכיל BDM ב 4 °C (60 °F) לשימוש עתידי.</li>
</ol>2. הכנה קאמרית
<ol><li>מעיל הן תא ניתוח תא ניסיוני מראש עם polydimethylsiloxane (PDMS) בעקבות ההוראות שסופקו על ידי היצרן.</li>
	<li>מלאו את תא הניתוק בתמיסה של Tyrode המכילה BDM.</li>
	<li>הפעל את הצ'ילר 1 שעה לפני ההליך. הגדר את הטמפרטורה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. הכנת קנולה
<ol><li>הפעל את פולר המיקרופיפט. בחר את ההגדרות בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>קח צינור זכוכית בורוסיליקט נקי (הקוטר החיצוני והפנימי של צינורות הזכוכית המשמשים היה 1.2 מ"מ ו 0.69 מ"מ בהתאמה).</li>
	<li>הכנס צינור זכוכית לתוך מלחציים מחורצים של פולטר סאטר פיפטה עם חוט חימום פלטינה בצורת U.</li>
	<li>הפעל את המושך כדי לייצר שתי קנולה, כל אחד עם קצה דק ארוך.</li>
	<li>חותכים את הקצה של כל קנולה באמצעות זוג דק של מספריים תחת מיקרוסקופ לנתח כדי להפוך את הקוטר הסופי של הקצה סביב 100 כדי 150 מיקרומטר.</li>
	<li>אש ללטש את קצה הצינורית לחתוך מעט סביב הקצוות החדים.</li>
	<li>לכופף את הצינורית לאורך הפיר באמצעות חוט פלטינה (מחומם עם שליטה עדינה) ממוקם בצד של הפיר כ 2 מ"מ מקצה. הזווית של העיקול בקנולה צריכה להיות סביב 45 מעלות.</li>
	<li>הכנס את הקצה הפתוח של הצינורית למחזיק תא מיוגרף הלחץ והדק את המדידה. חבר מזרק 5 מ"ל מלא עם הפתרון של Tyrode לצד השני של המדידה. חברו את הצינורית למיקרו-מניפולטור המותקן בתא (ראו איור 1 ואיור 2).</li>
	<li>ממלאים את הצינור בתמיסה של Tyrode באמצעות המזרק (5 מ"ל), שוטפים אותו, את הצינור ואת המחבר של בועות אוויר.</li>
	<li>לפני פרוצדורת הצינור, מדדו את לחץ הזלוף בתוך הצינורית על פני טווח זרימה נתון (50 עד 300 μL/min, איור 3). עשה זאת רק כאשר נעשה שימוש בקנולה חדשה. הערה: לחץ הזלוף בתוך הצינורית פרופורציונלי לזרימה ומותאם ליניארי(איור 3).</li>
</ol>4. חילוץ לב העכבר
<ol><li>שים עכבר C57BL/6 (או מין, 8-16 שבועות) בתיבת ההרדמה המחוברת למיכלי isoflurane וחמצן.</li>
	<li>הפעל מיכל חמצן ולהתחיל את זרימת isoflurane. המתן ~ 5 דקות עד שהעכבר מורדם לחלוטין.</li>
	<li>לאחר הרדמה הוקמה, להוציא את העכבר מתוך תיבת הרדמה ולהזריק הפרין IP (לתוך חלל הצפק, 360 יחידות, 0.5 מ"ל / עכבר) כדי למנוע היווצרות קריש דם בכלי הדם. ואז להחזיר את העכבר לתיבת ההרדמה.</li>
	<li>10 דקות לאחר הפרין כבר מוזרק, להזיז את העכבר למיטה מחוממת בתנוחה סופית לייצב את כפותיו באמצעות סרט תיוג. שמור את העכבר תחת הרדמה מלאה עם isoflurane באמצעות חרוט האף.</li>
	<li>הרם את עור הבטן של העכבר מעל הסרעפת עם מלקחיים והשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך ולחשוף את הסרעפת.</li>
	<li>חותכים את הסרעפת ואת עצם החזה. פתח את החזה.</li>
	<li>לנתח את הלב מתוך חלל בית החזה, חיתוך קרוב ככל האפשר לקיר בית החזה הגבי.</li>
	<li>מניחים את הלב לתוך הפתרון של Tyrode קר כקרח המכיל 30 מ"מ BDM.</li>
	<li>נקה את הלב כדי להסיר את רקמות החיבור כגון ריאות.</li>
	<li>מעבירים את הלב לתא הניתוק המצונן מראש, המלא בתמיסה של טיירוד המכילה 30 מ"מ BDM.</li>
</ol>5. הכנה וקנציה של עורק מחיצה
<ol><li>תדליק את משאבת הסרוו. הגדר את משאבת הסרוו למצב "זרימה". תן לו לרוץ במהירות גבוהה עד הצינור מלא עם הפתרון של Tyrode שישמש כדי לחלחל לומן כלי הדם. ודא שאין בועות בצינורות. אז תנמיך את המהירות.</li>
	<li>הצמד את הלב אל PDMS, הימנעות כל נזק לאזור האמצעי של הלב.</li>
	<li>הסר גם את האטריה הימנית וגם השמאלית. חותכים לפתוח את החדר הימני ולהסיר את הקיר הימני ללא חדרית באמצעות מיקרוסקופ מנתח.</li>
	<li>לחשוף ולזהות את עורק המחיצה. מניחים חוט ניילון (קוטר 30 מיקרומטר) מתחת לעורק המחיצה וקושרים קשר רופף לשימוש עתידי. הערה: ניתן לזהות בקלות את עורק המחיצה באמצעות מיקרוסקופ מנתח. עורק המחיצה הוא עורק ראשי על מחיצה שמקורו בעורק הכלילי הנכון ברוב המקרים.</li>
	<li>הסר את הקיר השמאלי ללא חדרים באמצעות מספריים עדינות.</li>
	<li>מעבירים את הכנת שריר הפפילרי לתא הניסוי שבו הוצבה הצינורית. התא מלא בתמיסה של טיירוד המכילה BDM. החלק התחתון של תא זה מצופה בשכבה דקה (~ 2 מ"מ) של PDMS.</li>
	<li>להתאים את המיקום של הצינורית (באמצעות micromanipulator) כדי לאפשר קנולציה של עורק המחיצה. הדק את הקשר.</li>
	<li>לאבטח את שריר הפפילרי באמצעות סיכות קטנות לרצפת התא, כך המטרה מיקרוסקופ יש תצוגה ברורה של כלי הדם. שימו לב לזווית ולמיקום הצינורית והבטיחו שקצה הצינורית מקביל לקיר העורקים.</li>
	<li>בדיקת קנולציה על ידי גירוש הדרגתי של הפתרון מהמזרק דרך הצינורית. אם כל האלמנטים לתפקד כראוי, שאריות דם בשריר הפפילרי ייצא הרקמה בתחילת תהליך זה ורק הפתרון של Tyrode ייראה מאוחר יותר.</li>
</ol>6. ייצוב ההכנה
<ol><li>הפעל את המשאבה peristaltic שיספק את פתרון superfusion. ואז כל הזמן superfuse ההכנה באמבטיה עם PSS גזים מראש בקצב של 3-4 מ"ל / דקה.</li>
	<li>הפעל את בקר הטמפרטורה עבור פתרון superfusion. להתאים את הטמפרטורה של superfusate האמבטיה ~ 35-37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חבר את הצינורית למשאבת הסרוו. קרא את הלחץ המוצג על בקר סרוו הלחץ.</li>
	<li>לפקח על הזרימה והלחץ. הזרימה (μL/min) ולחץ זלוף העורקים (מ"מ ח"ג) הם דיגיטציה באמצעות דיגיטייזר ומתועדים באמצעות תוכנה משויכת (איור 2).</li>
	<li>להתאים את הזרימה כדי להגדיר את הלחץ ~ 10 מ"מ ש"ג ולתת לו לרוץ במשך ~ 10 דקות.</li>
	<li>להגביר את זרימת הפתרון הזוהר כדי להפוך את הלחץ של העורק ~ 60 מ"מ.ג. השג את לחץ הזלוף הסופי של העורק עצמו על ידי חיסור טיפת הלחץ של הצינורית (איור 3). הערה: אם מצב "לחץ" על בקר סרוו לחץ נבחר, הלחץ הזוהר מוגדר ~ 60 מ"מ ח"ג לניסויים אלה. לאחר מכן נטר את שינוי הזרימה.</li>
	<li>תן לדגימה לייצב ~ 30-60 דקות על ידי ניטור רמות הזרימה ו / או הלחץ. עלייה הדרגתית של לחץ עורקי נצפתה בדרך כלל בתחילת זלוף לאחר קנולציה. מדינה יציבה חדשה תקום מעצמה ב-30 דקות(איור 4).</li>
	<li>ליזום ניסוי לאחר לחץ זלוף מיוצב (בזרימה מתמדת).</li>
</ol>7. טעינת ההכנה עם אגלוטינין נבט חיטה מתויג פלואורסצנטי (WGA)
<ol><li>הכן את הפתרון של Tyrode המכיל אלקסה-פלואור-488 מצומד WGA על ידי הוספת 100 מיקרוגרם של WGA מצומד לתוך 5 מ"ל של הפתרון של Tyrode.</li>
	<li>בזהירות לעבור perfusate מן הפתרון של Tyrode נורמלי אחד המכיל WGA מתויג פלואורסצנטי. חשוב להחליף בזהירות את perfusate, כך בועות לא הציגו.</li>
	<li>לאחר ~ 30 דקות של זלוף WGA או כאשר פתרון WGA עומד להיגמר, לשנות את perfusate בחזרה לפתרון הרגיל של Tyrode.</li>
</ol>8. הדמיה קונפוקלית של עורקים ונימים
<ol><li>הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית של דיסק Nipkow.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ כדי לאתר את עורק המחיצה באמצעות מטרת הספק נמוך (4x) במצב אור משודר. הערה: עורק Septal יכול להיות ממוקם על ידי ביצוע המיקום של הצינורית.</li>
	<li>התחל הדמיה confocal עם confocal דיסק מסתובב ובחר לייזר עירור 488 ננומטר, הגדלה אובייקטיבית 40x ולהתאים את עוצמת הלייזר ואת קצב הדגימה (10 - 500 ms לתמונה).</li>
	<li>הגדר עמדות דימות עליונות ותחתונות עבור המיקרוסקופ הקונפוקאלי כדי להגדיר את טווח ההדמיה והזן את הפרמטרים עבור הדמיית מחסנית z.</li>
	<li>הגדר את גודל השלב כפי שהומלץ עבור המערכת הנמצאת בשימוש או הגדר את גודל השלב כרצונך.</li>
	<li>בחר בהגדרות של הגדרת מחסנית z ו/או הגדרות סידרת הזמן.</li>
	<li>בחר או הגדר תיקיה חדשה לאחסון התמונה החדשה.</li>
	<li>לחץ על "הפעל" כדי להתחיל להקליט הדמיה לניתוח עתידי (איור 5).</li>
</ol>9. ניסוי vasodilator לדוגמה: vasodilation הנגרמת על ידי פינצ'ידיל (וידאו 1).
<ol><li>הכן פתרון מלאי פינצ'ידיל (100 מ"מ ב- DMSO) ומאוחסן ב- 4 °C (60 °F).</li>
	<li>הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית pinacidil כדי להפוך את הריכוז הסופי של pinacidil 100 μM.</li>
	<li>תמונה שריר הפפילרי בהגדלה נמוכה (4x המטרה) כדי לכלול את עורק המחיצה ואת עורקי הענף.</li>
	<li>החלף פתרון לומינלי לפינצ'ידיל המכיל פתרון.</li>
</ol>10. ניסויים לדוגמה לבקרת זרימת דם: לחץ זלוף עורקי הנגרם על ידי vasoconstrictor עולה בזרימה מתמדת (איור 6)
<ol><li>הכינו פתרון מלאי אנדותלין-1 (ET-1) (10 מיקרומטר) ומאוחסנים ב-20°C(20°C).</li>
	<li>הכן 10 מ"ל של הפתרון של Tyrode. הוסף 10 μL של פתרון מניית ET-1 (10 מיקרומטר) כדי להפוך את הריכוז הסופי של ET-1 10 nM.</li>
	<li>להקליט את הלחץ הזוהר עם זרימה מתמדת תמונה שריר הפפילרי.</li>
	<li>החלף פתרון לומינלי לפתרון המכיל ET-1.</li>
</ol>11. תמונות לדוגמה של נימי עם פריצילים (איור 7)
<ol><li>להקריב עכבר מהונדס NG2DsRedBAC כמתואר בסעיף 4 של פרוטוקול זה.</li>
	<li>לחלץ את הלב, cannulate את עורק המחיצה ולטעון את המדגם עם Alexa-Fluor-488 מצומד WGA בעקבות פרוטוקולים 5-7.</li>
	<li>תמונה שריר הפפילרי ב 488 ננומטר ו 560 ננומטר עירור, ו 510-525 ננומטר, 575-625 ננומטר פליטה באמצעות confocal. לחץ העורקים יהיה סביב 40 מ"מ.ג.</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li>
<li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li>
<li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li>
<li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li>
<li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li>
<li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li>
<li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li>
<li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents%2C+Ca2%2B+signals%2C+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Amercian+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li>
<li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM1+enhances+SR+Ca2%2B+content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li>
<li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li>
<li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99(2019).</li>
<li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li>
</ol>

בעבודה הנוכחית, הצגנו שיטת אקס ויו פשוטה להפליא אך מעשית מאוד לחקר המיקרו-סירקולציה כלילית בלב בתנאים פיזיולוגיים. שיטה זו שונתה מחקירות מכניות באמצעות חולדות2. התוספת המאתגרת הייתה טכנולוגיית ההדמיה במהירות גבוהה וברזולוציה אופטית גבוהה. לכן, הצלחנו לנצל את מערכות ההדמיה האופטית המתקדמות הזמינות כיום באופן מסחרי. על ידי ניתוח זהיר ומיקום של הכנת שריר הפפילרי מתפקד בתנוחה חיובית, הצלחנו לדמיין arterioles, עורקים נימי מראש, נימים, ו venules, כמו גם את pericytes והצליחו למדוד לחץ עורקי ו / או זרימה ...

תקנה מתאימה לזרימת לחץ כלילית מבטיחה אספקת דם מספקת ללב כדי לענות על דרישותיו המטבוליות1. עם זאת, רק לאחרונה התברר כיצד זרימת הלחץ הכלילי מוסדר באופן דינמי בלב, למרות מחקרים מקיפים שבוצעו ב vivo ו במבחנה בעשורים האחרונים. אחת הסיבות לכך היא הקושי להקים מודל עבודה פיזיולוגי למחקרים כאלה עקב פעימות הלב המתמידות. ללא קשר, הוקמו מגוון שיטות לתצפית על כלי הדם הכליליים ברקמות או בבעלי חיים חיים, אך אף אחת משיטות אלה לא הצליחה להשיג מיקוד קבוע /יציב ומדידות הלחץ, הזרימה וקוטר המיקרו-וסקולרי בו זמנית2,3. ההדמיה הישירה של כלי הדם העורקיים הכליליים בלב פועם הוצגה לפני עשרות שנים4,3, אבל מדידות הקוטר בכלי קטן היה מאתגר ואת הפונקציות הספציפיות של סוגי תאים מיוחדים רבים הקשורים microcirculation היה מרגיז באותה מידה. אפילו השיטה סטרובוסקופית ומערכת אובייקטיבית צפה לא יכול לספק את המידע לעיל בו זמנית5. עם זאת, כמות משמעותית של מידע בעל ערך הושגה באמצעות הטכנולוגיות הנ"ל, אשר עזרו לנו להבין יותר על הרגולציה של זרימת דם כלילית6. השיטה שאנו מתארים במאמר זה תסייע לאחת לחקור ולהבין בפירוט כיצד רכיבים של עורקים כליליים, העורקים והמיקרו-וסקולטורה מגיבים באופן שונה לגירויים ולדרישות מטבוליות.
מודל העבודה שהקמנו כדי להמשיך במחקרים אלה נבנה על העבודה הקודמת של ווסטרהוף ואח'2. בעקבות קנולציה של עורק המחיצה של לב העכבר, תמיסת מלח פיזיולוגית שימשה כדי להחדיר את העורק כדי לשמור על myocytes ורכיבים אחרים של רקמת הלב ניזונו. לחץ הזלוף העורקי, הזרימה וקוטר כלי הדם היו במעקב בין פונקציות פיזיולוגיות אחרות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים מתאימים. שיטה זו מאפשרת לנו לדמיין את מיטת המיקרו-כלילית תחת לחץ פיזיולוגי ברקמה חיה וללמוד לראשונה את המנגנונים התאיים שבבסיס ויסות המיקרו-סירקולציה.

<table><tbody><tr><td>1 M תמיסת CaCl2</td><td>MilliporeSigma, ארה"ב</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>1 M תמיסת MgCl2</td><td>MilliporeSigma, ארה"ב</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>AxoScope תוכנה</td><td>התקנים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת צ'ילר/מים</td><td>FisherScientific, ארה"ב</td><td>Isotemp 3016S</td><td></td></tr><tr><td>קונפוקלי</td><td>Nikon Instruments, ארה"ב</td><td>A1R</td><td></td></tr><tr><td>צינורות זכוכית מותאמים אישית</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>9-000-3301</td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>מכשירים מולקולריים, סן חוזה, קליפורניה, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס, יפן</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>אנדותלין-1</td><td>MilliporeSigma, ארה"ב</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הפרין מלח</td><td>סיגמא-אולדריץ', ארה"ב</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>מחמם תמיסה מוטבע</td><td>Warner Istruments, המדן, קונטיקט, ארה"ב</td><td>SH-27B</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, איידהו, ארה"ב</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instruments, נובאטו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מיקרופיפטה/צינורית</td><td>Warner Istruments, המדן, קונטיקט, ארה"ב</td><td>64-0981</td><td></td></tr><tr><td>NG2DsRedBAC עכבר טרנסגני</td><td>מעבדת ג'קסון</td> <td>#008241</td><td></td></tr><tr><td>חוט ניילון לקשירת כלי דם</td><td>מכשור מערכות חיות, ברלינגטון, Vt, ארה"ב</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (פולידימתילסילוקסן)</td> <td>סילגארד, ג'רמנטאון, ויסקונסין, ארה"ב</td><td>184 SIL ELAST KIT</td><td></td></tr><tr><td>משאבה פריסטלטית</td><td>גילסון, מידלטון, ויסקונסין, ארה"ב</td><td>מיניפולס 3</td><td></td></tr><tr><td>סרוו לחץ בקר</td><td>מכשור מערכות חיות, ברלינגטון, Vt, ארה"ב</td><td>PS-200-S</td><td></td></tr><tr><td>מספריים</td><td>כלים מדעיים משובחים, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>מכשור מערכות חיים של משאבת סרוו</td><td>, ברלינגטון, Vt, ארה"ב</td><td>PS-200-P</td><td></td></tr><tr><td>בקר טמפרטורה</td><td>וורנר אינסטרומנטס, המדן, קונטיקט, ארה"ב</td><td>TC-324B</td><td></td></tr><tr><td>נבט חיטה אגלוטינין, אלקסה פלואור 488 Conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific, וולת'אם, MA ארה"ב</td><td>W11261</td><td></td></tr></tbody></table>

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

טון עורקי כלילית יחד עם פתיחה או סגירה של נימים במידה רבה לקבוע את זרימת הדם cardiomyocytes בלחץ זלוף מתמיד. עם זאת, קשה לעקוב אחר השינויים הדינמיים של העורקים הכליליים ונימים בלב כולו, בעיקר בשל התנועה שלה פועם ללא הפסקה. כאן אנו מתארים שיטה המאפשרת ניטור של קצב זלוף העורקים, לחץ ושינויים בקוטר של העורקים ונימים בשרירי הפפילרי הימניים של העכבר. עורק מחיצת העכבר הוא cannulated ו perfused בזרימה מתמדת או לחץ עם האחר נמדד באופן דינמי. לאחר זלוף עם לקטין שכותרתו פלואורסצנטית (למשל, אלקסה פלואור-488 או -633 שכותרתו חיטה-נבט Agglutinin, WGA), העורקים ונימים (וכלי דם אחרים) בשריר פפילרי החדר הימני מחיצה יכול להיות בתמונה בקלות. לאחר מכן ניתן למדוד את השינויים בקוטר כלי השיט בנוכחות או בהיעדר התכווצויות לב. כאשר חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית באו לידי ביטוי, ניתן היה לפקח על תכונות ספציפיות. לדוגמה, פריטיטים הוצגו בלבבות עכברים שהביעו NG2-DsRed. שיטה זו סיפקה פלטפורמה שימושית כדי ללמוד את הפונקציות הפיזיולוגיות של pericytes נימי בלב. הוא מתאים גם לחקר ההשפעה של ריאגנטים על זרימת הדם בלב על ידי מדידת קוטר כלי הדם / נימי ואת הלחץ הזוהר העורקי בו זמנית. הכנה זו, בשילוב עם מערכת הדמיה אופטית מתקדמת, מאפשרת לחקור את זרימת הדם ואת שליטתה ברמה התאית והמולקולרית בלב בתנאים כמעט פיזיולוגיים.

כאשר סמן כלי דם פלואורסצנטי הוא perfused לומן כלי דם (כאן WGA מצומד עם Alexa Fluor-488), ניתן לדמיין עצי כלי דם שלמים כפי שמוצג באיור 5 (פאנל שמאלי) באמצעות מיקרוסקופ confocal במהירות גבוהה. הגדלה נוספת מאפשרת הדמיה של נימי בפירוט(איור 5, לוח ימני). מאז המערכת בלחץ תומך ניטור מתמיד של לחץ לומינלי, הכנה זו יכולה לשמש לשינויים עמית בקוטר העורקים עם לחץ עורקי. וידאו 1 מראה כי כאשר pinacidil, ATP רגיש K+ ערוץ (KATP)אגוניסט הוגש...

מוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את microcirculation כלילית ברקמת לב מורין חי על ידי ניטור ex vivo של לחץ זלוף העורקים וזרימה השומרת על הלחץ, כמו גם רכיבי עץ כלי דם כולל מיטות נימי pericytes, כמו עורק הספל הוא משומר ולחץ.

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור מיקרו-סירקולציה כלילית ברקמת הלב של עכברים חיים וברכיבי עץ כלי הדם על ידי ניטור ex vivo של לחץ הזלוף העורקי והזרימה. שיטה זו מספקת פלטפורמה שימושית לחקר תפקודם של פריציטים וריאגנטים מיקרו-סירקולציה בתוך הלב, על ידי כך אנו נוטים למדוד את קוטר כלי הדם ואת הלחץ הלומינלי של העורקים. כדי להכין צינורית לניסוי, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי לייצר שתי צינוריות עם קצוות דקים וארוכים, מצינור זכוכית בורוסיליקט נקי אחד.השתמש במספריים עדינים ובמיקרוסקופ מנתח כדי לחתוך את קצה כל צינורית לקוטר קצה סופי של 100 עד 150 מיקרומטר, וללטש את הקצוות באש כדי לעגל מעט את הקצוות החדים. השתמש בחוט פלטינה הממוקם בצד הפיר, כשני מילימטרים מהקצה כדי לכופף את הצינורית לאורך הפיר לזווית של כ-45 מעלות, והכנס את הקצה הפתוח של הצינורית למחזיק הצינורית. לאחר מכן, הדק את האביזר והשתמש במזרק של חמישה מיליליטר כדי לשטוף את הצינורית והצינורות בתמיסה של טירוד.הרכיב את מחזיק הצינורית על מיקרו-מניפולציה של תא מיוגרף לחץ. כדי לאסוף לב עכבר לניסוי, הכניסו תחילה זוג לתוכו והזריקו 500 מיקרוליטר של הפרין לעכבר מורדם בן שמונה עד 16 שבועות. לאחר 10 דקות, הניחו את העכבר על מיטה מחוממת במצב שכיבה, וייצבו את הכפות בעזרת סרט תיוג.השתמש במלקחיים ובמספריים כירורגיים כדי לבצע חתך בעור הבטן, מעל הסרעפת וחתוך את הסרעפת ואת עצם החזה כדי לאפשר דיסקציה של הלב מחלל בית החזה. הכניסו את הלב לתמיסה של טירוד קר כקרח המכילה 30 מילי-מולרי BDM והסירו את כל רקמות החיבור מהלב לפי הצורך. לאחר מכן הכניסו את הלב לתא ניתוח מקורר מראש, מלא בתמיסת Tyrode טרייה בתוספת BDM של 30 מילי-מולארי.כדי להכין את עורק המחיצה לקנולציה, הפעל את סרוו פומפ והגדר את לחץ בקר הסרוו למצב זרימה. בלב על ה-PDMS, תוך הקפדה על מניעת נזק לאזור האמצעי של הרקמה והנחת הרקמה תחת מיקרוסקופ חיתוך. הסר אחת הפרוזדורים או את שתיהן, וחתוך את החדר הימני.הסר את הקיר החופשי של החדר הימני וחשוף את עורק המחיצה. השתמש בחוט ניילון בקוטר 30 מיקרומטר כדי לקשור קשר רופף סביב עורק המחיצה. השתמש במספריים עדינים כדי להסיר את הדופן החופשית של החדר השמאלי ולהעביר את הכנת השרירים הפפילרית לתא הניסוי.השתמש במניפולטור מיקרו כדי להכניס צינורית לעורק המחיצה ולאבטח את הצינורית עם התפר. לאחר מכן השתמש בסיכות כדי להדק את השריר הפפילרי לרצפת החדר כשקצה הצינורית מקביל לדופן העורק, כך שניתן לקבל תצוגה ברורה של כלי הדם ולהשתמש במזרק כדי לשטוף בהדרגה את התמיסה דרך הצינורית. כדי לייצב את הכנת הרקמות, הפעל משאבה פריסטלטית ומזג ברציפות את התכשיר עם תמיסת מלח פיזיולוגית מוגזת מראש בקצב זרימה של שלושה עד ארבעה מיליליטר לדקה, הפעל את בקר הטמפרטורה עבור תמיסת הסופר-פיוזאט והתאם את הטמפרטורה של הסופרפוסאט של האמבטיה ל-35 עד 37 מעלות צלזיוס.חבר את הצינורית למשאבת הסרוו והתאם את הזרימה כדי להגדיר את הלחץ לכ-10 מילימטרים כספית. הניחו לסופר-פיוז'ן לפעול במשך כ-10 דקות, ואז הגדילו את זרימת התמיסה הלומינלית כדי להגדיר את לחץ העורק לכ-60 מילימטרים של כספית ולאפשר לדגימה להתייצב במשך 30 עד 60 דקות עם ניטור. כדי להעמיס את הדגימה באגלוטינין נבט חיטה, יש לערבב את התכשיר בחמישה מיליליטר של תמיסת טירוד, בתוספת 100 מיקרוגרם של אגלוטינין מצומד נבט חיטה מצומד Alexa Fluor-488.לאחר 30 דקות, החליפו את עזר ה-perfuse בחזרה לתמיסה הרגילה של Tyrode והפעילו את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש במיקרוסקופ בעוצמת הגדלה נמוכה יותר, כדי לאתר את עורק המחיצה במצב אור מועבר, והתחל לצלם עם קונפוקל הדיסק המסתובב הזה. בחר הגדלת אובייקט של פי 40, ואת לייזר העירור של 488 ננומטר, והתאם את עוצמת הלייזר ואת קצב הדגימה.כדי להגדיר את טווח ההדמיה, הגדר את מיקומי ההדמיה העליונים והתחתונים עבור המיקרוסקופ והגדר את גודל הצעד ואת פרמטרי ההדמיה של Z-stack. לאחר מכן, בחר תיקיה לאחסון התמונה ולחץ על הפעל כדי להתחיל להקליט את התמונות. כאשר סמן כלי דם פלואורסצנטי מוחדר ללומן כלי הדם, ניתן לדמיין עצי כלי דם שלמים, באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית במהירות גבוהה.הגדלה נוספת מאפשרת הדמיה של הנימים בפירוט. כאשר מוגש אגוניסט תעלת אשלגן רגיש לפינאצידיל ו- ATP מהלומן, קוטר העורקים גדל. כאשר האנדותלין מכווץ כלי הדם מוחל מהלומן.קוטר העורק פוחת. כאשר ערכת הזרימה קבועה, לחץ הלומינל עולה. בתמונות אלה של רקמה פפילרית מעכבר אדום המבטא NG 2 DS, ניתן לדמיין הן את הנימים והן את הפריציטים בתוך רקמת השריר הפפילרי, בתנאים המחקים טוב יותר את הפיזיולוגיה של בעלי חיים חיים.חשוב שלא יהיו בועות בתוך הצינור בשום שלב במהלך ההליך. בשילוב שיטה זו עם טכניקות הדמיה אופטיות, ניתן להשתמש בתכשיר לחקר מיקרו-סירקולציה בלב ותקשורת בין-תאית בין סוגי תאים שונים, באמצעות עכברים טרנסגניים בטכנולוגיה פלואורסצנטית.

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

מאמר זה מפרט את הליך הנתיחה, הגדרת תפקיד, ואת תנאי הניסוי במהלך מיפוי אופטי פוטנציאל הטרנסממברני (VM) וסידן תאיים חולף (CAT) ב Langendorff מבודד בלב שלם perfused העכבר.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע...

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

מיקרוסקופיה Intravital של זרימת דם Cremaster העכבר מ 'מציעה ייחודית וסטנדרטיזציה גם במודל vivo לניתוח נדידת תאי גזע של מח עצם היקפי.

מיקרוסקופית Intravital של זרימת הדם בשריר העכבר Cremaster לניתוח של נדידת תאי גזע היקפי

בדיקה echocardiographic משמש לעתים קרובות בעכברים. מכשירי אולטרסאונד ברזולוציה גבוהה יקר פותחו למטרה זו. פרוטוקול זה מתאר הליך echocardiographic סבירים בשילוב עם morphometric היסטולוגית ניתוחים כדי לקבוע מורפולוגיה לב.

בבדיקה היסטולוגית ו echocardiographic של מורפולוגיה לב העכבר

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

מחקר זה מתאר פרוטוקול הדמיית תהודה מגנטית לב וכלי דם מקיפה (CMR) כדי לכמת את הפרמטרים התפקודיים של החדר השמאלי של לב העכבר. הפרוטוקול מתאר רכישה, לאחר עיבוד וניתוח של תמונות CMR, כמו גם הערכה של פרמטרים תפקודיים לב שונים.

כימות של תפקוד החדר השמאלי של לב העכבר, זן שריר הלב וכוחות המודינמיים על ידי הדמיית תהודה מגנטית לב וכלי דם

פרוטוקול זה מציג צעדים לרכישה וניתוח של תמונות סידן פלואורסצנטיות מפריקיטים משחישת מוח ונתוני זרימת דם מכלי דם סמוכים בעכברים מרדים. טכניקות אלה שימושיות למחקרים של פיזיולוגיה של תאי קיר וניתן להתאים אותן לחקור סידן ארעי בכל סוג תא.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

הכנה אינטנסיבית של "צינורות" אנדותל מוחיים של עכבר שלמים מעורקיים פרנצ'ימליים מוחיים מודגמת לחקר ויסות זרימת הדם במוח. יתר על כן, אנו מדגימים את החוזקות הניסיוניות של מודל מחקר אנדותל זה להדמיית פלואורסצנטיות ומדידה אלקטרופיזיולוגית של מסלולי איתות תאיים מרכזיים, כולל שינויים בתאיים [Ca2+] ופוטנציאל הממברנה.

בידוד וניתוח פונקציונלי של אנדותל עורקי של מפרקת מוח עכבר

פרוטוקול זה מציג שיטה מהירה להדמיית כלי דם תלת מימדית כמותית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור. יעילות השיטה מודגמת באמצעות מערכת עורקי קשת הלוע של מודל עובר האפרוח, עם כוחות המודינמיים המכומתים באמצעות דינמיקת נוזלים חישובית.

הדמיה מהירה ברזולוציה גבוהה של כלי דם של בעלי חיים קטנים למחקרים כמותיים

למד מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר. שיטה זו מאפשרת ניטור לחץ וזרימת הדם בעורקים ומספקת פלטפורמה לחקר תפקוד הפריציטים במיקרו-מחזור הדם הלבבי.

מדידה והדמיה דינמיות של נימים, עורקים ופריציטים בלב העכבר

גלה סרטונים נוספים