ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

פיזור רנטגן ביולוגי בזווית קטנה מספק מדידות מבניות של קומפלקסים מקרומולקולליים ומאקרומולקולריים. באופן אידיאלי, המדגם שיש למדוד צריך להיות monodispersed. אמנם במקרים מסוימים, גודל הדרת כרומטוגרפיה SAXS אינו מספיק כדי לייצר monodispersity, deconvolution מבוסס תוכנה של נתוני SAXS יכול להתבצע כדי לייצר עקומת SAXS אידיאליזציה.

בעקבות פרוטוקול זה, תוכנית deconvolution ואת תוכנית פיזור ידידותי למשתמש ניתן להשתמש כדי לנתח את הנגיף Vaccinia DNA פולימראז מוטציות exominus. כדי לבצע חיסור רקע של נתוני הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל, פתח את תוכנית פיזור 4 המבוססת על Java ופתח את הכרטיסיה SEC. גרור ושחרר את קבצי הנתונים המופחתים לתוך הנתונים הנפתחים שמתחת לחלון ולחץ על לחצן ספריית הפלט ופתיחה כדי להגדיר את ספריית הפלט שבה יישמרו הנתונים.

הזן את השם לדוגמה בתיבה שמור בשם ולחץ על מעקב. לחץ על כפתור עריכת הפרטים כדי לערוך את הפרטים הניסיוניים ולמלא את השדות המתאימים. כדי לבחור את מסגרות המאגר באופן ידני, לחץ על הגדר מאגרים.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור כדי לבחור מחדש את המאגר כשטוחה בעקומת המעקב לפני נפח הריק של עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל של כ- 100 מסגרות ולחץ על הגדר מאגר ועדכן כדי לחשב מחדש את קובץ ה- SEC. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור כדי לבחור אזור מעניין בעלילת האות ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור את הקרוס-שערות בעלילת מפת החום כדי לבחור את הזום ואת קבוצת המשנה של המסגרות שישמשו למיזוג. בלחיצה שמאלית נוספת, סמן את המסגרות במפת החום המתאימה לאזור בפינה השמאלית התחתונה של הכוונת.

באופן אידיאלי, המסגרת צריכה להדגיש אזור עם צבע ציאן בעיקר ורדיוס יציב של gyration. כאשר המסגרות שנבחרו מרוצות, לחץ על מזג כדי למזג את המסגרות המחסות ולחץ על הכרטיסיה ניתוח כדי להציג את הנתונים. עבור פירוק הנתונים, טען את ערכת הנתונים בתוכנית deconvolution.

בלוח הבקרה תחת קבצים, השתמש בסמל התיקיה כדי לאתר את הנתונים ולסמן את כל קבצי ה- DAT. עלילה של אינטנסיביות משולבת לעומת מספר מסגרת תצויר בעלילה של הסדרה. תחת הכרטיסיה סידרה, לחץ כדי לסמן את העקומה ולפתוח את החלון המוקפץ של ניתוח LC.

כדי לבחור אזור מאגר מתאים, לחץ על הוסף אזור כדי לבחור אזור לפני שיא הכרומטוגרמה ואחד אחרי חזית הממס ולחץ על הגדר מאגר. חלונות מוקפצים יציינו שלא נבחרו מסגרות עבור הרקע. כדי להפעיל את EFA, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ המסומן ובחר EFA מהתפריט.

בחלון המוקפץ, יש לראות את פירוק הערך היחיד של ערכת הנתונים. בתיבה פקדים, סמן את ערכי התיבה השתמש בערכי התיבה מסגרות כדי לאשר שכל אזור השיא כדי לבטל את ההתמזגות מכוסה בהתווית העוצמה. עלילת הערכים הייחודיים תראה את עוצמת הערכים הייחודיים שמעל לקו הבסיס.

אם הווקטורים הבודדים משמאל ומימין אינם תואמים, שנה את המספר הווקטורי הייחודי המשמעותי לשניים והזז את המסגרות עד שהווקטורים הייחודיים השמאליים והימין דומים. EFA יחושב, יצירת חלקות בכיוונים קדימה ואחורה עבור כל וקטור ומציין מתי הרכיבים להתחיל ולצאת פרופיל הפתרון עבור הנתונים CHROMATOGRAPHY אי הכללת גודל שנבחרו SAXS נתונים. RAW ינסה לזהות את הטווחים.

במידת הצורך, השתמש בחצים כדי לשנות את הטווחים כך שכל עיגול הוא ההתחלה של נקודת פיתול, עולה או נופל לקו הבסיס ולחץ על הבא. כדי להקטין או למנוע קוצים, זהה בערך איזו מסגרת תואמת את הקו הדקר באמצעות חצי בקרת הטווח כדי לכוונן את פקדי טווח הרכיבים. לאחר שהושג ריבוע צ'י מינימלי, לחץ על חזרה כדי לבצע בדיקת אימות.

אם ההתוויות המקוריות של EFA עדיין נראות חוקיות, לחץ על הבא ושמור נתוני EFA כדי לשמור את ההתוויות. לאחר מכן לחץ על בוצע כדי לסגור את חלון EFA. לאחר מכן, בחלון RAW, פתחו פרופילים בחלונית ההתוויה כדי להציג את העקומות.

בכרטיסיה פרופילים של לוח הבקרה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשמור את הקימורים כקבצי DAT. לקביעת SAXS, פתחו את לשונית ניתוח פיזור ובחרו G לבחירת כלי הניתוח הידני של Guinier. בעלילה, להוסיף או להסיר נקודות כך השיורי אין חיוך או תכונה זועפת.

הנתונים שנבחרו בהתקף Guinier לא יעלה על התור המרבי כפול רדיוס של מגבלת gyration של 1.3. לחץ על Kratky מנורמל. העלילה המתקבלת מספקת הערכה של המצב המבני של המקרומולקולה, כדורית, גלילית, פרועה, מנורמלת למסה וריכוז.

לחץ על נפח המתאם. העוצמה המפוזרת הכוללת ושער משולב בעוצמה המפוזרת הכוללת כפונקציה של חלקות Q יופיעו כהפניה מהירה לאימות איכות עקומת ההתפזרות. כדי להתחיל בניתוח הגמישות, לחץ על גמישות.

כל פאנל בחלון המוקפץ יראה עלילה המנצלת יחסי דיני כוח הקיימים בין הביופולימרים הקומפקטיים והגמישים המוארכים. השתמש במ המחוון בתחתית התיבה כדי לשנות את תצוגת הנתונים עד להגעה לרמה באחת מההתוויות. מיד לאחר ביצוע ניתוח גמישות, לחץ על עוצמת הקול.

ייווצר חלון מוקפץ של שלושה גרפים. העלילה של Porod-Debye עוקבת אחר המקום שבו הושאר המחוון מתווית הגמישות ומראה את נתוני האזור הממוזגים. כדי לחשב את נפח החלקיק, הזז את נקודות ההתחלה והסיום עד שהקו הכחול בחלקה יתאים לאזור הרמה.

לתוצאה בלתי משוחדת, השאריות בחוק הכוח המעריך של פורוד-דביי לא צריכות להראות שום דפוס. תחת הכרטיסיה P של R, ניתן לראות את התפלגות החלל האמיתית ואת עקומת פיזור עבור המדגם. באופן אידיאלי, עקומת ההפצה צריכה להיות חלקה ללא גלים וצריך פשוט לגעת בעדינות בציר ה- x.

לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם לדוגמה ולחץ על חפש את DMAX כדי לפתוח חלון חדש. המגבלות עבור הממד המרבי מוגדרות מראש עם טווח Q המרבי המוצע, נקודות הנתונים המרביות שישמש לחישוב, מגבלות הממד המרבי התחתון והגבוה וציון אלפא תחתון וגביוני. לחץ על התחל.

התפלגות מורכבת תיווצר יחד עם ממד מרבי מוצע ורמה אלפא. אם נתונים אלה קבילים, סגור את החלון כדי לחזור ללשונית P of R שבה ייחיתוך כעת התוויית הרווח ההדדי כדי להתאים לטווח Q המרבי המוצע. בחרו במודל 'עוד' ולחצו על הרקע כדי להגדיר את רמת האלפא והממד המרבי לערכים המוצעים מהתיבה הנפתחת.

לחץ על מקד. תתווית אימות צולב תיפתח, ותוצר אם יש לדחות נקודות כלשהן כפי שצוין באדום. אם יש רק כמה נקודות שנדחו וההפצה נראית טוב, אז המודל טוב.

תדפיס דוח בכרטיסיה ניתוח. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסמן את הדוגמה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם לדוגמה. בחר צור דוח מערכת הנתונים הבודדת.

תיבת טקסט תיפתח כדי לאפשר הפקת הערות ומסמך PDF המציג את כל הנתונים והערכים שנוצרו. בניתוח מייצג זה, E9 DNA פולימראז exonuclease מינוס מוטציה היה קשור ל- DNA ולהפעיל באמצעות גודל הדרת כרומטוגרפיה רנטגן בזווית קטנה פיזור. שתי פסגות נצפו.

הפסגה הגדולה הראשונה מייצגת את E9 DNA פולימראז אקסונוקלאז מינוס קומפלקס DNA מוטציה. והשני מציין את המצב הלא מאוגד. בעוד שהגישה הקלאסית של בחירת מסגרות מספקת רדיוס יציב של gyration של המתחם בפסגה הראשונה, הפסגה השנייה ממוזגת בבירור ורדיוס ההתמזגות על פני העלילה מראה כי לשיא השני של העניין אין רדיוס יציב של gyration עקב זיהום חוצה שיא.

בניתוח זה, ניתן היה להשתמש רק בחמש מסגרות שהראו רדיוס יציב למחצה של gyration. כאשר הפחיתו, הם נתנו רדיוס של gyration של 36.3 אנגסטרום. כאשר הפסגות היו deconvoluted באמצעות EFA, העקומה המתאימה עבור הפסגה השנייה היה מכוסה עם המקורי, מראה ירידה ברורה באות לרעש ורדיוס נמוך יותר של gyration של 34.1 אנגסטרום.

עלילה Kratky של הנתונים מגלה כי המתחם עם השיא המפותל הוא כדורי יותר כפי שאושר על ידי עקומת יחסי ציבור אשר נותן מימד מרבי של 108.5 אנגסטרום עבור העקומה deconvoluted. הנתונים שאינם מנוכרים לניתוח זה מוארכים יותר עם מימד מרבי של 120 אנגסטרום, ככל הנראה בשל ההטרוגניות הנובעת ממוטנט הפולימראז E9 הלא מאוגד מינוס אקסונוקלאז. השלבים הקריטיים ביותר הם בבחירת הערכים הייחודיים וטווח הנתונים המשמשים כנתונים אלה משפיעים מאוד על דיוק הניתוק.

אין לקחת את התוצאות בעצמן, אלא להעריך עוד יותר באמצעות טכניקות נוספות כגון צנטריפוגה אנליטית או פיזור אור לייזר רב-זוויתי כדי לאפשר את הפרשנות הביולוגית שלהם. SAXS בשורה בשילוב עם deconvolution וממשק ידידותי למשתמש כמו התוכנית פיזור מספק הוא חבילה רבת עוצמה כדי לספק נתונים מבניים משמעותיים אפילו מערכות קשות במהותו.