מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

השיטה מאפשרת מדידה של אישור חלבון ואינטראקציות חלבון. הרכב החיץ, טוהר הדגימה ודרישות ריכוז החלבון גמישים ומאפשרים לשיטה לטפל בבעיות מבניות מאתגרות. טכניקה זו מאפשרת דחיסה של דגימות במגוון רחב של מערכות חיץ שונות.

באמצעות שיטת dosimetry שלנו, חוקרים יכולים לפקח על כמה טוב התגובות שלהם תיוג עובדים בזמן אמת. יישום אחד של טכנולוגיה זו הוא בפיתוח תרופות כי זה מאפשר לחוקרים לבדוק ניסוחים שונים באופן נרחב סמים וכיצד הם משפיעים על מבנה החלבון. כדי להכין את הספסל האופטי FPOP.

תחילה להפעיל את הלייזר ולהגדיר את הלייזר להדק חיצוני, אנרגיה מתמדת ללא החלפת גז. כאשר הלייזר התחמם להגדיר את אנרגיית הלייזר לכל פולס בין 80 ל 120 מיליגרם לדופק ולהשתמש לפיד בוטאן בעדינות לשרוף את קידוד פולימיד של נימי במקום שבו dosimeter מוטבע יקרא את האות סופג ב 265 ננומטר לאחר חשיפה לייזר. השתמש לנגב ללא מוך ומתנול כדי לנגב בעדינות את הפסולת מן נימי ולהניח את נימי ניקה דרך נתיב הקרן של הלייזר לתוך dosimeter מוטבע.

לחץ על הידית בחלק העליון של dosimeter מוטבע כדי לפתוח את הציר ולהסיר את המחזיקים המגנטיים. מניחים את נימי חריץ המכונה של dosimeter מוטבע באמצעות המחזיקים המגנטיים כדי לשמור על נימי במקום ולסגור את ציר dosimeter מעל נימי לחיצה על הציר עד המנוף ננעל במקום. לחץ על כפתור פלאש ההתחלה בתוכנת dosimetry כדי להתחיל לירות בלייזר excimer ולהגדיר את קצב החזרה מראש בין 10 ל 20 הרץ בתוכנת dosimetry עם ירי לייזר להזיז את השלב ממונע דרך טווח התנועה שלה, להבטיח כי הקרן נשארת מרוכזת על הצמצם, כי הצללית של נימי ניתן לראות לאורך כל הדרך.

לאחר מכן לשטוף את נימי עם מים ב 20 microliters לדקה לפחות דקה ולחץ להתחיל נתונים בתוספת אפס אוטומטי בתוכנת dosimeter לאפס את dosimeter למים לפני תחילת איסוף הנתונים. כדי לבצע ניסוי FPOP להוסיף שני microliters של מי חמצן ל 18 microliters של פתרון FPOP ולהשתמש פיפטה בעדינות לערבב את הפתרון במהירות לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה מיד להשתמש מזרק גז הדוק כדי לטעון את הפתרון לתוך משאבת מזרק. לחץ להתחיל משאבה ולהתחיל נתונים בתוכנת dosimeter כדי להתחיל את הזרימה על משאבת המזרק בקצב הזרימה המתאים ולהשתמש dosimeter מוטבע כדי לפקח על קריאת אדנין בזמן אמת עד האות סופג ב 265 ננומטר מייצב איסוף המדגם במיכל פסולת.

כדי להתחיל לירות בלייזר בקצב החזרה המוגדר מראש, לחץ על לחצן הפלאש של ההפעלה בתוכנת dosimeter ולהשתמש ב- dosimeter מוטבע כדי לפקח על קריאת אדנין בזמן אמת. ההבדל בספיגה ב 265 ננומטר עם הלייזר כבוי הלייזר על יהיה סופגי דלתא ב 265 ננומטר קריאה. כדי להבטיח כי רדיקלי הידרוקסיל דומים זמינים להגיב עם חלבונים על פני דגימות שונות.

השווה את סופגי הדלתא בקריאה של 265 ננומטר שהושגה עם הדוזימטר ההפניתי עם ספיגת הדלתא הרצויה בקריאה של 265 ננומטר שהתקבלה מניסויים או פקדים קודמים. אם הקריאה היא ברמה הרצויה לאסוף את המדגם מיד לאחר לייזר או קרינה במאגר מרווה. כדי לפצות על המינון הרדיקלי היעיל כדי להשוות את קריאות הספיגה לשנות את ריכוז מי חמצן, לשנות את אנרגיית הלייזר לכל פולס או לשנות את מישור המוקד של עדשת ההתמקדות כדי להגדיל את שטף הלייזר.

כדי לבצע שינוי יחידת ספיגה של יותר מ -10 מילי בדלתא סופגים קוראים מחדש את המדגם עם מי חמצן פחות או יותר והפעלה חוזרת של המדגם כפי שהוכח. כדי לבצע שינוי קטן בקריאת הספיגה בזמן אמת, השתמש בשלב ממונע 50 מילימטר כדי להתאים את המיקום של עדשת ההתמקדות כדי להתאים את מישור המוקד של קרן האירוע. כדי למדוד את הכמות האפקטיבית של הידרוקסיל רדיקלי נוכח המדגם לאחר קרינת לייזר לפקח על ספיגת דלתא אדנין ב 265 ננומטר בזמן אמת עם גלאי נימי UV מוטבע באמצעות השלב ממונע כדי להתאים את מיקום העדשה עד הדלתא סופג ב 265 ננומטר קריאה שווה לקריאה הרצויה.

השוואה של טביעת הרגל פפטיד שרשרת כבדה של biosimilar adilumumab במאגר פוספט ולאחר חימום ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת מגלה כי אזורי פפטיד המצוין להפגין הגנה משמעותית מפני ממיסים כאשר החלבון מחומם כדי ליצור אגרגטים. שימוש dosimeter מוטבע בזמן אמת כדי לפקח על ההבדל סופג אדנין לפני ואחרי לייזר או קרינה עולה כי שינוי דומה ברמת סופג אדנין נצפתה במאגר MES לעומת חיץ פוספט. בעוד החמצון הממוצע של הפפטידים נמוך יותר בנוכחות מאגר MES בהשוואה למאגר פוספט.

עם זאת, כמו שטף הלייזר הוא גדל יש תגובה שווה אדנין dosimetry ערכי חמצון פפטיד הממוצע הם כמעט זהים לאחר FPOP ומאגר MES ומאגר פוספט. כמו קריאת dosimetry מושפע ריכוז חמצן שטף לייזר, כמו גם נבלות רדיקלי. יש לדאוג כי התגובה dosimetry בין סקר מדגם קרוב זה לזה.

mutagenesis מכוון האתר משמש לעתים קרובות כדי לחקור אתרים מוגנים FPOP. זה מאפשר לחוקרים לקבוע אם השינויים נובעים אליסטר. טכניקה זו מקלה על השוואת חלבונים במאגרים שונים או ניסוחים המאפשרים לחוקרים לקבוע את ההשפעה של תוספים שונים על אישור חלבון.