הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

הפרוטוקול שלנו משלב שיטה נגישה להכנת ליפוזומים עתירי טסגליטאזר עם גישה יסודית להערכת ספיגת ליפוזומים ברמה התאית. טכניקה זו מספקת שיטה בלתי משוחדת להערכת הספיגה של ליפוזומים עם תווית פלואורסצנטית המוכנים באמצעות טמפרטורות נמוכות וציוד קל לרכישה. כדי להכין ליפוזומים עם תווית פלואורסצנטית עמוסים בסידן אצטט וטסגליטזר, השתמש תחילה בבדיקה של חצי אינץ' כדי לחליב תמיסת כלורופורם אתר של ליפידים על ידי סוניקציה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, 20 קילו-הרץ ו-50% הספק.

העבירו מיד את תמיסת תחליב המים והשמן ההומוגנית למאייד סיבובי עם מתאם מיוחד, מד ננומטר ושסתום ויסות לחץ וחברו את המאייד לקו ואקום. כדי להסיר את הממיסים האורגניים, הגדר את קצב הסיבוב ל-100 סיבובים לדקה ואת הוואקום ל-0.5 אטמוספרות. לאחר שג'ל נוצר ונעלם, הגדל את הוואקום ל-0.9 אטמוספרות וסנן את הפיזור המימי של הליפוזום קדימה ואחורה דרך מסנן פוליקרבונט של 200 ננומטר במכבש ליפוזום המצויד בשני מזרקים אטומים לגז מספר פעמים.

לאחר אימות התפלגות הגודל על ידי פיזור אור דינמי, השתמש בעמודת ספין של שני מיליליטר כדי להסיר כל טסגליטאזר לא כלוא מהליפוזומים והשתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז התרופה הכלואה. לאחר מכן הוסף לא יותר מ -500 מיקרוליטר של דגימת ליפוזום למיטת הג'ל היבשה. כדי לתת את הליפוזומים על ידי הזרקה רטרו-אורביטלית, לחץ בעדינות כלפי מטה על העור מעל ומתחת לעין החשופה כדי להרים את העין מעל מישור הפנים.

לאחר מכן הכנס בזהירות את קצה המחט בפינה הקדמית של העין, וודא שהמחט נמצאת מתחת לכדור מבלי לגעת בו, והזריק לאט את הליפוזומים לחלל הרטרו-אורביטלי. כדי לקצור את דגימת הדם, בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, בצע בזהירות חתך בעור בקצה הקצה הזנבי של כלוב הצלעות של העכבר וחתוך קו ישר של סנטימטר אחד כלפי מעלה לכיוון ראש החיה עד ששרירי החזה נחשפים. באתר החתך הראשוני, בצע שני חתכים קטנים בניצב לקו לכיוון הראש וחתוך בזהירות את שריר החזה בצד אחד של כלוב הצלעות באזור החשוף כדי לאפשר גישה טובה יותר לאתר החדרת המחט והדמיה שלו.

הכנס את המחט בין הצלעות השלישית והרביעית תוך שמירה עליה קרוב ככל האפשר לקו המרכזי של כלוב הצלעות, ומשוך בעדינות את המזרק כדי להתחיל לאסוף דם. כאשר נאסף נפח רב ככל האפשר, העבירו את הדם לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 10 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי על קרח. כדי לחלץ את כרית הרקמה המפשעתית מכל צד של העכבר, השתמש בסט אחד של מלקחיים כדי להחזיק את קרום הצפק בצד ימין ובסט השני של מלקחיים כדי להחזיק את קצה העור מעל קרום הצפק בצד השני.

משוך בעדינות את העור מהממברנה כדי להפריד את השכבות זו מזו. הצמד את הקצה החיצוני של העור כדי לגשת טוב יותר למצבור השומן ואתר את מצבור רקמות השומן המפשעתי לאורך העור. ואתר את בלוטת הלימפה המפשעתית במרכז מחסן השומן באמצעות מלקחיים ומספריים כדי להסיר את בלוטת הלימפה לפי הצורך.

לאחר הסרת בלוטת הלימפה, השתמש במלקחיים כדי לתפוס בזהירות את קצה מצבור השומן הקרוב ביותר לנקודה המוצמדת והתחל לבצע חתכים קטנים בקרום החיבור בין רקמת השומן לעור. הרם את רקמת השומן הרחק מהעור תוך כדי ביצוע חתכים לגישה טובה יותר לקרום, והנח את המחסן בבקבוקון פוליאתילן המכיל מאגר HEPES על קרח. כדי לחלץ את מצבורי השומן האפידידימליים מהקצה הזנבי של חלל הצפק, השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את מצבור השומן האפידידימלי הראשון מהקצה הגבי של העכבר ולאתר את האפידידימיס וכלי הדם המחוברים למחסן זה.

לאחר מכן חותכים בזהירות בין מצבור השומן לאפידידימיס וכלי הדם כדי להפריד את השומן מהרקמות האחרות ולהניח את הדפו בבקבוקון פוליאתילן עם מאגר HEPES על קרח. לאחר שכל הרקמות נקצרו, השתמש בזוג אחד עד שניים של מספריים כדי לטחון את דגימות רקמת השומן לשברי רקמה של 0.5 מילימטר. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיליליטר של שני מיליגרם למאגר קולגנאז לבקבוקונים של חתיכות רקמת שומן והניחו את הבקבוקונים באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-150 סיבובים לדקה למשך 30 עד 45 דקות.

לאחר 30 דקות, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשבש את הדגימות מספר פעמים. אם חלקי הרקמה עדיין גדולים מדי לפיפטינג קל, החזירו את הדגימות לחממה למשך 15 דקות נוספות. לאחר שהדגימות מתעכלות במלואן, יש לשלש את השברים 10 פעמים נוספות כדי להבטיח יצירת תרחיף תא בודד ולסנן כל דגימה דרך מסננים בודדים של 70 מיקרומטר לתוך צינור אחד של 50 מיליליטר לכל דגימה.

שטפו כל קובץ עם חמישה מיליליטר של מאגר FACS כדי לאסוף את כל התאים שנותרו ולסנן כל שטיפה לתוך הבקבוקון המתאים של דגימת התא על קרח. לאחר שכל הדגימות סוננו, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה ושאבו את הסופרנטנט השומני מהדגימות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנטים והשאירו את כדורי שבר כלי הדם הסטרומלי שלמים, והשעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר FACS לכל צינור.

לאחר מכן העבירו את המתלים לצינורות חדשים של 1.5 או 1.7 מיליליטר על קרח עד לניתוח ציטומטרי זרימה על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים. פיזור אור דינמי חושף קוטר ליפוזום ממוצע של 163.2 ננומטר ופוטנציאל זטה של מינוס 19.2 מילי-וולט. הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני חושפת ליפוזומים מעגליים עם סטיית תקן קטנה יחסית המתקבלת מהקוטר הממוצע כפי שנמדד על ידי פיזור אור דינמי.

ניתוח זרימה ציטומטרי של דגימות מעכברים שטופלו ב-PBS יכול לשמש כפלואורסצנטיות DiD מינוס בקרה אחת שבעזרתה ניתן ליצור שערים חיוביים של DiD. כפי שמודגם בניתוח מייצג זה, ריכוז העמסת ליפוזום של 10 מיליגרם למיליליטר של DiD הוא גבוה מדי, ועולה על הטווח הניתן לכימות של הציטומטר בכל שלוש הרקמות שנבדקו. ריכוז של 0.1 מיליגרם למיליליטר מדגים אות מסוים, אך לא נצפתה אוכלוסייה ברורה מעבר לתאים שטופלו ב-PBS.

לכן, ריכוז מיליגרם אחד למיליליטר, המדגים הבחנה ברורה מבקרת PBS תוך שהוא עדיין קריא על ידי המנתח, מומלץ לשימוש בהכנת ליפוזום. נדרשות אסטרטגיות שער שונות במקצת עבור כל סוג רקמה, אך ניתן לזהות את רוב סוגי התאים בכל אחד מהם. לאחר זיהוי אוכלוסיות ספציפיות מעניינות, ניתן לכמת את הגודל הכולל של כל אוכלוסיית תאים ואת התדירות שבה הם חיוביים ל-DiD.

הכנת ריאגנטים וציוד וחיזוי תוצאות לכל שלב היא קריטית. תוצאות בלתי צפויות בשלב מוקדם עלולות להרוס תוצאות עתידיות. ניתן להשתמש בשיטות היסטולוגיות כדי להעריך לוקליזציה של ליפוזומים ברקמה שלמה, בעוד שניתן להשתמש בציטומטריית זרימת הדמיה כדי לאמת הפנמת ליפוזום על בסיס כל תא.