Name: הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: למד הכנה וניתוח של ליפוזומים מתויגים בפלואורסצנט באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של ספיגה תאית ברקמות in vivo לפיתוח מערכות אספקת תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למייקל סולגה ולשאר צוות Flow Cytometry Core על מתן הדרכה ושירותים של ציטומטריית זרימה. המחברים רוצים גם להודות לשיווה סאי קרישנה דסה, דסטין ק. באוקנייט, מליסה א. מרשל, ג'יימס ס. גרמיי, שאנטל מקסקימינג, אדיטי אופאדי ופראסד סריקקולאפו על עזרתם בהכנת ליפוזום (SSKD, DKB), קציר רקמות (MAM, JCG), צביעת ציטומטריה של זרימה ורכישת דגימות (AU, PS, CM). עבודה זו נתמכה על ידי מענקי AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 ו-R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 ו-T32 HL007284.

<ol><li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+drug+delivery+systems%3A+from+concept+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li>
<li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286(2015).</li>
<li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR%CE%B1%2F%CE%B3+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">In vivo liposomal delivery of PPARα/γ dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li>
<li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li>
<li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+A+Fundamental+Process+in+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li>
<li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li>
<li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system%3A+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Rheumatology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li>
<li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29-containing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li>
<li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li>
<li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594(2011).</li>
<li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li>
<li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+AAPS+Journal%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li>
<li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li>
<li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li>
<li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines%3A+Recent+advances+and+future+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22BioImpacts%22%5BJournal%5D)">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li>
<li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li>
<li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li>
<li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarren%2C+JSA+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , (2019).</li>
<li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li>
<li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li>
<li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jirón Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621(2019).</li>
<li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li>
<li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן אנו מתארים פרוטוקול בן שלושה חלקים כדי (i) להכין ליפוזומים המסומנים בצבע שומנים פלואורסצנטי ועמוסים בתרכובת נגד סוכרת, tesaglitazar, (ii) לתת ליפוזומים לעכבר באמצעות הזרקה רטרו-מסלולית, ו-(iii) לקצור, לעבד ולהכתים רקמות כדי לזהות ספיגת ליפוזומים ברמה התאית על ידי ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה סוקר הכנה של ליפוזומים בגודל של כ-150 מיקרומטר והערכת ספיגה בשומן, בדם ובטחול. הכנת הליפוזום ניתנת להרחבה, מבוצעת בעיקר בטמפרטורת החדר, ומשתמשת באידוי בפאזה הפוכה כדי למקסם את העמסת התרופות וסילוקן של ממיסים אורגניים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להשיג ריכוז של עד 2 מ"ג/מ"ל טסגליטזאר בדגימת הליפוזום המטוהר. ניתן לאחסן את הליפוזומים המוכנים במאגר HEPES בטמפרטורה של 4°C למשך למעלה משנה. מניסיוננו, הם הדגימו שונות מינימלית של גודל החלקיקים הממוצע. פחות מ-10% מאובדן תכולת התרופות הודגם באופן ספקטרופוטומטרי, לאחר הפרדת אולטרה-פילטרציה של ליפוזומים מתרופה חיצונית עם מסנן צנטריפוגלי של 10 kDa .
במהלך הכנת הליפוזומים, ישנם כמה שלבים וגורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון. ראשית, סדר שלבי הפרוטוקול חשוב ויש להקפיד עליו. שנית, ה- pH של התמיסה המשמשת בעת טעינת tesaglitazar חייב להישמר על 7.4 על מנת למקסם מסיסות והעמסה יעילה. שלישית, הרכבה נכונה של ציוד ומסננים מבטיחה כי התפוקה של כל שלב היא בגודל וטוהר המתאימים. לדוגמה, אם מסננים של 100 ו-200 ננומטר אינם מורכבים כראוי, עלולה להיווצר אצווה הטרוגנית יותר ובגודל לא מתאים של ליפוזומים. רביעית, יש צורך בהסרה מלאה של Ca-אצטט לפני העמסת תרופות כדי למקסם את העברת הטסגליטזאר לליפוזומים. כדי לבדוק הסרה מלאה של Ca-אצטט, השתמש בשיקוע במהירות גבוהה כדי להסיר את הליפוזומים ולאחר מכן למדוד את רמות Ca-אצטט בתמיסה שאינה ליפוזומלית. חמישית, חשוב לשקול ולרשום את המסה של כל החומרים שנוספו להכנת הליפוזום בכל שלב. זה מבטיח שניתן לחשב ריכוזים נכונים ולשמור על יחסי החומרים הדרושים. לבסוף, אם הטכניקה אינה מבוצעת כראוי, עלולה להיות רמה לא רצויה של הטרוגניות. חשוב לבדוק היטב פרמטר זה באמצעות DLS וגישות אחרות כגון מיקרוסקופ אלקטרונים. כדי לשפר את ההומוגניות, שקול להתאים את גודל המסנן שנבחר או לערום שני מסננים.
בנוסף, קריטי שבקרות ולוח נוגדנים לציטומטריית זרימה יתוכננו ויעברו אופטימיזציה לפני ביצוע פרוטוקול זה במלואו (טבלה 1, טבלה 3). יש לבדוק נוגדנים כדי לוודא שריכוזים נאותים משמשים להכתמה ושהחפיפה בין הפלואורופורים היא מינימלית. העירור והפליטה של הצבע המשמש במהלך הכנת הליפוזומים חייבים להילקח בחשבון גם בתכנון הפאנל. בתוצאות שלנו, השתמשנו ב- DiD, שיש לו עירור ופליטה דומים לפלואורופורים כגון Allophycocyanin (APC) ו- AlexaFluor 647. לכן, לא בחרנו נוגדנים מצומדים לפלואורופורים אלה בלוח הנוגדנים שלנו. יתר על כן, בקרות איזוטיפ אינן כלולות בפרוטוקול זה. הסיבה לכך היא שהנוגדנים שנבחרו לפרוטוקול זה הם נוגדנים מאומתים היטב וזמינים מסחרית. עם זאת, אם מעוניינים להשתמש בנוגדן שלא עבר אופטימיזציה בעבר, אנא שקלו לבדוק את הנוגדן מול בקרת איזוטיפ על הרקמות המעניינות לפני ביצוע הניסוי המלא.
בעוד פרוטוקול זה מדגים כיצד לחלץ ולעבד את הדם, הטחול, השומן המפשעה ורקמות השומן האפידידימליות מהעכבר לאחר הטיפול, גישה כללית זו יכולה להיות מיושמת על רקמות אחרות. בהתאם לרקמה המעניינת, ייתכן שיהיה צורך לשנות את פרוטוקולי העיבוד והעיכול כפי שפורסם עבור הרקמות הבאות: ריאות 21, כבד22, חלל הצפק 3, מח עצם3,23, מוח 24.
מגבלה חשובה של שיטה זו שיש לקחת בחשבון היא שניתן להעריך ספיגה רק בנקודת זמן אחת לכל חיה. לכן, זה עשוי להיות יתרון לשלב פרוטוקול זה עם טכניקות הדמיה לא פולשניות אחרות או לתכנן בהתאם כדי להבטיח משאבים מספיקים לביצוע ההערכה. תזמון ספיגת התאים ותחלופת התאים הם גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון: ליפוזומים יזרמו בכל הגוף ב-24 השעות הראשונות, ובהתאם לתוחלת החיים של התאים שקולטים ליפוזומים או לאופן שבו הם מגיבים לספיגה, מוות תאי או פגוציטוזה נוספת. המחקר הקודם שלנו הראה שינויים במאפייני האוכלוסייה של אוכלוסיות DiD+ בנקודות זמן שונות3. מסיבה זו, הערכת ספיגה בנקודות זמן מוקדמות יותר או בנקודות זמן הרלוונטיות ביותר לביולוגיה של מנגנון העניין היא חשובה. בנוסף, בעוד שניתן לבצע כימות של ספיגת תאים ברקמה כולה באמצעות פרוטוקול זה, ציטומטריית זרימה אינה יכולה לחשוף לוקליזציה של רקמות. שילוב גישה זו עם שיטות היסטולוגיות יכול לעזור להתמודד עם מגבלה זו.
באופן כללי, פרוטוקול זה משלים מתודולוגיה קיימת כגון היסטולוגיה והדמיית פלואורסצנטיות של כל הגוף. עם המשך ההתקדמות בכלים ובשיטות של ציטומטריית זרימה, יתאפשר פיתוח פאנלים גדולים יותר ליותר ויותר אוכלוסיות תאים ספציפיות. אנו מציעים להשתמש בפרוטוקול זה בנוסף לשיטות הנ"ל מכיוון שזה ישפר את הערכת ספיגת התאים וגם יספק את ההזדמנות לאמת את התוצאות שנצפו על ידי ציטומטריית זרימה. לדוגמה, אם יימצא שרוב החלקיקים ברקמת השומן נקלטו על ידי מקרופאגים על ידי ציטומטריית זרימה. אימונופלואורסנציה של אליציטוט נוסף של אותה רקמת שומן יכולה להישמר, לתקן, לחתוך ולהכתים עבור סמני מקרופאגים כדי לוודא שסוג התא אכן תופס ליפוזומים. גישה זו צריכה להוסיף קפדנות למבחני ההפצה הביולוגית של ננו-חלקיקים שנערכו: אימות מיקוד ספציפי לתא, כימות ספיגה תאית, זיהוי ספיגה מחוץ למטרה, ובתקווה לספק מידע ליצירת השערות מכניסטיות לתוצאות טיפוליות נצפות. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם גם למחקרים עתידיים באמצעות ליפוזומים שונים, חקירת ספיגה ברקמות אחרות, ובדיקת תרכובות חדשות בסביבה של השמנת יתר ומטבוליזם או כל מחלה אחרת שבה העברת ננו-חלקיקים היא אפשרות טיפולית אפשרית.

ככל שהעניין בפיתוח טיפולים המשתמשים באספקת תרופות של ננו-חלקיקים גדל, השיטות להכין ולהעריך את התפלגות וקליטת החלקיקים חייבות להמשיך להתקדם, להתרחב ולהיות נגישות לקהילת המחקר 1,2. פרוטוקול זה פותח כדי להעריך את סוגי התאים המדויקים שלקחו ליפוזומים in vivo בעקבות טיפול בליפוזומים עם תווית DiD עמוסים בטסגליטזאר, קולטן פרוליפרטור המופעל על ידי פרוקסיזום (PPAR)-α/γ אגוניסט 3,4. במחקרים אלה, הצלחנו להעריך אילו סוגי תאים הושפעו ישירות מהטיפול בטסגליטזאר ליפוזומלי, את היעילות של מיקוד moieties, וליצור השערות כדי להסביר את תוצאות הטיפול שצפינו. יתר על כן, תפקודים ביולוגיים מבוססים במגוון סוגי תאים מצביעים על כך שתאים פגוציטיים כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים ותאי קופפר ספציפיים לכבד תופסים את רוב הליפוזומים 5,6,7. באמצעות פרוטוקול זה, הוכחנו כי פגוציטים לא קלאסיים יכולים גם לקחת ליפוזומים 3,4.
פרוטוקול זה מציג שיטה אופטימלית למסיסות טסגליטזאר, הכנת ליפוזומים על ידי אידוי בפאזה הפוכה, ושימוש בסידן אצטט כגורם מושך להעמסת תרופות מרחוק. השיטות המוצגות נגישות למעבדות רבות וחסרות חומרים קשים להשגה ושלבים הדורשים טמפרטורות גבוהות. הפרוטוקול מייצר ליפוזומים בגדלים אופטימליים להגברת זרימת הדם in vivo8. יתר על כן, כפי שסוכם על ידי Su et al., עד כה, שיטות להעריך פיזור ליפוזומים in vivo וספיגת רקמות נחקרו ונבדקו לעומק9. שיטות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), דימות תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה מולקולרית פלואורסצנטית (FMT) מיושמות כדי לכמת התפלגות ביולוגית ספציפית לרקמה וספיגה 9,10,11. בעוד שיטות אלה עברו אופטימיזציה כדי למקסם את הזיהוי in vivo, הן עדיין חסרות את היכולת לכמת את ספיגת הליפוזומים in vivo ברזולוציה תאית. הפרוטוקול המוצג כאן נועד להשיג צורך זה באמצעות שימוש בציטומטריית זרימה. לבסוף, עבור פרוטוקול זה, ספיגת התאים צומצמה למספר רקמות, כולל רקמת שומן. ישנו גוף הולך וגדל של ספרות החוקרת את הפוטנציאל לשימוש בננו-חלקיקים כדי לספק טיפולים בסביבה של השמנת יתר, חוסר מטבוליזם ודלקת 12,13,14,15,16,17. לכן, היה לנו חשוב לשתף פרוטוקול עם שיטות יעילות לעיבוד וניתוח רקמת שומן – אחת הרקמות שממלאת תפקיד חשוב בפתולוגיות האלה.

<table><tbody><tr><td>מזרק BD</td><td></td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>מחט 25 מד, סטרילי להזרקת רטרו-אורביטלית</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>מחט 27 מד, סטרילית להזרקת רטרו-אורביטלית</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר B220 BV421</td><td>Biolegend</td><td>103251</td><td>שיבוט RA3-6B2</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD115 PE</td><td>eBioscience</td><td>12-1152-82</td><td>שיבוט AFS98</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11b PerCP Cy5.5 נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>550993</td><td>שיבוט M1/70</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD11c APC ef780 נוגדן</td><td>eBioscience</td><td>47-0114-82</td><td>שיבוט N418</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD19 PE CF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562291</td><td>שיבוט 1D3</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD3 FITC נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>553061</td><td>שיבוט 145-2C11</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD31 BV605</td><td>Biolegend</td><td>102427</td><td>שיבוט 390</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD45 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>557235</td><td>שיבוט 30-F11</td></tr><tr><td>נגד עכבר F4/80 PE Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123114</td><td>שיבוט BM8</td></tr><tr><td>בקר סרום אלבומין</td><td>Gemini Bio-products</td><td>700-107P</td><td></td></tr><tr><td>התפלה ספין-טור</td><td>ThermoFisher</td><td>89889, 89890</td><td>עמוד ספין Zeba</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>פיזור אור דינמי, Nicomp 370</td><td>מערכת גודל חלקיקים, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIX & ערכת חדירות תאים PERM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>GAS004</td><td></td></tr><tr><td>ספוגי גזה</td><td>Dermacea</td><td>441211</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>3393-1MU</td><td></td></tr><tr><td>מכבש ליפוזום</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z373400</td><td>LiposoFast</td></tr><tr><td>Live/Dead Aqua</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>NS300</td><td></td></tr><tr><td>חומר סיכה עיניים</td><td>Optixcare</td><td></td><td>20 גרם/70 אונקיות</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד סטרילי, 16% w/v aq. soln., ללא מתנול</td><td>אלפא Aesar</td><td>433689L</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון פוליאתילן לטחינת</td><td>מאייד סיבובי Wheaton</td><td>986701</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Buchi</td><td>Re111</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Misonix</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>משאבת T/Pump משאבת טיפול בחום</td><td>וכרית Gaymer Industries</td><td>TP-500</td><td></td></tr><tr><td>Tesaglitazar</td><td>Tocris</td><td>3965</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות פוליקרבונט חרוטות מסלול</td><td>Thomas Scientific</td><td>1141Z**</td><td>Whatman, Nuclepore ממברנות הידרופיליות פוליקרבונט</td></tr><tr><td>ZetaSizer/DLS-ELS מערכת</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

יש עניין גובר בשימוש בליפוזומים כדי לספק תרכובות in vivo, במיוחד עבור גישות טיפול ממוקדות. בהתאם לנוסחת הליפוזומים, ליפוזומים עשויים להילקח באופן מועדף על ידי סוגי תאים שונים בגוף. זה עשוי להשפיע על היעילות של החלקיק הטיפולי כמו התקדמות של מחלות שונות הוא ספציפי רקמות וסוג התא. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה אחת לסינתזה ותיוג פלואורסצנטי של ליפוזומים באמצעות DSPC, כולסטרול ו-PEG-2000 DSPE וצבע השומנים DiD כתווית פלואורסצנטית. פרוטוקול זה מציג גם גישה להעברת ליפוזומים in vivo ולהערכת ספיגה ספציפית לתא של ליפוזומים באמצעות ציטומטריית זרימה. ניתן להשתמש בגישה זו כדי לקבוע את סוגי התאים שתופסים ליפוזומים ולכמת את ההתפלגות והפרופורציה של ספיגת הליפוזומים בין סוגי תאים ורקמות. למרות שלא הוזכרו בפרוטוקול זה, בדיקות נוספות כגון אימונופלואורסנציה והדמיית פלואורסצנטיות של תא בודד על ציטומטר יחזקו כל ממצאים או מסקנות שנעשו מכיוון שהם מאפשרים הערכה של צביעה תוך תאית. ייתכן שיהיה צורך להתאים פרוטוקולים בהתאם לרקמות המעניינות.

ייצור ליפוזום
התוצאות המתפרסמות כאן דומות לאלהשבעבודתנו שפורסמה בעבר 3,4,20. תוך שימוש בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מצפים לייצר ליפוזומים בגודל של כ-150-12160 ננומטר. DLS חושף קוטר ליפוזומי ממוצע של 163.2 ננומטר ופוטנציאל זטה של -19.2 mV (איור 1A). הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryo-EM) חושפת ליפוזומים מעגליים (איור 1B), ודיאגרמת DLS חושפת סטיית תקן קטנה יחסית מהקוטר הממוצע (איור 1C).
קשירת ליפוזום חיובית דורשת בקרה שטופלה ב-PBS
מחקרים קודמים מהקבוצה שלנו שהשתמשו בפרוטוקול זה בדקו אילו תת-קבוצות תאים בשומן, SVF, טחול ודם קשורים לליפוזומים לאחר שבוע של מתן in vivo 3,4. באמצעות עכבר שטופל ב-PBS, חלל הצפק ותאי הטחול הוכתמו באותו פאנל נוגדנים ששימש בדגימות מעכברים שטופלו בליפוזומים. רקמות נקצרו לאחר שבוע של טיפולים (איור 2A). הדגימות מהעכבר שטופל ב-PBS שימשו כ-DiD FMO שבאמצעותו ניתן היה ליצור שערי DiD חיוביים (איור 2B,C). ניתן ליצור שער חיובי באמצעות אות DiD-חיובי, אך יש להשתמש גם בדגימות חסרות אות DiD כדי לוודא שהשער החיובי אינו כולל דגימות DiD שליליות.
יש צורך בטיטרציות כדי למטב אותות פלואורסצנטיים
לפני ביצוע ניסוי מלא, יש לבצע אופטימיזציה של מצבים שונים, כולל ריכוז של נוגדנים מצומדים פלואורסצנטיים המשמשים במהלך צביעת תאים ושל צבע שומנים המשמש במהלך הכנת ליפוזומים. לציטומטרים של זרימה יש גבול עליון לזיהוי עוצמת פלואורסצנטיות, כך שיותר מדי צבע המשולב בליפוזומים יוביל לרמות בלתי ניתנות לכימות של אות DiD בדגימות העוברות דרך הציטומטר. יתר על כן, יותר מדי DiD בליפוזומים עלול להוביל לרמות גבוהות של העברת צבע לא ספציפית, מה שעלול להטות את תוצאות ספיגת התאים. איור 3 מדווח על תוצאות ניסוי שבו ריכוזי צבע שומנים עברו טיטרציה כדי לזהות את הריכוז שיפיק אות אופטימלי בטווח הגילוי של ציטומטר הזרימה שבו נעשה שימוש. זה נערך על הרקמות המעניינות עבור הניסוי האחרון: דם (איור 3A), שומן מפשעתי SVF (איור 3B), ושומן אפידידימלי SVF (איור 3C). הריכוזים שנבחרו לבדיקה היו 10 מ"ג של DiD (גבוה, אדום), 1 מ"ג DiD (אמצעי, כחול), או 0.1 מ"ג של DiD (נמוך, אפור) לכל 1 מ"ל של ליפוזומים. הריכוז הגבוה ביותר שנעשה בו שימוש בליפוזומים היה גבוה מדי ועבר את הטווח הניתן לכימות של הציטומטר בכל שלוש הרקמות (איור 3A\u2012C, אדום). הריכוז הנמוך ביותר של DiD הראה אות מסוים (איור 3 A\u2012C, אפור), אולם לא נצפתה אוכלוסייה ברורה מעבר לתאים שטופלו ב-PBS (איור 3A\u2012C, שחור). כאשר מכמתים, הממוצע האריתמטי של DiD MFI עבור כל רקמה וריכוז הראה הבחנה ברורה בין בקרות PBS לבין הריכוז האמצעי של DiD (איור 3D). לכן, כפי שמצוין בפרוטוקול, בחרנו את הריכוז האמצעי (איור 3, כחול) לשימוש בהכנת הליפוזומים שלנו.
השימוש בפאנל רב-נוגדנים מאפשר זיהוי ספיגת ליפוזום על ידי תת-קבוצות תאים שונות
באמצעות הפאנל המתואר בטבלה 3, תאים הוכתמו בנוגדנים כנגד סמנים של מקרופאגים, תאי B, תאי T, תאים דנדריטיים, מונוציטים ותאי אנדותל (איור 4). אסטרטגיות gating שונות במקצת נדרשות עבור כל סוג רקמה, אך ניתן לזהות את רוב סוגי התאים בכל אחד מהם. כמה יוצאים מן הכלל כוללים תאי אנדותל, אשר אינם נמצאים בדרך כלל בדם, מונוציטים, אשר בדרך כלל בתדירות גבוהה יותר בדם מאשר רקמות אחרות. לאחר זיהוי האוכלוסיות, ניתן לכמת את הגודל הכולל של כל אוכלוסיית תאים ואת התדירות שבה הם נמצאים ב-DiD+. ניתן לבצע חישובים נוספים כדי לאפיין את אוכלוסיית DiD+: איזה אחוז מתאי DiD+ הם מקרופאגים, תאי אנדותל וכו'. שימו לב, אלו הן אסטרטגיות לדוגמה, אך לא הדרך היחידה לנתח את הדגימות. הניתוח יוכתב על ידי הפאנל שנבחר וציטומטר הזרימה הזמין.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> איור 1: מאפיינים לדוגמה של ליפוזומים מוכנים. (א) הגודל ופוטנציאל הזטה נמדדו כמתואר לעיל ודווחו בצורת טבלה. כל פרמטר מוצג כממוצע ± סטיית התקן. (B) Cryo-EM שימש לדימוי הליפוזומים המוכנים. סרגל קנה המידה הלבן הוא באורך 50 ננומטר. (C) DLS שימש ליצירת היסטוגרמה של קוטר הליפוזומים בהכנה זו. איור זה נלקח מ Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> איור 2: צביעת DiD מייצגת מעכברים שטופלו ב-PBS או בליפוזום. (A) סכמה ניסיונית עבור PBS וטיפולים ליפוזומים. PBS או ליפוזומים הוזרקו שלוש פעמים במהלך שבוע אחד. רקמות נקצרו ביום 8 של הטיפול. (ב, ג) חלקות זרימה מייצגות חושפות צביעת DiD חיובית בעכברים שטופלו בליפוזומים (C), אך לא בעכברים שטופלו ב-PBS (B). FSC, פיזור קדימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> איור 3: טיטרציה של DiD בליפוזומים. ליפוזומים הוכנו עם שלושה ריכוזים שונים של DiD והוזרקו לעכברים. אפור מציין את הריכוז הנמוך ב-0.1 מ"ג DiD לכל 1 מ"ל ליפוזומים, כחול מציין את הריכוז האמצעי ב-1 מ"ג DiD/mL ליפוזומים, ואדום מציין את הריכוז הגבוה ב-10 מ"ג DiD/mL ליפוזומים. עכבר שטופל ב-PBS שימש כבקרה שלילית (שחור). דם (A, עיגול), שומן מפשעתי (B, משולש) ושומן אפידידימלי (C, מרובע) נקצרו 24 שעות לאחר ההזרקה ועובדו כדי לבודד תרחיף חד-תאי. דגימות אלה הופעלו על ציטומטר זרימה לרמה של DiD לזיהוי. היסטוגרמות ספציפיות לרקמות עם שכבות-על של כל קבוצת טיפול מוצגות כדי להדגים את עוצמת הפלואורסצנטיות לריכוז (A\u2012C). הממוצע האריתמטי של DiD כומת גם עבור כל רקמה וריכוז ושורטט (D). SSC = פיזור צד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> איור 4: ניתוח ציטומטריה של זרימה מייצגת של תת-קבוצות תאים בשומן SVF, דם וטחול. (A\u2012C) נציג סכמטי של אסטרטגיית gating לזיהוי תת-קבוצות תאים ותאי DiD+ בשומן SVF (A), טחול (B) ודם (C). קיצורים: FSC = פיזור קדימה; LD = חי/מת; L-DCs = תאים דנדריטיים לימפואידים; M-DCs = תאים דנדריטיים מיאלואידים; SSC = פיזור צד. איור זה נלקח מ Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>לשלוט</td>
			<td>תכלית</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">עכבר שטופל ב-PBS או במי מלח</td>
			<td>השתמש בתאים מעכבר זה עבור פקדי ציטומטריית הזרימה הבאים:</td>
		</tr><tr><td>1. תאים לא מוכתמים</td>
		</tr><tr><td>2. כתם יחיד חי/מת</td>
		</tr><tr><td>3. תאים מוכתמים בלוח המלא, אך חסרים את פלואורסצנטיות הליפוזום כדי לקבוע אות ליפוזומי חיובי במהלך הניתוח</td>
		</tr><tr><td>עכבר זה/עכבר זה / עכברים אלה ישמשו גם כדי לקבוע אם לליפוזומים יש השפעות כלשהן in vivo מכיוון שתהיה לך בקרה שאינה ליפוזומים בניסוי שלך.</td>
		</tr><tr><td>ליפוזומים פרוקים</td>
			<td>אם אתם מעמיסים תרכובת בליפוזומים שלכם, חלק מאצווה הליפוזומים שלכם צריך להיות מסונתז ללא התרכובת. זה מסביר את כל ההשפעות in vivo של הליפוזומים בלבד.</td>
		</tr><tr><td>DiD לבד</td>
			<td>מאחר ש-DiD יכול להיקלט גם על ידי קרומי התא, הקצאת חלק מהעכברים לקבלת צבע חופשי בכמות השווה לזו המצויה בליפוזומים תעזור להסביר כל צביעת קרום רקע.</td>
		</tr><tr><td>פקדי פלואורסצנטיות מינוס אחד (FMO)</td>
			<td>אלה הם תאים מוכתמים עם כל הנוגדנים מלבד אחד בלוח שלך. כמו #3 בתיבה לעיל, זה מסייע בקביעת אות חיובי אמיתי עבור נוגדן זה במהלך הניתוח</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: פקדים לשימוש בפרוטוקול זה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>תמיסה</td>
			<td>רכיבים</td>
			<td>אמצעי אחסון משוער הדרוש לכל אצווה/עכבר</td>
		</tr><tr><td colspan="3">הכנת ליפוזום</td>
		</tr><tr><td>סידן אצטט</td>
			<td>1 M סידן אצטט ב H2O</td>
			<td>50 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>חיץ HEPES</td>
			<td>10 mM HEPES ב H2O, pH 7.4</td>
			<td>50 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar ב HEPES</td>
			<td>ב 10 mM HEPES</td>
			<td>10 מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">קציר, עיבוד וצביעה של רקמות</td>
		</tr><tr><td>תמיסה חוצצת פוספט (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO4 אינץ' מזוקק H 2O</td>
			<td>2 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>PBS-הפרין</td>
			<td>0.1 מ"מ הפרין ב PBS</td>
			<td>10 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>חיץ HEPES</td>
			<td>20 מ"מ HEPES ב PBS</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>חיץ עיכול</td>
			<td>2 מ"ג/מ"ל Collagenase סוג I בחיץ HEPES</td>
			<td>5 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>חיץ ליזיס AKC</td>
			<td>0.158 מ' NH3 Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na 2 EDTA in ddH 2 O, pH7.2</td>
			<td>15 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>מאגר FACS</td>
			<td>1% BSA, 0.05% NaN3 ב-PBS</td>
			<td>15 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>בלוק Fc (מדולל)</td>
			<td>1:50 בלוק FC במאגר FACS</td>
			<td>250 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>מאגר קיבוע</td>
			<td>2% פרפורמאלדהיד ב-PBS</td>
			<td>200 מיקרוליטר</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: פתרונות להכנה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">צביעה חוץ-תאית (תערובת נוגדנים פי 2)</td>
		</tr><tr><td>אנטיגן</td>
			<td>פלואורופור</td>
			<td>נפח Ab לבדיקת 100 μL</td>
			<td>הנפח הכולל הדרוש:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>פרCP</td>
			<td>0.5 מיקרוליטר</td>
			<td>עמודה C x 1.2 x סה"כ # דוגמאות</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0.25 מיקרוליטר</td>
			<td>(0.5 מיקרוליטר / בדיקה) x (1.2) x (# דגימות)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0.25 מיקרוליטר</td>
			<td>(0.25 מיקרוליטר / בדיקה) x (1.2) x (# דגימות)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0.25 מיקרוליטר / בדיקה) x (1.2) x (# דגימות)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1.0 μL / בדיקה) x (1.2) x (# דגימות)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0.25 מיקרוליטר</td>
			<td>וכו...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1.5 מיקרוליטר</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">כדי ליצור את תמהיל הנוגדנים שלך, שלב את הנוגדנים המחושבים בעמודה D עם מאגר FACS או מאגר צביעה סגול מבריק* לנפח סופי של (50 μL x 1.2 x Total # samples)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">כתמים חיים/מתים (1x)</td>
		</tr><tr><td>חי/מת</td>
			<td>פלואורופור</td>
			<td>נפח L/D לבדיקת 200 uL</td>
			<td>הנפח הכולל הדרוש:</td>
		</tr><tr><td>חי/מת</td>
			<td>אקווה</td>
			<td>0.67 מיקרוליטר</td>
			<td>עמודה C x 1.2 x סה"כ # דוגמאות</td>
		</tr><tr><td colspan="4">צביעה תוך תאית (1x)</td>
		</tr><tr><td>אנטיגן</td>
			<td>פלואורופור</td>
			<td>נפח Ab לבדיקת 50 μL</td>
			<td>הנפח הכולל הדרוש:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>עמודה C x 1.2 x סה"כ # דוגמאות</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*יש להשתמש ב-Brilliant Violet Staining Buffer אם משתמשים ביותר מנוגדן אחד המצומד לפלואורופור Brilliant Violet בפאנל.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 3: לוח נוגדנים לדוגמה וחישובים של תערובות צביעה שישמשו לצביעת זרימה.

מטרת פרוטוקול זה היא לסנתז ליפוזומים בעלי תווית פלואורסצנטית ולהשתמש בציטומטריית זרימה כדי לזהות לוקליזציה in vivo של ליפוזומים ברמה התאית.

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

הפרוטוקול שלנו משלב שיטה נגישה להכנת ליפוזומים עתירי טסגליטאזר עם גישה יסודית להערכת ספיגת ליפוזומים ברמה התאית. טכניקה זו מספקת שיטה בלתי משוחדת להערכת הספיגה של ליפוזומים עם תווית פלואורסצנטית המוכנים באמצעות טמפרטורות נמוכות וציוד קל לרכישה. כדי להכין ליפוזומים עם תווית פלואורסצנטית עמוסים בסידן אצטט וטסגליטזר, השתמש תחילה בבדיקה של חצי אינץ' כדי לחליב תמיסת כלורופורם אתר של ליפידים על ידי סוניקציה למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, 20 קילו-הרץ ו-50% הספק.העבירו מיד את תמיסת תחליב המים והשמן ההומוגנית למאייד סיבובי עם מתאם מיוחד, מד ננומטר ושסתום ויסות לחץ וחברו את המאייד לקו ואקום. כדי להסיר את הממיסים האורגניים, הגדר את קצב הסיבוב ל-100 סיבובים לדקה ואת הוואקום ל-0.5 אטמוספרות. לאחר שג'ל נוצר ונעלם, הגדל את הוואקום ל-0.9 אטמוספרות וסנן את הפיזור המימי של הליפוזום קדימה ואחורה דרך מסנן פוליקרבונט של 200 ננומטר במכבש ליפוזום המצויד בשני מזרקים אטומים לגז מספר פעמים.לאחר אימות התפלגות הגודל על ידי פיזור אור דינמי, השתמש בעמודת ספין של שני מיליליטר כדי להסיר כל טסגליטאזר לא כלוא מהליפוזומים והשתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוז התרופה הכלואה. לאחר מכן הוסף לא יותר מ -500 מיקרוליטר של דגימת ליפוזום למיטת הג'ל היבשה. כדי לתת את הליפוזומים על ידי הזרקה רטרו-אורביטלית, לחץ בעדינות כלפי מטה על העור מעל ומתחת לעין החשופה כדי להרים את העין מעל מישור הפנים.לאחר מכן הכנס בזהירות את קצה המחט בפינה הקדמית של העין, וודא שהמחט נמצאת מתחת לכדור מבלי לגעת בו, והזריק לאט את הליפוזומים לחלל הרטרו-אורביטלי. כדי לקצור את דגימת הדם, בנקודת הסיום הניסוי המתאימה, בצע בזהירות חתך בעור בקצה הקצה הזנבי של כלוב הצלעות של העכבר וחתוך קו ישר של סנטימטר אחד כלפי מעלה לכיוון ראש החיה עד ששרירי החזה נחשפים. באתר החתך הראשוני, בצע שני חתכים קטנים בניצב לקו לכיוון הראש וחתוך בזהירות את שריר החזה בצד אחד של כלוב הצלעות באזור החשוף כדי לאפשר גישה טובה יותר לאתר החדרת המחט והדמיה שלו.הכנס את המחט בין הצלעות השלישית והרביעית תוך שמירה עליה קרוב ככל האפשר לקו המרכזי של כלוב הצלעות, ומשוך בעדינות את המזרק כדי להתחיל לאסוף דם. כאשר נאסף נפח רב ככל האפשר, העבירו את הדם לצינור מיקרו צנטריפוגה המכיל 10 מיקרוליטר של 0.5 EDTA מולארי על קרח. כדי לחלץ את כרית הרקמה המפשעתית מכל צד של העכבר, השתמש בסט אחד של מלקחיים כדי להחזיק את קרום הצפק בצד ימין ובסט השני של מלקחיים כדי להחזיק את קצה העור מעל קרום הצפק בצד השני.משוך בעדינות את העור מהממברנה כדי להפריד את השכבות זו מזו. הצמד את הקצה החיצוני של העור כדי לגשת טוב יותר למצבור השומן ואתר את מצבור רקמות השומן המפשעתי לאורך העור. ואתר את בלוטת הלימפה המפשעתית במרכז מחסן השומן באמצעות מלקחיים ומספריים כדי להסיר את בלוטת הלימפה לפי הצורך.לאחר הסרת בלוטת הלימפה, השתמש במלקחיים כדי לתפוס בזהירות את קצה מצבור השומן הקרוב ביותר לנקודה המוצמדת והתחל לבצע חתכים קטנים בקרום החיבור בין רקמת השומן לעור. הרם את רקמת השומן הרחק מהעור תוך כדי ביצוע חתכים לגישה טובה יותר לקרום, והנח את המחסן בבקבוקון פוליאתילן המכיל מאגר HEPES על קרח. כדי לחלץ את מצבורי השומן האפידידימליים מהקצה הזנבי של חלל הצפק, השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את מצבור השומן האפידידימלי הראשון מהקצה הגבי של העכבר ולאתר את האפידידימיס וכלי הדם המחוברים למחסן זה.לאחר מכן חותכים בזהירות בין מצבור השומן לאפידידימיס וכלי הדם כדי להפריד את השומן מהרקמות האחרות ולהניח את הדפו בבקבוקון פוליאתילן עם מאגר HEPES על קרח. לאחר שכל הרקמות נקצרו, השתמש בזוג אחד עד שניים של מספריים כדי לטחון את דגימות רקמת השומן לשברי רקמה של 0.5 מילימטר. לאחר מכן, הוסיפו 1.5 מיליליטר של שני מיליגרם למאגר קולגנאז לבקבוקונים של חתיכות רקמת שומן והניחו את הבקבוקונים באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-150 סיבובים לדקה למשך 30 עד 45 דקות.לאחר 30 דקות, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לשבש את הדגימות מספר פעמים. אם חלקי הרקמה עדיין גדולים מדי לפיפטינג קל, החזירו את הדגימות לחממה למשך 15 דקות נוספות. לאחר שהדגימות מתעכלות במלואן, יש לשלש את השברים 10 פעמים נוספות כדי להבטיח יצירת תרחיף תא בודד ולסנן כל דגימה דרך מסננים בודדים של 70 מיקרומטר לתוך צינור אחד של 50 מיליליטר לכל דגימה.שטפו כל קובץ עם חמישה מיליליטר של מאגר FACS כדי לאסוף את כל התאים שנותרו ולסנן כל שטיפה לתוך הבקבוקון המתאים של דגימת התא על קרח. לאחר שכל הדגימות סוננו, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה ושאבו את הסופרנטנט השומני מהדגימות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנטנטים והשאירו את כדורי שבר כלי הדם הסטרומלי שלמים, והשעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר FACS לכל צינור.לאחר מכן העבירו את המתלים לצינורות חדשים של 1.5 או 1.7 מיליליטר על קרח עד לניתוח ציטומטרי זרימה על ידי פרוטוקולים סטנדרטיים. פיזור אור דינמי חושף קוטר ליפוזום ממוצע של 163.2 ננומטר ופוטנציאל זטה של מינוס 19.2 מילי-וולט. הדמיית מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני חושפת ליפוזומים מעגליים עם סטיית תקן קטנה יחסית המתקבלת מהקוטר הממוצע כפי שנמדד על ידי פיזור אור דינמי.ניתוח זרימה ציטומטרי של דגימות מעכברים שטופלו ב-PBS יכול לשמש כפלואורסצנטיות DiD מינוס בקרה אחת שבעזרתה ניתן ליצור שערים חיוביים של DiD. כפי שמודגם בניתוח מייצג זה, ריכוז העמסת ליפוזום של 10 מיליגרם למיליליטר של DiD הוא גבוה מדי, ועולה על הטווח הניתן לכימות של הציטומטר בכל שלוש הרקמות שנבדקו. ריכוז של 0.1 מיליגרם למיליליטר מדגים אות מסוים, אך לא נצפתה אוכלוסייה ברורה מעבר לתאים שטופלו ב-PBS.לכן, ריכוז מיליגרם אחד למיליליטר, המדגים הבחנה ברורה מבקרת PBS תוך שהוא עדיין קריא על ידי המנתח, מומלץ לשימוש בהכנת ליפוזום. נדרשות אסטרטגיות שער שונות במקצת עבור כל סוג רקמה, אך ניתן לזהות את רוב סוגי התאים בכל אחד מהם. לאחר זיהוי אוכלוסיות ספציפיות מעניינות, ניתן לכמת את הגודל הכולל של כל אוכלוסיית תאים ואת התדירות שבה הם חיוביים ל-DiD.הכנת ריאגנטים וציוד וחיזוי תוצאות לכל שלב היא קריטית. תוצאות בלתי צפויות בשלב מוקדם עלולות להרוס תוצאות עתידיות. ניתן להשתמש בשיטות היסטולוגיות כדי להעריך לוקליזציה של ליפוזומים ברקמה שלמה, בעוד שניתן להשתמש בציטומטריית זרימת הדמיה כדי לאמת הפנמת ליפוזום על בסיס כל תא.

preparation-administration-assessment-vivo-tissue-specific-cellular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

חלקיקים נגיפיים צמח (VNPs) מבטיחים פלטפורמות ליישומים ביו. כאן, אנו מתארים את ההליכים להתפשטות צמח VNP, טיהור, אפיון, וbioconjugation. לבסוף, אנו מראים את היישום של VNPs לביות והדמית גידול תוך שימוש במודל עכבר xenograft ודימות פלואורסצנטי.

חלקיקים נגיפיים עבור<em&gt; בחי</em&gt; הדמית גידול

סרטון זה דן בבדיקת דליפת פלואורסצנטיות כדי לחקור את האינטראקציות של פפטידים חודרי תאים עם קרום התא באמצעות חיקויים של קרום התא – שלפוחיות חד-למלריות גדולות, או LUVs, עטופות בצבע פלואורסצנטי ומרווה (quencher).

בדיקת דליפת פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה פפטידית חודרת תאים עם ממברנה

התפלגות מרחבית ודינמיקה זמנית של חלבוני קרום פלזמה ושומנים היא נושא חם בביולוגיה. כאן נושא זה מטופל על ידי ניתוח תנודות תמונה מרחבי-זמני המספק מבחינה רעיונית את אותן כמויות פיזיקליות של מעקב אחר חלקיקים בודדים, אך הוא משתמש בתוויות מולקולריות קטנות ובהגדרות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

השימוש בפלואורופורים להדמיה in vivo יכול להיות מוגבל מאוד על ידי אופסוניזציה, פינוי מהיר, רגישות זיהוי נמוכה והשפעות ציטוטוקסיות על המארח. אנקפסולציה של פלואורופורים בליפוזומים על ידי הידרציה ואקסטרוזיה מובילה לכיבוי והגנה פלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה in vivo עם רגישות גילוי גבוהה.

הקרינה-מרווה של Fluorophore הקרוב אינפרא אדום-כמוס liposomal ככלי ל In vivo דימות אופטי

הצטברות תוך-גידולית הטרוגנית של ליפוזומים נקשרה למיקרו-סביבה לא תקינה של הגידול. כאן מוצגות שיטות למדידת מיקרו-סירקולציה של הגידול על ידי הדמיית זלוף ולחץ נוזל אינטרסטיציאלי מוגבר (IFP) באמצעות מערכת רובוטית מונחית תמונה. המדידות מושווים להצטברות תוך-גידולית של ליפוזומים, הנקבעת באמצעות הדמיית מיקרו-CT נפחית.

מדידות מרחבים של זלוף, לחצו נוזלי ביניים ו ליפוזומים צבירה בגידולים מוצקים

Ex vivo הדמיה-איבר השלם היא שיטה מהירה לקביעת הריכוזים היחסיים של תרכובות שכותרתו fluorescently בתוך ובין רקמות או קבוצות טיפול. לעומת זאת, היסטולוגיה קרינה כמוני, בעוד יותר עבודה אינטנסיבית, מאפשרת כימות של רמות הרקמות המוחלטות של מולקולות שכותרתו.

השימוש של Ex Vivo הדמיה Whole-איברים היסטולוגיה רקמות כמותי כדי לקבוע את ביו-הפצה של מולקולות שכותרתו fluorescently

ההבנה הלקויה של הביצועים in vivo של ננו-תרופות מעכבת את התרגום הקליני שלהן. נהלים להערכת ההתנהגות in vivo של ננו-תרופות לסרטן ברמה מערכתית, רקמתית, חד-תאית ותת-תאית בעכברים בעלי יכולת חיסונית נושאי גידול מתוארים כאן. גישה זו עשויה לסייע לחוקרים לזהות ננו-תרופות מבטיחות לסרטן לתרגום קליני.

נוהל מקיף כדי להעריך את<em&gt; In vivo</em&gt; ביצועים של סרטן ננו-רפואה

הדמיה לחיות תאים הוא כלי רב עוצמה כדי לחזות תהליכים דינאמיים. הבחינה של תאים קבוע מספק רק תמונות סטטיות, אשר יכול להוביל פירוש מוטעה ובלבול לגבי התהליך. עבודה זו מציגה שיטה ללמוד ספיגת התרופה שחרור, לוקליזציה תאיים של חלקיקים liposomal בתאים חיים.

שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של ליפוזומים וכיצד ניתן להשתמש בקיבוע על פני השטח ולעבור באופן אינדיבידואלי בצורה מקבילה מסיבית תוך שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבר מאפשר לכמת את הגודל והאחידות בין ליפוזומים בודדים של האוכלוסייה.

מיקרוסקופ כמותי מיקרופלואורסצנטית בודד מבוססי ליפומה שיטת הזיהוי של הומוגניות בין ליפוזומים בודדים

אנו מתארים פרוטוקולים עבור הערכת מידת התמרה על ידי תאי-חודר פפטידים ניצול מערכות הדמיה vivo ex ולאחר מכן הטבעה פרפין, ומיקרוסקופית פלורסנט קונפוקלית וקד באמצעות מיקוד הלב פפטיד כדוגמה. בפרוטוקול שלנו, בעל חיים יחיד יכול לשמש לרכישת שני סוגים של הערכת הדמיה של אותם איברים, ובכך לחתוך את מספר בעלי החיים הדרושים ללימודים על ידי חצי.

ב Vivo הדמיה של התמרה יעילות של מיקוד הלב פפטיד

אנו מציגים פרוטוקול לשימוש במיקרונדוסקופיית לייזר קונפוקלית סיבים אופטיים (CLM) כדי לחקור באופן לא פולשני את ההתפלגות המרחבית-זמנית של ליפוזומים בעין לאחר הזרקה תת-ימית.

Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים

למד הכנה וניתוח של ליפוזומים מתויגים בפלואורסצנט באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של ספיגה תאית ברקמות in vivo לפיתוח מערכות אספקת תרופות.

הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

גלה סרטונים נוספים