Name: הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: חקור שיטת סקרינג בקיבולת גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות המשפיעות על התמדה חיידקית. הפרוטוקול מסייע לחוקרים לבחון פאנלי תרופות וספריות גנים ביעילות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לחברי מעבדת אורמן על התשומות החשובות שלהם במהלך מחקר זה. מחקר זה מומן על ידי פרס המעבר לקריירה של NIH/NIAID K22AI125468 ומענק סטארט-אפ מאוניברסיטת יוסטון.

1. הכנת מדיום צמיחה, פתרון אולוקסאצין ומניות תאי E. coli
<ol><li>מדיום לוריא-ברטני רגיל (LB): הוסף 10 גרם/ליטר של טריפטון, 10 גרם/ליטר של נתרן כלורי (NaCl) ו-5 גרם/ליטר של תמצית שמרים במים שעברו דה-יון (DI). לעקר את המדיום על ידי autoclaving.</li>
	<li>צלחות אגר LB: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון, 10 גרם / L של NaCl, 5 גרם / L של תמצית שמרים ו 15 גרם / L אגר במים DI לעקר את המדיום על ידי autoclaving. בטמפרטורה הרצויה (~ 55 מעלות צלזיוס), יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר בינוני לתוך צלחות מרובעות (10 x 10 ס"מ). יבש את הצלחות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>בינוני LB שונה: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון ו 5 g / L של תמצית שמרים במים DI. לעקר את המדיום על ידי autoclaving.</li>
	<li>מדיום LB שונה כולל אוסמוליט: מערבבים מדיום LB שונה 2x עם פתרון osmolyte 2x בכמויות שוות. כדי להכין 2x שונה LB בינוני, להוסיף 20 גרם / ליטר של טריפטון ו 10 g / L של תמצית שמרים במים DI לעקר על ידי autoclaving. כדי להכין את הפתרון osmolyte 2x, להמיס את osmolyte של עניין (כמות 2x) במים DI, ולאחר מכן לסנן לעקר את הפתרון. הערה: ניתן לקבוע את אוסמוליט העניין וריכוזיו ממאמרי ההקרנה של פנוטיפ מיקרו-ארי (ראה פרוטוקול 4). עם זאת, osmolyte נבדק ואת הריכוז 2x הקשורים ניתן להתאים בהתאם לאופי המחקר. לדוגמה, כדי ללמוד את ההשפעה של 1 mM נתרן כלורי, פתרון osmolyte 2x יהיה פתרון נתרן כלורי 2m.</li>
	<li>פתרון מלאי Ofloxacin (5 מ"ג / מ"ל): להוסיף 5 מ"ג של מלח ofloxacin (OFX) ב 1 מ"ל של מים DI. הוסף 10 μL של 10 M נתרן הידרוקסידי כדי להגדיל את המסיסות של OFX במים, ולאחר מכן לסנן לעקר את הפתרון. הכינו aliquots ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: Ofloxacin היא אנטיביוטיקה quinolone כי כבר בשימוש נרחב עבור תאים חיידקיים גדל ולא גדל14,21. הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של OFX לתאי E. coli MG1655 נמצא בטווח של 0.039-0.078 מיקרוגרם / מ"ל19,20. כמו כן שים לב כי אנטיביוטיקה אחרים כגון אמפיצילין ו kanamycin משמשים בדרך כלל במחקר מתמיד. הבחירה באנטיביוטיקה תלויה באופי המחקר.</li>
	<li>
אי קולי מניות תא MG1655: לחסן 2 מ"ל של מדיום LB רגיל עם מושבה אחת במבחנה 14 מ"ל (snap-capped) ותרבות התאים בשייקר מסלולית ב 250 סל"ד ו 37 °C (67 °F). כאשר התאים מגיעים לשלב הנייח, מערבבים 500 μL של תרבות התא עם 500 μL של 50% גליצרול (סטרילי) בבקבוקון קריוגני ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>2. הפצת תאים כדי לחסל מתמידים קיימים
<ol><li>כדי להכין תרבות לילה, לגרד כמות קטנה של תאים ממלאי תא קפוא עם קצה פיפטה סטרילי (לא להפשיר את מלאי תא גליצרול), ולחסן את התאים ב 2 מ"ל של מדיום LB שונה במבחנה 14 מ"ל snap-capped. תרבות התאים בשייקר מסלולית ב 250 סל"ד ו 37 °C (69 °F) עבור 12 שעות.</li>
	<li>הפצה ראשונה<ol>
<li>לאחר 12 שעות, להעביר 250 μL של תרבות הלילה ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל מכוסה רדיד אלומיניום סטרילי.</li>
		<li>הגדל את תרבית התאים בשייקר מסלולי במהירות של 250 סל"ד ו- 37 °C (600 סל"ד) עד שהתאים יגיעו לשלב המעריכי האמצעי (OD600 = 0.5).</li>
		<li>למדוד את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) באמצעות קורא microplate כל 30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפצה שנייה<ol>
<li>ב OD600 = 0.5, לדלל 250 μL של תרבות התא מן הבקבוק הראשון לתוך 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.</li>
		<li>הגדל את תרבות התאים השנייה בשייקר מסלולי במהירות של 250 סל"ד ו- 37 °C (600 אובדנית) עדOD 600=0.5.</li>
		<li>למדוד את הצפיפות האופטית כל 30 דקות. הערה: תרבות לילה עשויה להיות כמות משמעותית של תאים מתמידים4,5,22. שיטת מחזור דילול / צמיחה5 המתואר לעיל ניתן להשתמש כדי לחסל אלה מתמידים קיימים לפני העברת התאים microarrays. ניתן לאמת את חיסולם על ידי כימות רמות מתמשכות של תרבויות לילה עם ההסתעפות המתוארת בפרוטוקול 3. שיטה זו כבר אומתה במחקר קודם19.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. אימות חיסול של תאים מתמידים קיימים
<ol><li>לאחר ההפצה השנייה (ראה שלב 2.3), לדלל 250 μL של תרבות התא (OD600 = 0.5) ב 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל. הערה: עבור פקדים, לדלל 250 μL של תרבות הלילה (ראה שלב 2.1) ב 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל. לפני העברת התאים לבקבוקון, יש להתאים את צפיפות התאים של תרבות הלילה במדיום LB שונה טרי כדי להשיג OD600 = 0.5.</li>
	<li>הוסף 25 μL של פתרון מניית OFX (5 מ"ג / מ"ל) לתוך ההשעיה התא ולנער את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבות התספורת הומוגנית. הריכוז הסופי של OFX הוא 5 מיקרוגרם / מ"ל בתרבות ההסתעפות.</li>
	<li>דגירה את תרבות מבחני במסלול שייקר ב 250 סל"ד ו 37 °C (69 °F).</li>
	<li>בכל שעה במהלך הטיפול (כולל 0 שעות, נקודת הזמן לפני הוספת OFX לתרבות ההסתעפות), להעביר 1 מ"ל של תרבות ההסתעפות מהבקבוק לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה תרבות ההסתעפות בצינור microcentrifuge ב 17,000 x g במשך 3 דקות.</li>
	<li>בזהירות להסיר 950 μL של supernatant מבלי להפריע גלולה התא.</li>
	<li>הוסף 950 μL של תמיסת מלח אגירה פוספט (PBS) לתוך הצינור microcentrifuge.</li>
	<li>חזור על שלבי הכביסה 3.5-3.7 עבור 3x בסך הכל עד ריכוז אנטיביוטי הוא מתחת לריכוז המעכב המינימלי (MIC).</li>
	<li>לאחר הכביסה הסופית, resuspend גלולת התא ב 100 μL של פתרון PBS, וכתוצאה מכך מדגם מרוכז 10x.</li>
	<li>קח 10 μL של השעיית התא באופן סדרתי לדלל שש פעמים ב 90 μL של פתרון PBS באמצעות צלחת 96 גם עגול התחתון.</li>
	<li>ספוט 10 μL של השעיות תא מדולל על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את מגבלת הגילוי, צלחת 90 μL הנותרים של השעיית תא על צלחת אגר טרי.</li>
	<li>דגירה צלחות אגר ב 37 °C (60 °F) עבור 16 שעות, ולאחר מכן לספור את יחידות יוצרות המושבה (CFUs). חשבון עבור שיעורי הדילול בעת חישוב המספר הכולל של CFUs ב 1 מ"ל של תרבות assay. עקומות להרוג נוצרים על ידי התוויית ערכי CFU לוגריתמי ביחס למשך הטיפול האנטיביוטי. הערה: טיפול OFX 6 שעות מספיק כדי להשיג עקומת להרוג biphasic עבור E. coli תאים19,20. הרמה המתמשכת של תאים מופצים (כפי שנמדד על ידי ספירת CFU ב 6 שעות) צריך להיות נמוך משמעותית מזה של תרבות הלילה. ניתן לבצע את ההליכים המתוארים בפרוטוקול 2 ו- 3 עם LB רגיל בהתאם לעיצוב המחקר.</li>
</ol>4. הקרנות צלחת Microarray 
<ol><li>הכנת תרביות מיקרו-תאיות<ol>
<li>העבר 250 μL של תאים אקספוננציאליים פאזה ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מערבבים בעדינות את השעיית התא כדי להפוך אותו הומוגני. הערה: תאי השלב המעריכי (OD600 = 0.5) מתקבלים משלב ההפצה השני (ראה שלב 2.3).</li>
		<li>להעביר את המתלה תא מדולל לתוך מאגר סטרילי 50 מ"ל.</li>
		<li>באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 μL של השעיית התא לכל באר של microarray, כלומר, צלחת 96 גם המכיל osmolytes שונים. הערה: בארות שאין להן אוסמוליטים משמשות כפקדים.</li>
		<li>כסו את המיקרו-ראי בקרום איטום חדיר לגז.</li>
		<li>דגירה את הצלחת בשייקר מסלולי ב 37 °C (69 °F) ו 250 סל"ד עבור 24 שעות. הערה: בניסויים אלה נעשה שימוש בלוחות מסחריים זמינים, כגון Phenotype Microarrays (PM-9 ו- PM-10) הכוללים מגוון רחב של אוסמוליטים, מאגרי pH וכימיקלים אחרים במצב מיובש בריכוזים שונים. microarrays אלה נמצאים במחצית שטח 96 פורמטים צלחת היטב. יש להתאים את נפחי התרבות בהתאם לסוג הלוחות הנמצאים בשימוש. Microarrays יכול גם להיווצר באופן ידני (ראה להלן).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנה ידנית של צלחות מיקרו-ראי<ol>
<li>העבר 75 μL של פתרונות osmolyte 2x לתוך בארות של חצי שטח 96 צלחת היטב.</li>
		<li>העבר 500 μL של תאים אקספוננציאליים פאזה ל 25 מ"ל של 2x שונה LB בינוני בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל. מערבבים בעדינות את השעיית התא כדי להפוך אותו הומוגני. הערה: קצב החיסון הותאם כך שיהיה עקבי עם פרוטוקול המיון של המיקרו-קרינה המתואר ב- 4.1.</li>
		<li>הוסף 75 μL של השעיית התא לתוך כל באר של חצי אזור 96 צלחת היטב המכילה פתרונות osmolyte 2x.</li>
		<li>דגירה את הצלחת בשייקר מסלולי ב 37 °C (69 °F) ו 250 סל"ד עבור 24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת לוחות מבחנים מתמידים<ol>
<li>הכן 25 מ"ל של מדיום LB שונה המכיל 5 מיקרוגרם / מ"ל של OFX בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל ולהעביר מדיום זה למאגר סטרילי.</li>
		<li>העבר 190 μL של מדיום LB שונה עם OFX מהמאגר לתוך כל באר של צלחת גנרית שטוחה תחתון 96 היטב (צלחת מתמיד-assay) באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
		<li>הסר את microarray מן שייקר (לאחר culturing עבור 24 שעות) ולהעביר 10 μL של תרביות התא מן microarray אל בארות של צלחת מתמיד-assay, המכיל מדיום LB שונה עם OFX.</li>
		<li>קח 10 μL של השעיות תאים מלוח ההשעיה-assay באופן סדרתי לדלל שלוש פעמים ב 290 μL של פתרון PBS באמצעות צלחת עגולה למטה 96 גם פיפטה רב ערוצית.</li>
		<li>בעקבות הדילול הסדרתי, ספוט 10 μL של כל השעיות תאים בדילול סדרתי על צלחות אגר טרי ללא אנטיביוטיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית.</li>
		<li>דגירה צלחת מתמיד-assay (מוכן בשלב 4.3.3) בשייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד עבור 6 שעות לאחר כיסוי הצלחת עם קרום איטום חדיר גז.</li>
		<li>לאחר 6 שעות דגירה בשייקר, לקחת את צלחת מתמיד-assay החוצה ולחזור על השלבים 4.3.4-4.3.5.</li>
		<li>דגירה צלחות אגר עבור 16 שעות ב 37 °C (69 °F), ולאחר מכן לספור CFUs. רמות CFU לפני ו 6 שעות לאחר הטיפול האנטיביוטי לאפשר לחשב את השבר מתמיד בכל באר. CFU נחשב לפני הטיפול OFX גם לעזור להעריך את ההשפעות של osmolytes ועל הכדאיות E. coli.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אימות התנאים שזוהו
<ol><li>העבר 250 μL של תאי פאזה מעריכיים משלב 2.3 עד 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי המכיל את osmolyte מזוהה מן ההקרנה microarray (ראה פרוטוקול 4).</li>
	<li>דגירה הבקבוק בשייקר מסלולית ב 250 סל"ד ו 37 °C (69 °F) עבור 24 שעות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, להסיר את הבקבוק מן שייקר ולהעביר 250 μL של תרבות התא ל 25 מ"ל של מדיום LB שונה טרי בבקבוק 250 מ"ל מבולבל.</li>
	<li>הוסף 25 μL של פתרון מניית OFX (5 מ"ג / מ"ל) בהשעיית התא ולנער את הבקבוק בעדינות כדי להפוך את תרבות התספורת הומוגנית. דגירה את הבקבוק בשייקר ב 37 °C (60 °F) ו 250 סל"ד.</li>
	<li>בכל שעה במהלך הטיפול, להעביר 1 מ"ל של תרבות התסעפות מן הבקבוק לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה תרבות ההסתעפות בצינור microcentrifuge ב 17,000 x g במשך 3 דקות.</li>
	<li>הסר 950 μL של supernatant ולהוסיף 950 μL של PBS.</li>
	<li>חזור על שלבי הכביסה 5.6 ו- 5.7 עבור 3x.</li>
	<li>לאחר הכביסה הסופית, resuspend גלולת התא ב 100 μL של פתרון PBS.</li>
	<li>קח 10 μL של השעיית התא באופן סדרתי לדלל 6x ב 90 μL של פתרון PBS באמצעות צלחת 96 גם עגול התחתון.</li>
	<li>ספוט 10 μL של השעיות תא מדולל על צלחת אגר טרי ללא אנטיביוטיקה. כדי להגדיל את מגבלת הגילוי, צלחת 90 μL הנותרים של השעיית תא על צלחת אגר טרי.</li>
	<li>דגירה צלחת אגר ב 37 °C (60 °F) עבור 16 שעות, ולאחר מכן לספור CFUs.</li>
</ol>

<ol><li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells%2C+dormancy+and+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Persister cells, dormancy and infectious disease.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (1), 48-56 (2007).</li>
<li>Hobby, G. L., Meyer, K., Chaffee, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+Mechanism+of+Action+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Observations on the Mechanism of Action of Penicillin.</a> Experimental Biology and Medicine. 50 (2), 281-285 (1942).</li>
<li>Bigger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+staphylococcal+infections+with+penicillin+by+intermittent+sterilisation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Treatment of staphylococcal infections with penicillin by intermittent sterilisation.</a> The Lancet. 244 (6320), 497-500 (1944).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Keren, I., Kaldalu, N., Spoering, A., Wang, Y., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+cells+and+tolerance+to+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Persister cells and tolerance to antimicrobials.</a> FEMS Microbiology Letters. 230 (1), 13-18 (2004).</li>
<li>Keren, I., Minami, S., Rubin, E., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+transcriptome+analysis+of+mycobacterium+tuberculosis+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Characterization and transcriptome analysis of mycobacterium tuberculosis persisters.</a> mBio. 2 (3), (2011).</li>
<li>Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Pseudomonas+aeruginosa+Strains+Producing+High+Levels+of+Persister+Cells+in+Patients+with+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Emergence of Pseudomonas aeruginosa Strains Producing High Levels of Persister Cells in Patients with Cystic Fibrosis.</a> Journal of Bacteriology. 192 (23), 6191-6199 (2010).</li>
<li>LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilms+produce+antifungal-tolerant+persister+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3839-3846 (2006).</li>
<li>Allison, K. R., Brynildsen, M. P., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite-enabled+eradication+of+bacterial+persisters+by+aminoglycosides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolite-enabled eradication of bacterial persisters by aminoglycosides.</a> Nature. 473 (7346), 216-220 (2011).</li>
<li>Lechner, S., Lewis, K., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+persisters+tolerant+to+bactericidal+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus persisters tolerant to bactericidal antibiotics.</a> Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 22 (4), 235-244 (2012).</li>
<li>Barrett, T. C., Mok, W. W. K., Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antibiotic+resistance+development+from+fluoroquinolone+persisters+after+a+single+exposure+to+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced antibiotic resistance development from fluoroquinolone persisters after a single exposure to antibiotic.</a> Nature Communications. 10 (1), 1177(2019).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+promotes+the+evolution+of+antibiotic+resistance+by+increasing+survival+and+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence promotes the evolution of antibiotic resistance by increasing survival and mutation rates.</a> ISME Journal. 13 (5), 1239-1251 (2019).</li>
<li>Dörr, T., Lewis, K., Vulić, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOS+response+induces+persistence+to+fluoroquinolones+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">SOS response induces persistence to fluoroquinolones in Escherichia coli.</a> PLoS Genetics. 5 (12), 1000760(2009).</li>
<li>Völzing, K. G., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary-phase+persisters+to+ofloxacin+sustain+DNA+damage+and+require+repair+systems+only+during+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stationary-phase persisters to ofloxacin sustain DNA damage and require repair systems only during recovery.</a> mBio. 6 (5), (2015).</li>
<li>Grant, S. S., Kaufmann, B. B., Chand, N. S., Haseley, N., Hung, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+bacterial+persisters+with+antibiotic-generated+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Eradication of bacterial persisters with antibiotic-generated hydroxyl radicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (30), 12147-12152 (2012).</li>
<li>Gerdes, K., Maisonneuve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Persistence+and+Toxin-Antitoxin+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial Persistence and Toxin-Antitoxin Loci.</a> Annual Review of Microbiology. 66 (1), 103-123 (2012).</li>
<li>Orman, M. A., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+stationary+phase+respiration+impairs+persister+formation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Inhibition of stationary phase respiration impairs persister formation in E. coli.</a> Nature Communications. 6 (1), 7983(2015).</li>
<li>Korch, S. B., Henderson, T. A., Hill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+hipA7+allele+of+Escherichia+coli+and+evidence+that+high+persistence+is+governed+by+%28p%29ppGpp+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the hipA7 allele of Escherichia coli and evidence that high persistence is governed by (p)ppGpp synthesis.</a> Molecular Microbiology. 50 (4), 1199-1213 (2003).</li>
<li>Karki, P., Mohiuddin, S. G., Kavousi, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+effects+of+osmolytes+and+environmental+ph+on+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Investigating the effects of osmolytes and environmental ph on bacterial persisters.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (5), 02393(2020).</li>
<li>Mohiuddin, S. G., Hoang, T., Saba, A., Karki, P., Orman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+Metabolic+Inhibitors+to+Reduce+Bacterial+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identifying Metabolic Inhibitors to Reduce Bacterial Persistence.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 472(2020).</li>
<li>Brooun, A., Liu, S., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dose-response+study+of+antibiotic+resistance+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 44 (3), 640-646 (2000).</li>
<li>Luidalepp, H., Jõers, A., Kaldalu, N., Tenson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+of+inoculum+strongly+influences+persister+frequency+and+can+mask+effects+of+mutations+implicated+in+altered+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Age of inoculum strongly influences persister frequency and can mask effects of mutations implicated in altered persistence.</a> Journal of Bacteriology. 193 (14), 3598-3605 (2011).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+The+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: The Keio collection.</a> Molecular Systems Biology. 2, 0008(2006).</li>
<li>Zaslaver, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+library+of+fluorescent+transcriptional+reporters+for+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive library of fluorescent transcriptional reporters for Escherichia coli.</a> Nature Methods. 3 (8), 623-628 (2006).</li>
<li>Hajmeer, M., Ceylan, E., Marsden, J. L., Fung, D. Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sodium+chloride+on+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Staphylococcus+aureus+analysed+using+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of sodium chloride on Escherichia coli O157:H7 and Staphylococcus aureus analysed using transmission electron microscopy.</a> Food Microbiology. 23 (5), 446-452 (2006).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

תפוקה גבוהה מתמיד assay המתואר כאן פותחה כדי להבהיר את ההשפעות של כימיקלים שונים על התמדה E. coli. בנוסף ללוחות PM מסחריים, microarrays ניתן לבנות באופן ידני כמתואר בשלב 4.2. יתר על כן, הפרוטוקול המוצג כאן הוא גמיש והוא יכול לשמש כדי לסנן microarrays אחרים, כגון לוחות סמים וספריות תאים, כי הם 96 פורמטים צלחת היטב. ניתן להתאים את התנאים הניסיוניים הכוללים את שלב הגדילה, קצב החיסון והבינוני לבדיקת ספריות אלה. לדוגמה, אם אחד רוצה להקרין ספריית תאים, כגון Keio E. coli אוסף נוקאאוט23,...

תרביות חיידקים מכילות תת-אוכלוסיות קטנות של תאים מתמידים הסובלניים באופן זמני לרמות גבוהות במיוחד של אנטיביוטיקה. תאים מתמידים זהים גנטית לקינס הרגישים לאנטיביוטיקה שלהם, והישרדותם יוחסה לעיכוב גדילה חולף1. תאים מתמידים התגלו לראשונה על ידי גלדיסתחביב 2 אבל המונח שימש לראשונה על ידי ג'וזף ביגר כאשר הוא זיהה אותם בתרבויות פיוגנס סטפילוקוקוס שטופלו פניצילין3. מחקר מכונן שפורסם על ידי Balaban et al.4 גילה שני סוגים מתמידים: גרסאות מסוג I הנוצרות בעיקר על ידי מעבר דרך השלב הנייח, וגרסאות סוג II הנוצרות ברציפות במהלך הצמיחה המעריכית. מתמידים מזוהים על ידי מבחני הישרדות קלונוגניים, שבהם דגימות תרבות נלקחות במרווחי זמן שונים במהלך טיפולים אנטיביוטיים, שטופים, מצופים על מדיום צמיחה טיפוסי לספור את התאים ששרדו שיכולים להתיישב בהעדר אנטיביוטיקה. קיומם של מתמידים בתרבית התא מוערך על ידי עקומת להרוג biphasic4,5 שבו הריקבון המעריכי הראשוני מציין את מותם של תאים רגישים לאנטיביוטיקה. עם זאת, מגמת ההרג פוחתת עם הזמן, ובסופו של דבר מובילה לאזור מישור המייצג את התאים המתמשכים ששרדו.
תאים מתמידים קושרו עם מחלות שונות כגון שחפת6, סיסטיק פיברוזיס7, קנדידה8 ודלקות בדרכי השתן9. כמעט כל המיקרואורגניזמים שנבדקו עד כה נמצאו כדי ליצור פנוטיפים מתמידים, כולל שחפת מיקובקטריוםפתוגנית מאוד6, סטפילוקוקוס אוראוס10, פסאודומונס aeruginosa7 ו קנדידה אלביקנס8. מחקרים אחרונים מספקים גם ראיות לעלייתם של מוטנטים עמידים multidrug מתת-אוכלוסיות מתמידות11,12. מאמצים ניכרים בתחום זה גילו כי מנגנוני ההתמדה מורכבים ומגוונים ביותר; הן גורמים סטוכסטיים ודטרמיניסטיים הקשורים לתגובת SOS13,14, מיני חמצן תגובתי (ROS)15, מערכות רעלן/אנטיטוקסין (ת"א)16, אוטופגיה או עיכול עצמי17 ותגובה מחמירה הקשורה ל- ppGpp18 ידועים כמקלים על היווצרות מתמשכת.
למרות התקדמות משמעותית בהבנת פנוטיפ ההתמדה, ההשפעות של אוסמוליטים על התמדה חיידקית לא הובנו במלואן. מאז השמירה על לחץ אוסמוטי אופטימלי הוא הכרח לצמיחה של התאים, תפקוד תקין והישרדות, מחקר מעמיק של osmolytes יכול להוביל מטרות פוטנציאליות עבור אסטרטגיות אנטי מתמיד. למרות מייגע, סינון תפוקה גבוהה היא גישה יעילה מאוד לזיהוי מטבוליטים וכימיקלים אחרים הממלאים תפקיד מכריע בפנוטיפ התמדה19,20. בעבודה זו, נדון בשיטה שפורסמהשלנו 19, שם השתמשנו microarrays, כלומר, 96 לוחות באר המכילים osmolytes שונים (למשל, נתרן כלורי, אוריאה, נתרן חנקתי, נתרן חנקתי, אשלגן כלורי), כדי לזהות osmolytes המשפיעים באופן משמעותי E. coli התמדה.

<table><tbody><tr><td>מבחנה 14 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>זן E. coli MG1655</td> אוניברסיטת <td></td><td>פרינסטון</td><td>מושג ממעבדת Brynildsen</td></tr><tr><td>צלחת שטוחה עם 96 בארות</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>5665-5161</td><td></td></tr><tr><td>קרום איטום חדיר גז</td><td>VWR</td><td>102097-058</td><td>מעוקר על ידי קרינת גמא וללא ציטוטוקסינים</td></tr> חצי <tr><td>אזור צלחת שטוחה עם תחתית 96 בארות</td><td>VWR</td><td>82050-062</td><td></td></tr><tr><td>LB אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1425-2</td><td>גנטיקה מולקולרית בדרגה</td></tr><tr><td>מלח אופלוקסצין</td><td>VWR</td><td>103466-232</td><td>HPLC &ge; 97.5</td></tr><tr><td>מיקרו-מערך פנוטייפ (PM-9 ו-PM-10)</td> צלחות <td>ביולוג</td><td>N/A</td><td>PM-9 ו-PM-10 הכילו אוסמוליטים ומאגרים שונים בהתאמה</td></tr><tr><td>צלחת 96 בארות עגולה תחתונה</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>5665-0161</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S271-500</td><td>נתרן חנקתי מוסמך ACS בדרגת ACS</td></tr><tr><td></td><td></td><td>AC424345000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ניטריט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>AAA186680B</td><td>98% טוהר</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מרובעת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1421-500</td><td>גנטיקה מולקולרית בדרגה</td></tr><tr><td>Varioskan lux multi mode microplate reader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>VLBL00D0</td><td>משמש למדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1422-100</td><td>כיתה גנטיקה מולקולרית</td></tr></tbody></table>

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

מתמידי חיידקים מוגדרים כתת-אוכלוסיות קטנות של גרסאות פנוטיפיות עם היכולת לסבול ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה. הם דאגה בריאותית חשובה כפי שהם קושרו עם זיהומים כרוניים חוזרים ונשנים. למרות הדינמיקה סטוכסטי ודטרמיניסטי של מנגנונים הקשורים ללחץ ידועים לשחק תפקיד משמעותי בהתמדה, מנגנונים שבבסיס המעבר פנוטיפי אל / ממצב ההתמדה אינם מובנים לחלוטין. בעוד גורמי התמדה המופעלים על ידי אותות סביבתיים (למשל, דלדול של מקורות פחמן, חנקן וחמצן) נחקרו בהרחבה, ההשפעות של osmolytes על התמדה עדיין לא נקבעו. באמצעות microarrays (כלומר, 96 לוחות באר המכילים כימיקלים שונים), עיצבנו גישה כדי להבהיר את ההשפעות של osmolytes שונים על Escherichia coli התמדה באופן תפוקה גבוהה. גישה זו היא טרנספורמטיבית כפי שהוא יכול להיות מותאם בקלות עבור מערכי הקרנה אחרים, כגון לוחות סמים וספריות נוקאאוט גנים.

איור 1 מתאר את הפרוטוקול הניסיוני שלנו. ניסויי מחזור הדילול/צמיחה (ראו פרוטוקול 2) הותאמו ממחקר שערכה קרן ואח'5 כדי לחסל את המתמידים שמקורם בתרבויות הלילה. איור 2A הוא תמונה מייצגת של לוחות אגר המשמשים לקביעת רמות CFU של תרביות תאים לפני ואחרי טיפול OFX. בניסויים אלה, תאים היו תרבית במדיום LB שונה עם osmolytes במחצית שטח 96 לוחות באר כמתואר בשלב 4.2. לאחר דגירה של הצלחת בשייקר מסלולי במשך 24 שעות, ההסתעפות המתמשכת בוצעה באמצעות צלחת גנרית...

בנייר שיטה זה, אנו מציגים אסטרטגיית סינון בתפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות, כגון אוסמוליטים, שיש להן השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לזהות תנאים שיכולים להשפיע באופן משמעותי על התמדה חיידקית באופן בעל תפוקה גבוהה. שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למסך בתחומים שונים, כגון לוחות תרופות, ספריות גנים ועוד. מכיוון שהשיטה כוללת צעדי משנה שונים, שאמורים להתבצע בו זמנית, הדגמה חזותית יכולה לסייע לחוקרים לנהל את העיתוי שלהם כדי להשיג תוצאות מדויקות.התחל על ידי הכנת תרביות תא microarray. העבר 250 מיקרוליטרים של תאי פאזה אקספוננציאליים ל-25 מיליליטר של מדיום LB שונה טרי בצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר. ואז בעדינות לערבב את ההשעיה התא כדי להפוך אותו הומוגני.להעביר את השעיית התא מדולל לתוך מאגר סטרילי 50 מיליליטר. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 150 microliters של השעיית התא לכל באר של צלחת microarray המכיל כימיקלים שונים. Microarrays יכול גם להיווצר באופן ידני בעקבות השיטה המתוארת בכתב היד טקסט.מכסים את לוחית המיקרו-ראי בקרום תקרה חדיר לגז ומדגרים אותו בשייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס וב-250 סל"ד למשך 24 שעות. כדי להפוך את לוחות ההסמכה מתמיד, להכין 25 מיליליטר של מדיום LB שונה המכיל חמישה מיקרוגרם למיליליטר של Ofloxacin בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר ולהעביר את המדיום הזה למאגר סטרילי. העבר 190 מיקרוליטרים של מדיום LB שונה לתוך כל באר של צלחת שטוחה גנרית 96 היטב.לאחר הדגירה 24 שעות ביממה, להסיר את microarr

high-throughput-screening-chemical-compounds-to-elucidate-their

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Venkateswaran, S., et al. זיהוי תפוקה גבוהה של פולימרים דוחי חיידקים עבור מכשירים רפואיים. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים שיטה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי פולימרים דוחי חיידקים באמצעות שקופית מיקרו-מערך החשופה לתרביות חיידקים מעורבות. קשירת חיידקים מוערכת על ידי פלואורסצנטיות DAPI, כאשר אות מופחת מצביע על פולימרים עם חיבור מינימלי של פני השטח.

זיהוי תפוקה גבוהה של פולימרים דוחי חיידקים באמצעות סינון מיקרו-מערך

בסרטון זה אנו מדגימים שיטה להערכת ההשפעה של אוסמוליטים על היווצרות חיידקים מתמידים. תאי החיידק נחשפים תחילה לאוסמוליטים כדי לגרום לעקה אוסמוטית, מה שמעורר היווצרות מתמשכת, ולאחר מכן מטופלים באנטיביוטיקה כדי למנות את המתמידים.

In Vitro Persister Assay: שיטה להערכת ההשפעה של אוסמוליטים על התמדה חיידקית

כאן אנו מתארים בדיקת גן מדווח מבוססת תאים ככלי רב ערך לסינון ספריות כימיות עבור תרכובות המווסתות מנגנוני בקרה פוסט-שעתוק המופעלים באמצעות 3' UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

מאמר זה מתאר את assay התפוקה גבוהה כי כבר נקבע בהצלחה למסך ספריות גדולות של מולקולות קטנות עבור היכולת הפוטנציאלית שלהם לתפעל רמות סלולריות של di-GMP המחזורי Pseudomonas aeruginosa, מתן כלי רב עצמה חדש לגילוי סמים אנטיבקטריאלי ובדיקה מתחמת.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

ה-charcoal agar resazurin assay (CARA) היא שיטה כמותית למחצה, תפוקה בינונית להערכת הפעילות של סוכני בדיקה כנגד מיקובקטריות המשכפלות, אינן משתכפלות או שניהם.  ה-CARA מאפשר הערכה מהירה של פעילות תלוית זמן וריכוז ומזהה פרמטרים שיש לעקוב אחריהם על ידי מבחני יחידת יצירת מושבה (CFU).

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

כאן נתאר פרוטוקול הוא מתאקלם מהר, כל מחשב מארח, כלי סינון גבוהה-תוכן יכול להיות מנוצל כדי ללמוד אינטראקציות פתוגן-פונדקאי ולשמש לצורך גילוי תרופות.

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

האינטראקציה עם התרבות המשותף המוצגת בפרוטוקול זה היא זולה, תפוקה גבוהה ופשוטה. ניתן להשתמש בתנאים אלה כדי להתבונן באינטראקציות מיקרוביאלית בתרבות המשותף, לזהות דפוסי אינטראקציה, ולאפיין את הפוטנציאל המעונה של מאמץ מחיידקים של התעניינות במחלות אנושיות וסביבתיות.

התפוקה הגבוהה-שיתוף תרבות החברה לחקירת אינטראקציות מחיידקים

התמדה אנטיביוטית מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית רגישה לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישות לאפיון פנוטיפ ההתמדה האנטיביוטית ברמה המולקולרית והתאית לאחר חשיפת Escherichia coli למינונים קטלניים של אופלוקסצין.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

חקור שיטת סקרינג בקיבולת גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות המשפיעות על התמדה חיידקית. הפרוטוקול מסייע לחוקרים לבחון פאנלי תרופות וספריות גנים ביעילות.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

גלה סרטונים נוספים