נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

BMECs שנוצרו מ-iPSC מספקים מודלים ניסיוניים חדשים לחקר תפקוד ותפקוד לקוי של מחסום הדם-מוח. השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לבחון אם BMECs שומרים על תכונות המחסום שלהם לאחר הרחבה ושימור בהקפאה. טכניקה זו מאפשרת יצירת BMECs ספציפיים למחלה מחולים עם הפרעות שבהן הפרעה במחסום הדם-מוח ממלאת תפקיד בפתופיזיולוגיה של המחלה.

כדי לגרום להתמיינות BMEC מ-iPSCs אנושיים, שטפו את תרבית ה-iPSC המשולבת עם DPBS פעם אחת לפני הדגירה של התאים בנפח המתאים של EDTA אנזימטי למשך כחמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר הושג תרחיף תא בודד, אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בנפח מתאים של מדיום תאי גזע בתוספת מעכב ROCK 10 מיקרו-מולרי לספירה. לדלל את התאים ל-1.56 כפול 10 לרביעי תאים לריכוז סנטימטר מעוקב ולזרוע שני מיליליטר תאים לבארות בודדות בתחתית שטוחה של שש בארות.

לאחר 24 שעות בחממת תרבית התאים, החלף את הסופרנטנט בכל באר במדיום E6 והחזיר את הצלחת לחממה למשך ארבעה ימים נוספים. כדי לטהר את ה-BMECs שמקורם ב-iPSC, יש לצפות את לוחות התת-תרבית בנפח המתאים של תמיסת קולגן IV ופיברונקטין שהוכנה לאחרונה לכל באר ולדגור את הצלחות למשך שעתיים לפחות ב-37 מעלות צלזיוס. ביום השישי של ההתמיינות אספו את התאים על ידי צנטריפוגה והשעו את הכדורים בנפח המתאים של מדיום טרי ללא סרום אנדותל אנושי בתוספת B27, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי וחומצה רטינואית.

לניתוח TEER, צלח את התאים הממוינים לכל באר של צלחת מסוננת 12 מצופה קולגן ופיברונקטין. לניתוח פעילות טרנספורטר שטף, צלח את התאים לכל באר של צלחת תחתונה שטוחה מצופה קולגן ופיברונקטין עם 24 בארות. לאחר 24 שעות של תת-תרבית, החלף את הסופרנטנט בכל באר במדיום טרי ללא סרום אנדותל אנושי בתוספת תוסף B27 בלבד.

כדי למדוד את תכונות מחסום הדם המוח של ה-BMECs באמצעות TEER, טען את מכשיר ה-TEER למשך הלילה ונגב קלות את המכשיר ואת אלקטרודות האכילה עם 70% אתנול לפני הכנסתם למכסה המנוע. הפעל את הכוח וכיול את מד האוהם בהתאם למפרט היצרן. חבר את האלקטרודות ושטוף אותן פעם אחת עם 70% אתנול ופעם אחת עם DPBS.

הנח את הקצה הקצר יותר של האלקטרודה בתא הלא טיפוסי של התוסף ואת הקצה הארוך יותר לתוך החדר הבסיסי של באר ריקה. לאחר מדידת תגובת הבקרה השלילית, שטפו במהירות את האלקטרודות כפי שהודגם ומדדו את באר הניסוי הראשונה. לאחר רישום כל המדידות יש לשטוף שוב את האלקטרודות של מקלות האכילה, לנגב בעדינות את האלקטרודות ולתת להן להתייבש באוויר במכסה המנוע.

כדי להעריך את פעילות טרנספורטר הפליטה של התאים, ביום השמיני לתרבית יש לטפל במספר המתאים של בארות בתמיסת מעכב טרנספורטר פליטה של 10 מיקרו-מולרי ולהניח באינקובטור למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לטפל בתאים בתמיסת מצע של 10 מיקרו-מולרי למשך שעה בחממה. בתום הדגירה יש לשטוף כל באר פעמיים עם 500 מיקרוליטר DPBS לבאר לפני ליסת התאים עם 500 מיקרוליטר DPBS בתוספת 5% Triton-X לבאר.

לאחר חמש דקות, השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את הקרינה של התאים הליזים בעירור של 485 ננומטר ופליטה של 530 ננומטר. עבור בארות שאינן משמשות בבדיקת הטרנספורטר, שטפו את התאים פעמיים עם DPBS לפני קיבוע עם 4% פרפורמלדהיד לכל כימות גרעיני תא. לאחר יום אחד של תרבית בתווך E6, המורפולוגיה של התא דומה לזו של iPSCs.

ביום הרביעי, התאים נבדלים באופן ניכר מ-iPSCs ומכסים את רוב הבאר. יומיים של תרבית במדיום נטול סרום אנדותל אנושי גורמים למראה מוארך ומרוצף בתאים. ביום השמיני, תאים בודדים יוצרים תבנית מרוצפת גדולה ברובה.

ניתן לבצע בדיקת הנבטה כדי להדגים את הפוטנציאל האנגיוגני של BMECs שמקורם ב-iPSC. זה מוביל להתפתחות מבנים דמויי צינור לאחר שלושה ימים של טיפול בגורם גדילה. ה-BMECs שמקורם ב-iPSC שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה ביטאו במשותף חלבוני צומת הדוקים המתבטאים בתאי אנדותל במוח, בריאות, בכבד ובכליות, כמו גם סמני אנדותל כלי דם המתבטאים במחסום הדם-מוח.

כפי שנצפה, 48 שעות לאחר תת-תרבית ושינוי בינוני BMECs שמקורם ב-iPSC מדגימים ערכי TEER בטווח המתואר עבור BMECs שמקורם ב-iPSC שעברו תרבית משותפת עם אסטרוציטים ראשוניים של חולדות. בשלב זה נצפתה גם פעילות מוביל פליטה. לאחר שימור בהקפאה, מדידות TEER נמוכות יותר בהשוואה ל-BMECs טריים.

ניתוח כתמים מערביים חושף רמות מופחתות של סמני צומת הדוקים, כגון אוקלודין, בעוד שאימונוציטוכימיה מראה דפוסים מנומשים או מרוטים של חלבוני צומת הדוקים. צפיפות iPSC גבוהה מדי או נמוכה מדי תשפיע על יעילות ההתמיינות ותשפיע על התפתחות תכונות מתאימות של מחסום הדם-מוח. שיטה זו מאפשרת לחקור את תכונות המחסום, האיתות התאי ופעילות הטרנספורטר באמצעות BMECs אינדיבידואליים כדי לדגמן את הפיזיולוגיה והפתופיזיולוגיה של תפקוד מחסום הדם-מוח.