Name: הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: חקור שיטות הדמיה של Pseudomonas aeruginosa ופוליסכריד Psl בכיח חולי סיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מאפשר הבנה מרחבית של התנהגות חיידקית ועמידות לאנטיביוטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לקרן סיסטיק פיברוזיס שסיפקה מימון למחקר זה ול-MedImmune על תרומתם הנדיבה של נוגדנים נגד PSL0096. לצורך מחקר זה בוצעה הדמיה במתקן הדמיה CAMiLoD באוניברסיטת טורונטו.

אישור ועדת האתיקה של המחקר (REB) נדרש כדי לאסוף ולאחסן דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקרים המוצגים כאן אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.
1. איסוף כיח
<ol><li>יש לאחסן את הכיח הצפוי בכוס איסוף סטרילית ולאחסן מיד בטמפרטורה של 4°C למשך 24 שעות לכל היותר לפני הקיבוע. הערה: השארת הכיח זמן רב מדי בטמפרטורה של 4°C ללא קיבוע עלולה להוביל לפירוק התאים, במיוחד להתפרקות תאי הדם הלבנים. קיבוע בהקדם האפשרי עדיף.</li>
	<li>מעבירים את דגימות הכיח לצינור סטרילי של 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסף נפח שווה של 4% paraformaldehyde (PFA) לדגימות כיח. לדוגמה, אם דגימת הכיח היא 0.5 מ"ל, הוסף 0.5 מ"ל של 4% PFA. מערבבים בהיפוך עדין.</li>
	<li>לדגור על כיח לילה ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>לשטוף את הדגימה על ידי הוספת 5 מ"ל של פוספט buffered מלוחים (PBS) לכל 2 מ"ל של כיח קבוע. הערה: אין צורך בצנטריפוגה לשלב שטיפה זה.</li>
	<li>בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה. הערה: הימנעו מלמצוץ את הכיח עם פיפטה על ידי הפניית הקצה הרחק מהכיח ושאפו לאט מאוד מהנוזל שעל פני השטח. שלב השטיפה אינו כרוך בצנטריפוגה כדי לא להפריע לשלמות המבנית של תקעי הכיח.</li>
	<li>חזור על שלבים 1.6-1.7 פעמיים נוספות.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה בנפח פי 2 של PBS עם 0.01% (w/v) נתרן אזיד.</li>
	<li>לאחסן את הכיח ב 4 °C.</li>
</ol>2. MiPACT (טכניקת ניקוי רקמות) עיבוד של כיח
<ol><li>יש לנטרל את רכיבי ההידרוג'ל (30% 29:1 אקרילאמיד:bis-acrylamide, hardner ו-PBS) במיכל אטום המכיל אריזה אנאירובית לפני 72 שעות. הערה: האריזה האנאירובית והמיכל האטום נחוצים מכיוון שחמצן מעכב פילמור אקרילאמיד. לחלופין, ניתן להסיר חמצן על ידי ביצוע שלב זה במכסה מנוע אנאירובי, על ידי מריחת ואקום על מיכל אטום, או על ידי בעבוע גז N2 דרך תערובת האקרילאמיד.<ol><li>הוסף 2 מ"ל של 30% 29:1 תמיסת אקרילאמיד:ביס-אקרילאמיד לצינור 15 מ"ל כשהמכסה כבוי בתוך המיכל האנאירובי האטום.</li>
		<li>צור מלאי מרוכז של 10% (w/v) מקשה על ידי הוספת 0.5 גרם של מקשה ל- 5 מ"ל PBS בצינור של 15 מ"ל. השאירו את הפקק מחוץ לצינור ואחסנו במיכל האנאירובי האטום.</li>
		<li>השאירו כמה מ"ל של PBS סטרילי בצינור, כשהמכסה כבוי, בתוך המיכל האנאירובי.</li>
	</ol></li>
	<li>הפוך 5 מ"ל פתרון של הידרוג'ל עם ריכוז סופי של 0.2% מקשה ו 4% 29: 1 אקרילאמיד: bis-acrylamide ב PBS בצינור 15 מ"ל. מערבבים בהיפוך ומסננים.</li>
	<li>מוציאים דגימות כיח מהמקרר, ואז חותכים לחתיכות קטנות (בערך 5 מ"מ קוטר) בתנאים סטריליים עם אזמל. הערה: אם הכיח נוזלי למדי עדיין ניתן לבצע שלב זה, עם זאת, נדרשת סבלנות מוגברת ותרגול כדי להסיר את הכיח מתמיסת האחסון בפינצטה לפני השימוש באזמל כדי להפריד את השברים הרצויים.</li>
	<li>הניחו את דגימות הכיח החתוכות בתוך באר של מגלשת זכוכית כיסוי בעלת 8 תאים.</li>
	<li>הוסף 300 μL של תמיסת הידרוג'ל מעוקרת מסנן משלב 2.2 לכל אחת מהבארות המכילות כיח.</li>
	<li>הניחו את 8 תאי הזכוכית בתוך מיכל אטום המכיל אריזה אנאירובית למשך 3 שעות בטמפרטורה של 37°C. הערה: לאחר פולימר הידרוג'ל עם כיח מוטבע צריך להיות עקביות של ג'ל מוצק.</li>
	<li>העבירו את דגימות כיח ההידרוג'ל המוצק לצינור תרבית של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של 8% נתרן דודציל סולפט (SDS), pH 8, ואפשרו לדגימות להתנקות במשך 3-14 ימים בטמפרטורה של 37°C (עם או בלי טלטול), עד שהכיח הופך שקוף. הערה: זמני הניקוי תלויים בהרכב הכיח ובדרך כלל ניתן להפחית אותם עם רעידות. עם זאת, יש להקפיד שלא להגביר את מהירות הרעידה עד כדי הפרעה לשלמות הדגימה. לדגימות עשירות יותר בדנ"א לוקח זמן רב יותר להתנקות בהשוואה לדגימות עשירות בליחה.</li>
	<li>יש לרוקן את פתרון 8% SDS לתוך מיכל איסוף פסולת. באמצעות פינצטה סטרילית להעביר כל דגימה משובצת הידרוג'ל לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של PBS לכל אחד צינורות חרוטי 50 מ"ל כדי לשטוף את hydrogels ולתת את הפתרון לשבת במשך 30 דקות עד 1 שעה לפני decanting. חזור על פעולה זו פעמיים נוספות. הערה: שלב שטיפה זה אינו כרוך בצנטריפוגה. עודף נוזל supernatant מוסרים בזהירות עם פיפטה.</li>
	<li>אחסנו דגימות שטופות ב-PBS עם 0.01% (w/v) נתרן אזיד ו-1x מעכב RNase ב-4°C.</li>
</ol>3. פרוטוקול הכלאה פלואורסצנטית של הידרוג'ל באתרו (FISH)
<ol><li>הסירו את דגימות ההידרוג'ל מתמיסת האחסון שלהן באמצעות פינצטה סטרילית והניחו את הדגימות על משטח סטרילי (כגון מגלשת זכוכית או צלחת פטרי).</li>
	<li>בעזרת אזמל סטרילי חותכים את ההידרוג'לים לפרוסות בעובי ~ 1 מ"מ.</li>
	<li>מניחים את חלקי ההידרוג'ל בקוטר 1 מ"מ בתוך צינורות סטריליים של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הכן 1 מ"ל את חיץ ההכלאה (25% פורממיד, 0.9 M NaCl, 20 mM Tris-HCl [pH 7.6], 0.01% SDS, מטוהר ונטול יונים H2O) בצינור של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף את הגשושית PseaerA המסומנת באופן פלואורסצנטי (150.7 ננומטר12) למאגר ההכלאה וערבב באמצעות היפוך. הערה: יש להרחיק את תמיסת הפורמלין מלהבה פתוחה. ניתן להכין את חיץ ההכלאה בצורה מתקדמת ולאחסן באליציטוטים ב -20 ° C13.</li>
	<li>הוסף 200-500 μL של חיץ הכלאה לכל קטע ~ 1 מ"מ של הידרוג'ל וודא שכל דגימת ההידרוג'ל שקועה.</li>
	<li>אפשר לגשושית PseaerA לבצע הכלאה עם דגימות ההידרוג'ל על ידי הצבתן בחושך למשך ~ 18-24 שעות, ב 46 מעלות צלזיוס, מבלי לרעוד.</li>
	<li>מרוקנים את מאגר ההכלאה לתוך מיכל איסוף פסולת.</li>
	<li>יש לשטוף דגימות פעם אחת עם חיץ כביסה מעוקר מסנן (337.5 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) [pH 7.2], 0.01% SDS, ו מטוהר ו deionized H2O) על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ כביסה לכל אחד צינורות 1.5 מ"ל ולאחר מכן להסיר אותו. הערה: ניתן להכין מראש את חיץ הכביסה ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ כביסה טרי לצינורות, ולאחר מכן לדגור על הדגימות בחושך במשך 6 שעות ב 48 ° C, מבלי לרעוד.</li>
</ol>4. קשירת נוגדנים הידרוג'ל ו-Psl0096
<ol><li>הסירו באופן סטרילי את חיץ הכביסה באמצעות פיפטור 1 מ"ל.</li>
	<li>שטוף את הדגימות עם 2% BSA (w/v) בתמיסת PBS על ידי הוספה והסרה של 1 מ"ל של תמיסת 2% BSA.</li>
	<li>הוסף 500 μL של תמיסת 2% BSA/PBS לדגימות ההידרוג'ל כדי לחסום קשירת חלבונים לא ספציפיים. לאחר מכן דגרו על הדגימות למשך הלילה, בחושך, ב-RT, מבלי לרעוד.</li>
	<li>הסר באופן סטרילי את פתרון החסימה באמצעות פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>הכן את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red על ידי דילול הנוגדן לריכוז סופי של 0.112 מיקרוגרם/מ"ל ב-500 מיקרוליטר של 2% BSA/PBS טריים.</li>
	<li>הוסף את תמיסת הנוגדנים 500 μL לדגימות ההידרוג'ל ודגר אותן ב- RT במשך 6 שעות, מוגן מפני אור, ללא רעידות.</li>
</ol>5. DAPI (4′,6′-diamidino-2-phenylindole) צביעה
<ol><li>הכינו את תמיסת התאמת אינדקס השבירה (RIMS) על ידי הוספת 40 גרם של מדיום שיפוע צפיפות לא יוני, 30 מיקרוליטר של Tween20, 3 מיקרוגרם נתרן אזיד ו-30 מ"ל של PBS לבקבוק המכיל מוט ערבוב מגנטי. ערבבו את התמיסה במשך 15 דקות על בחש מגנטי, או עד להמסה מלאה.</li>
	<li>מסננים לעקר את התמיסה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל באמצעות מזרק 10 מ"ל ומסנן סטרילי 0.2 מיקרומטר. הערה: ניתן לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C למשך מספר חודשים.</li>
	<li>הסר את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red עם פיפטה סטרילית של 1 מ"ל.</li>
	<li>שטפו את דגימות ההידרוג'ל על ידי הוספה ולאחר מכן הסרה של 1 מ"ל PBS.</li>
	<li>דגרו על דגימות ההידרוג'ל עם 250 μL של תמיסת RIMS ו-10 מיקרוגרם/מ"ל של DAPI ב-RT עם רעידות עדינות, בחושך, למשך הלילה.</li>
	<li>לפני ההדמיה הקונפוקלית יש להרכיב את הדגימות על תאי זילוח בקוטר 0.9 מ"מ או 1.7 מ"מ ולאטום באמצעות כיסוי זכוכית. הערה: לאחר FISH ו/או אימונוהיסטוכימיה ולפני טבילה ב-RIMS, ניתן למרוח כתמי לקטין פלואורסצנטיים אם רוצים הדמיה של רירית הכיח12.</li>
</ol>6. הדמיה
<ol><li>בצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית לסריקת לייזר בטכניקות סטנדרטיות בהגדלות של 25x, 40x, 63x או 100x.</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, D., Stableforth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+treatment+of+respiratory+pseudomonas+infection+in+cystic+fibrosis%3A+What+drug+and+which+way%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">The treatment of respiratory pseudomonas infection in cystic fibrosis: What drug and which way.</a> Drugs. 60 (5), 1053-1064 (2000).</li>
<li>Rosenfeld, M., Ramsey, B. W., Gibson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+acquisition+in+young+patients+with+cystic+fibrosis%3A+Pathophysiology%2C+diagnosis%2C+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pulmonary+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas acquisition in young patients with cystic fibrosis: Pathophysiology, diagnosis, and management.</a> Current Opinion in Pulmonary Medicine. 9 (6), 492-497 (2003).</li>
<li>Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+and+Resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms+to+Antimicrobial+Agents-How+P.+aeruginosa+Can+Escape+Antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Tolerance and Resistance of Pseudomonas aeruginosa Biofilms to Antimicrobial Agents-How P. aeruginosa Can Escape Antibiotics.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).</li>
<li>Billings, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Extracellular+Matrix+Component+Psl+Provides+Fast-Acting+Antibiotic+Defense+in+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Extracellular Matrix Component Psl Provides Fast-Acting Antibiotic Defense in Pseudomonas aeruginosa Biofilms.</a> PLoS Pathogens. 9 (8), 1003526(2013).</li>
<li>Franklin, M. J., Nivens, D. E., Weadge, J. T., Lynne Howell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+the+Pseudomonas+aeruginosa+extracellular+polysaccharides%2C+alginate%2C+Pel%2C+and+Psl%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of the Pseudomonas aeruginosa extracellular polysaccharides, alginate, Pel, and Psl.</a> Frontiers in Microbiology. 2, 167(2011).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+serve+as+scaffold+of+biofilms+formed+by+mucoid+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides serve as scaffold of biofilms formed by mucoid Pseudomonas aeruginosa.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 366-376 (2012).</li>
<li>Wozniak, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+is+not+a+significant+component+of+the+extracellular+polysaccharide+matrix+of+PA14+and+PAO1+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alginate is not a significant component of the extracellular polysaccharide matrix of PA14 and PAO1 Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7907-7912 (2003).</li>
<li>Baker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide+biosynthetic+glycoside+hydrolases+can+be+utilized+to+disrupt+and+prevent+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide biosynthetic glycoside hydrolases can be utilized to disrupt and prevent Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Science Advances. 2 (5), 1-9 (2016).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>DePas, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposing+the+three-dimensional+biogeography+and+metabolic+states+of+pathogens+in+cystic+fibrosis+sputum+via+hydrogel+embedding%2C+clearing%2C+and+rRNA+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Exposing the three-dimensional biogeography and metabolic states of pathogens in cystic fibrosis sputum via hydrogel embedding, clearing, and rRNA labeling.</a> mBio. 7 (5), 1-11 (2016).</li>
<li>Molecular Instruments HCR v3.0 protocol for bacteria in suspension. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.molecularinstruments.com">www.molecularinstruments.com</a> 1-6 (2019).</li>
<li>Murray, M. P., Doherty, C. J., Govan, J. R. W., Hill, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+processing+time+and+storage+of+sputum+influence+quantitative+bacteriology+in+bronchiectasis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Do processing time and storage of sputum influence quantitative bacteriology in bronchiectasis.</a> Journal of Medical Microbiology. 59 (7), 829-833 (2010).</li>
<li>Efthimiadis, A., Jayaram, L., Weston, S., Carruthers, S., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum%3A+Time+from+expectoration+to+processing%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum: Time from expectoration to processing.</a> European Respiratory Journal. 19 (4), 706-708 (2002).</li>
<li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li>
<li>St-Laurent, J., Boulay, M. E., Prince, P., Bissonnette, E., Boulet, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cell+fixation+methods+of+induced+sputum+specimens%3A+An+immunocytochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of cell fixation methods of induced sputum specimens: An immunocytochemical analysis.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 36-42 (2006).</li>
<li>Hogardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+rapid+detection+by+fluorescent+situ+hybridization+of+bacteria+in+clinical+samples+obtained+from+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Specific and rapid detection by fluorescent situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients.</a> Journal of Clinical Microbiology. 38 (2), 818-825 (2000).</li>
<li>Hoffmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Novel+mouse+model+of+chronic+Pseudomonas+aeruginosa+lung+infection+mimicking+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Erratum: Novel mouse model of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection mimicking cystic fibrosis.</a> Infection and Immunity. 73 (8), 5290(2005).</li>
<li>Nair, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+Gram+staining+for+evaluation+of+the+quality+of+cystic+fibrosis+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Utility of Gram staining for evaluation of the quality of cystic fibrosis sputum samples.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (8), 2791-2794 (2002).</li>
<li>Howlin, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-Dose+Nitric+Oxide+as+Targeted+Anti-biofilm+Adjunctive+Therapy+to+Treat+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+Infection+in+Cystic+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Low-Dose Nitric Oxide as Targeted Anti-biofilm Adjunctive Therapy to Treat Chronic Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis.</a> Molecular Therapy. 25 (9), 2104-2116 (2017).</li>
<li>Pestrak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+the+Pseudomonas+aeruginosa+glycoside+hydrolase+PslG+combats+wound+infection+by+improving+antibiotic+efficacy+and+host+innate+immune+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Treatment with the Pseudomonas aeruginosa glycoside hydrolase PslG combats wound infection by improving antibiotic efficacy and host innate immune activity.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (6), 00234(2019).</li>
</ol>

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר הצצה לארגון באתרו של תאי P. aeruginosa בכיח מחולי CF. דגימות כיח יש לאחסן ב 4 ° C עד עיבוד אם הם לא יכולים להיות קבועים מיד. הוכח כי מספרי תאי P. aeruginosa בכיח אינם משתנים באופן משמעותי אם הם מעובדים ב 1 שעות, 24 שעות, או 48 שעות, כאשר מאוחסנים ב 4 ° C, אם כי אם נשאר ב 25 ° C במשך 24 או 48 שעות, ספירת תאי חיידקים יגדל באופן משמעותי כתוצאה מצמיחת חיידקים14. עבור מחקר זה, דגימות כיח אוחסנו ב 4 ° C עד מקסימום של 24 שעות לאחר expectoration. יש לציין כי ספ...

במחקר זה, ניסויים תוכננו כדי לדמיין את המבנה in vivo של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס ילדים (CF). זיהומים P. aeruginosa הופך כרוני ב 30-40% מאוכלוסיית CF ילדים; ברגע זיהומים כרוניים להתבסס, הם כמעט בלתי אפשרי לחסל1. P. aeruginosa מבודד מחולים עם זיהום מוקדם הם בדרך כלל רגישים יותר מיקרוביאלית, ולכן, אלה מטופלים עם אנטיביוטיקה אנטי pseudomonal כדי למנוע הקמת זיהום כרוני2. למרבה הצער, לא כל המבודדים של P. aeruginosa מנוקים ביעילות מהריאה לאחר טיפול אנטיביוטי. המנגנונים המדויקים הקשורים לכשל אנטיביוטי לא הובהרו במלואם. מחקרים קודמים הראו כי שינויים בצפיפות תאי ביופילם, צבירה וייצור רב-סוכר יכולים להשפיע על יעילות אנטיביוטיקה3. P. aeruginosa מייצר שלושה רב-סוכרים חוץ-תאיים: Pel, Psl ו-alginate4. לרוב הזנים של P. aeruginosa יש את היכולת הגנטית לבטא כל אחד מהאקסופוליסכרידים, אם כי לעתים קרובות סוג אחד של פוליסכריד מבוטא בעיקר5. אלגינט exopolysaccharide קשור לזיהומים כרוניים בריאה CF, וכתוצאה מכך פנוטיפ רירית 6,7. לרב-סוכרים Pel ו-Psl תפקידים רבים, כולל סיוע בהתקשרות ראשונית ושמירה על מבנה הביופילם, והענקת עמידות לאנטיביוטיקה8.
שיטות שמטרתן לדמיין מבנים in vivo של רקמות פותחו עבור מגוון רחב של סוגי מדגם 9,10,11. לאחרונה, הם הותאמו כדי לדמיין קהילות מיקרוביאליות in vivo בתוך כיח מחולי CF12. אופטימיזציה של פרוטוקול ניקוי רקמות במיוחד לזיהוי קהילות מיקרוביאליות בתוך כיח פותחה על ידי DePas et al., 201612. המונח MiPACT, ראשי תיבות של microbial identification after Passive CLARITY technique, נטבע לניקוי כיח CF11,12. עבור טכניקות ניקוי רקמות, הדגימות מתוקנות תחילה, ולאחר מכן הופכות לשקופות תוך השארת הארכיטקטורה הטבועה בהן ללא פגע לצורך צביעה והדמיה מיקרוסקופית11. תיקון וניקוי דגימות כיח CF מאפשרים לחוקרים לענות על שאלות הקשורות למבנה הביופילם, צפיפות תאי חיידקים, קשרים רב-מיקרוביאליים וקשרים בין פתוגנים לתאים מארחים. היתרון של בחינה ישירה של חיידקים שנשתמרו בתוך הכיח הוא שניתן לנתח אותם ולדמיין אותם בהקשר ספציפי למארח. למרות שגידול חוץ גופי של מבודדים קליניים במעבדה לניסויים יכול להיות אינפורמטיבי מאוד, שיטות כאלה אינן מסוגלות לשחזר באופן מלא את סביבת הריאות של CF, וכתוצאה מכך נוצר נתק בין תוצאות המעבדה לבין תוצאות המטופלים.
ניתן להשתמש בשיטות המוצגות כאן כדי לתקן ולנקות כיח כדי לדמיין חיידקים, בין אם מחולי CF או חולים עם זיהומים אחרים בדרכי הנשימה. הסוג הספציפי של צביעה וניתוח מיקרוסקופי המתואר כאן הוא הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), ואחריה קשירת נוגדנים נגד PSL בתוך ההידרוג'ל, וניתוח עוקב באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM). לאחר ניקוי רקמות, ניתן ליישם גם שיטות אחרות של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ.

<table><tbody><tr><td>29:1 אקרילאמיד ביסקרילאמיד, תמיסה 30%</td><td>BioRad</td><td>161-0146</td><td></td></tr><tr><td>8-Chambered Coverglass Nunc Lab-Tek</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Anaerogen2.5L</td><td>Oxid Inc.</td><td>35108</td><td></td></tr><tr><td>תאי זלוף Coverwell</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>70326 -12/-14</td><td></td></tr><tr><td>HistoDenz</td><td>Sigma</td><td>D2158</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNA Rnase</td><td>Sigma</td><td>R7387</td><td></td></tr><tr><td>PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC</td><td>Eurofins</td><td></td><td>פרטי הזמנה: מוצר: DNA Oligo שונה; שם: PseaerA; רצף: [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC; סינתזה: 50 ננומול; טיהור: HPLC; מצב האונייה: תפוקה מלאה (יבשה)</td></tr><tr><td>Psl0096-טקסס אדום</td><td>Medimmune</td><td></td><td>הנוגדנים האדומים Psl0096-Texas היו מתנה שניתנה באדיבות על ידי Medimmune ויש ליצור קשר עם החברה לבירור הזמנה.</td></tr><tr><td>VA-044 מקשיח</td><td>וואקו</td><td>27776-21-21</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה של pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients

גילוי מוקדם ומיגור של Pseudomonas aeruginosa בריאות של חולי סיסטיק פיברוזיס יכול להפחית את הסיכוי לפתח זיהום כרוני. התפתחות זיהומים כרוניים של P. aeruginosa קשורה לירידה בתפקוד הריאות ולעלייה בתחלואה. לכן, יש עניין רב להבהיר את הסיבות לכישלון למגר P. aeruginosa עם טיפול אנטיביוטי המתרחשת בכ 10-40% מהחולים ילדים. אחד הגורמים הרבים שיכולים להשפיע על פינוי הפונדקאי של P. aeruginosa ורגישות לאנטיביוטיקה הוא שינויים בארגון המרחבי (כגון צבירה או היווצרות ביופילם) וייצור פוליסכרידים. לכן, היינו מעוניינים לדמיין את המאפיינים באתרו של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF. טכניקת ניקוי רקמות יושמה על דגימות כיח לאחר הטמעת הדגימות במטריצת הידרוג'ל כדי לשמור על המבנים התלת-ממדיים ביחס לתאים המארחים. לאחר ניקוי הרקמות, נוספו תוויות פלואורסצנטיות וצבעים כדי לאפשר הדמיה. הכלאה פלואורסצנטית באתרו בוצעה לצורך הדמיה של תאי חיידקים, קשירה של נוגדנים אנטי-PSL המסומנים באופן פלואורסצנטי להדמיה של האקסופוליסכריד וצביעה DAPI כדי להכתים תאים מארחים כדי לקבל תובנה מבנית. שיטות אלה אפשרו הדמיה ברזולוציה גבוהה של P. aeruginosa בתוך כיח של חולי CF באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.

התכנון הכולל של הניסוי מסוכם באיור 1 ובאיור 2. איור 1 מספק סיכום של פרוטוקולי עיבוד כיח וניקוי כיח. עיבוד וניקוי כיח עשויים להימשך עד 17 יום. עם זאת, ניתן לעצור את הפרוטוקול, וניתן לאחסן דגימות לאחר קיבוע עם PFA (יום 2) או לאחר ניקוי רקמות (ימים 5-17 בהתאם לזמן הניקוי). באיור 2 מסוכמים פרוטוקולי הקישור של FISH ונוגדנים. פרוטוקולי FISH וצביעת נוגדנים אורכים 4 ימים אך יש להשלים אותם ולצלם תמונות קונפוקליו...

פרוטוקול זה מספק שיטות להדמיה של תאי חיידקים ורב-סוכר סינתזת רב-סוכר (Psl) בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס.

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

Early detection and eradication of Pseudomonas aeruginosa within the lungs of cystic fibrosis patients can reduce the chance of developing chronic ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר הדמיה ישירה של Pseudomonas aeruginosa והאקסופוליסכריד Psl בתוך כיח סיסטיק פיברוזיס. טכניקה זו עוזרת לענות על שאלות לגבי האופן שבו הארגון המרחבי של P.aeruginosa כגון אגרגציה או ביופילמים משפיע על פינוי המארח ועל הרגישות האנטי-מיקרוביאלית. אחסן את הליחה המכייחת בכוס איסוף סטרילית בארבע מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לכל היותר לפני הקיבוע.כשמוכנים לתקן את הדגימות, העבירו אותן לצינור סטרילי של 15 מיליליטר, והוסיפו נפח שווה של 4% PFA, ואז דגרו את הליחה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. שטפו את הדגימות על ידי הוספת חמישה מיליליטר PBS לכל שני מיליליטר ליחה קבועה. הסר בזהירות את הסופרנטנט בעזרת פיפטה, וחזור על הכביסה פעמיים נוספות.השעו מחדש את הגלולה בנפח כפול מ-PBS עם 0.01% נתרן אזיד, ואחסנו אותה בארבע מעלות צלזיוס. הוסף שני מיליליטר של 30%29 לתמיסת אקרילאמיד/ביסקרילאמיד אחת לצינור של שלושה מיליליטר כשהמכסה סגור בתוך מיכל אנאירובי אטום, ולאחר מכן הוסף 0.5 גרם מקשה לשני מיליליטר PBS בצינור של שלושה מיליליטר. השאירו את הפקק מחוץ לשפופרת, ואחסנו אותו במיכל האנאירובי האטום.השאירו כמה מיליליטר PBS סטרילי בצינור כשהמכסה כבוי בתוך המיכל האנאירובי. הסר את רכיבי ההידרוג'ל במיכל האטום באריזה אנאירובית למשך 72 שעות. הכינו תמיסה של 2.5 מיליליטר של הידרוג'ל עם ריכוז סופי של 0.2% מקשה ו-4% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד ב-PBS בשפופרת של 15 מיליליטר, וערבבו את ההידרוג'ל בהיפוך, ולאחר מכן סננו לעקר את התמיסה.חותכים את דגימות הליחה לשני חלקים קטנים בעזרת אזמל, ואז מניחים כל דגימה בבאר של שקופית זכוכית מכוסה עם שמונה תאים. מוסיפים 300 מיקרוליטר מתמיסת הידרוג'ל מעוקרת מסנן לכל באר המכילה ליחה, ומניחים אותה בתוך מיכל אטום עם אריזה אנאירובית למשך שלוש שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. העבירו את דגימות ליחת ההידרוג'ל המוצקות לצינור תרבית של 15 מיליליטר עם חמישה מיליליטר של 8% SDS ב-pH שמונה, ואפשרו לדגימות להתנקות במשך שלושה עד 14 ימים ב-37 מעלות צלזיוס עד שהליחה הופכת לשקופה.השתמש בפינצטה סטרילית כדי להעביר כל דגימה משובצת הידרוג'ל לצינור חרוטי של 50 מיליליטר, והוסף 10 מיליליטר PBS לשטיפת ההידרוג'ל. הניחו לתמיסה לשבת במשך 30 עד 60 דקות לפני הניקוי, ולאחר מכן חזרו על הכביסה פעמיים נוספות. אחסן את הדגימות השטופות ב-PBS עם 0.01% נתרן אזיד ומעכב RNase בארבע מעלות צלזיוס.הסר את דגימות ההידרוג'ל מתמיסת האחסון שלהן, והנח את הדגימות על משטח סטרילי. השתמש באזמל סטרילי כדי לחתוך את ההידרוג'לים לפרוסות בעובי של מילימטר אחד, ולהניח את החלקים בצינורות של 1.5 מיליליטר. הכן מיליליטר אחד של מאגר הכלאה בצינור של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן הוסף את בדיקת Seer A המסומנת פלואורסצנטית, וערבב בהיפוך.הוסף 200 עד 500 מיקרוליטר של מאגר הכלאה לכל חלק, וודא שכל דגימת ההידרוג'ל שקועה. אפשר ל-Seer A-probe להכלאה עם דגימות ההידרוג'ל על ידי הנחתן בחושך למשך כ-18 עד 24 שעות ב-46 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד, ואז להוסיף מיליליטר אחד של מאגר כביסה טרי לצינורות, ולדגור אותן בחושך למשך שש שעות ב-48 מעלות צלזיוס. הוסף 500 מיקרוליטר של 2% BSA ו-PBS לדגימות ההידרוג'ל כדי לחסום קשירת חלבון לא ספציפית, ולאחר מכן דגר את הדגימות למשך הלילה בחושך.למחרת, הכינו את תמיסת הנוגדנים Psl0096-Texas Red על ידי דילול הנוגדן לריכוז סופי של 0.112 מיקרוגרם למיליליטר ב-500 מיקרוליטר של 2% BSA טרי ב-PBS. הוסיפו את תמיסת הנוגדנים לדגימות ההידרוג'ל, ודגרו אותן בחושך למשך שש שעות. לאחר מכן, צבעו את דגימות ההידרוג'ל ב-DAPI על ידי דגירה עם 250 מיקרוליטר של תמיסת RIMs ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI למשך הלילה בחושך עם ניעור עדין.לאחר הצביעה, הרכיבו את הדגימות על תאי זלוף של 0.9 או 1.7 מילימטר, ואטמו אותן עם כיסוי זכוכית. בצע מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי עם הגדלות פי 25, 40, 63 או 100. פרוטוקול זה שימש להשגת תמונות תלת מימד ברזולוציה גבוהה של תאי P.aeruginosa ומבנה ה-NC2 שלהם בתוך ליחה.צבירה של תאים בתוך דגימת כיח מוצגת כאן. צורות מוטות בודדות נראו בירוק מהקישור הספציפי למין של הגשושית Seer A-488 לתאי P.aeruginosa. הנוגדן Psl0096-Texas Red מראה כי האקסופוליסכריד הפסאודומונלי בתוך הליחה חופף בעיקר לתאי P.aeruginosa.שיטה זו שימשה גם להדמיה של תאים פסאודומונליים בתוך הליחה ביחס לתאי חיידקים אחרים ומבני מארח. מקבץ של תאי P.aeruginosa נראה לפגוציטוז בתוך תא אוקריוטי בעוד שאשכולות תאי קוק קטנים אחרים נצפו בסביבה. כמו כן, הוכח כי נוגדן PSL 0096 יכול להיקשר ל-PSL המיוצר מפלנקטון P.Aeruginosa.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מיישמת גישת ניקוי רקמות ואחריה הכלאה פלואורסצנטית באתר, צביעת נוגדנים ומיקרוסקופיה קונפוקלית. זה מאפשר לחוקרים לדמיין ולהשתמש בטכניקות עיבוד תמונה כדי למדוד כמותית הבדלים במבני קולוניזציה של P.aeruginosa בתוך כיח CF ביחס לתוצאות בריאות המטופל.

visualization-pseudomonas-aeruginosa-within-sputum-cystic-fibrosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בדיקות אבחון רגישות מיקרוביאלית הנוכחי מסתמך על צמיחה של planktonic מבודד ב מזין, עשיר תנאים אירוביים. כאן, אנו מעסיקים בינוני חלופה כיח מלאכותית ללמוד הרגישות מיקרוביאלית של Pseudomonas aeruginosa biofilms תחת שני תנאים אירוביים ו microaerophilic נציג נוסף של הריאה סיסטיק פיברוזיס.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

מקור: בודואן, ט. ואחרים. המחשת השפעות הליחה על התפתחות ביופילם באמצעות מודל זכוכית כיסוי עם תאים. J. Vis. Exp. (2016)הסרטון הזה מדגים שיטה במבחנה כדי להעריך כיצד ליחת סיסטיק פיברוזיס שמקורה במטופל משפיעה על יצירת ביופילם חיידקים. באמצעות שקופיות תא, צביעה פלואורסצנטית ומיקרוסקופיה קונפוקלית, הוא חושף עובי מוגבר, ארכיטקטורה משתנה וביומסה בוגרת ערך גבוהה יותר בביופילמים שגודלו בליחה, ומדגיש את תפקיד רכיבי המארח בעיצוב התפתחות הביופילם.

הדמיה קונפוקלית של ביופילמים חיידקיים שנגרמו על ידי ליחה מתנדלקת אצל חולי סיסטיק פיברוזיס

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

אנו מתארים את השיטה אגר חרוזים להקים זיהום מתמשך לטווח ארוך כרוני Pseudomonas aeruginosa בדרכי אוויר במודל העכבר.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של התפתחות הביופילם לאחר חשיפה לגורמי מארח באמצעות מודל תא שקופיות. מודל זה מאפשר הדמיה ישירה של התפתחות ביופילם וכן ניתוח פרמטרים של ביופילם באמצעות תוכנות מחשב.

לדמיין את ההשפעות של כיח על פיתוח biofilm באמצעות מודל תאיים coverglass

אנו מתארים פרוטוקול עבור מודל תלת מימדי של שיתוף תרבות של דרכי הנשימה הנגועות, באמצעות CFBE41o- תאים, מקרופאגים THP-1, ו פסאודומונס aeruginosa, הוקמה בממשק אוויר נוזלי. מודל זה מספק פלטפורמה חדשה כדי לבדוק בו זמנית יעילות אנטיביוטיקה, פונקציית מחסום אפיתל, סמנים דלקתיים.

פ. ארוגינוזה נגוע 3D שיתוף תרבות של תאים אפיתל הסיפונות מקרופאגים בממשק אוויר נוזלי להערכה פרה-סרטנית של אנטי זיהומים

זרימת עבודה זו יכולה לשמש לביצוע בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה באמצעות מודל ex vivo הוקמה של ביופילם חיידקי בריאות של אנשים עם סיסטיק פיברוזיס. שימוש במודל זה יכול לשפר את התוקף הקליני של MBEC (ריכוז מיגור ביופילם מינימלי) מבחנים.

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

הפרוטוקול כאן מדגים זרימת עבודה מהירה ומתוקננת של הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר הלקוח (M-ROSE), הכוללת שלושה שלבים: יצירת שקופיות, צביעה ופענוח. פרוטוקול זה יסייע לרופאים לקבל החלטות קליניות מהירות.

הערכה מיקרוביולוגית מהירה באתר למחלות זיהומיות ריאתיות

פרוטוקול זה מתאר מודל ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לארבעה מינים של סיסטיק פיברוזיס (CF), שניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות בין מינים חיידקיים.

גידול ביופילם פולימיקרוביאלי רלוונטי לסיסטיק פיברוזיס כדי לחקור פנוטיפים קהילתיים

מתודולוגיה זו מאפשרת הקמת מודל ביופילם פולימיקרוביאלי בסיסטיק פיברוזיס לבדיקת רגישות מיקרוביאלית במעבדות מחקר וקליניות. מודל זה מספק תוצאות מדויקות ואמינות על פני מגוון תפוקות.

פיתוח מודל ביופילם של מושבה פולימיקרוביאלית לבדיקת אנטי-מיקרוביאלים בסיסטיק פיברוזיס

חקור שיטות הדמיה של Pseudomonas aeruginosa ופוליסכריד Psl בכיח חולי סיסטיק פיברוזיס. פרוטוקול זה מאפשר הבנה מרחבית של התנהגות חיידקית ועמידות לאנטיביוטיקה.

הדמיה של Pseudomonas aeruginosa בתוך כיח של חולי סיסטיק פיברוזיס

גלה סרטונים נוספים