זיהוי וריאנטים גנטיים בגן CALR באמצעות ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה

שיטה זו מגדירה במדויק מוטציות קלרטיקולין בחולים עם חשד למצב המטולוגי, במיוחד כאשר אפשרויות אבחון אחרות מוגבלות או שיש חפיפה עם מצבים שאינם המטולוגיים. היתרון העיקרי של טכניקת המראה ברזולוציה גבוהה הוא זיהוי הגרסאות הגנטיות הסומטיות הנפוצות באזור הנקודה החמה של גן הקלרטיקולין בגבול הזיהוי המקובל ובעלות משתלמת. טכניקה זו מאפשרת אבחון מהיר ולא פולשני של הפרעות מיאלופרוליפרטיביות, במיוחד טרומבוציטמיה חיונית ומיאלופיברוזיס ראשונית.

נכון לעכשיו אין לזה השפעה על בחירת הטיפול בחולים אלה. עם זאת, זה עשוי להשתנות בעתיד. התחל בהכנת תמהיל המאסטר qPCR HRM כמתואר בכתב היד הטקסטי, מה שמספיק לשלושה שכפולים של כל דגימת DNA ובקרה.

מערבבים את תוכן התגובה על ידי הקשה עדינה והיפוך הצינור והמערבולת למשך שתיים עד שלוש שניות, ואז מסובבים לזמן קצר את הצינור כדי לאסוף את הטיפות המפוזרות. העבר 19 מיקרוליטר של תערובת המאסטר qPCR HRM לכל באר של לוחית התגובה האופטית של 96 בארות. פיפטה מיקרוליטר אחד של הבקרות השליליות, בקרות חיוביות ודגימות לבארות המתאימות של הצלחת לבקרת ללא תבנית או NTC במיקרוליטר אחד של RNA סטרילי ומים חופשיים של DNA המשמשים להכנת תערובת המאסטר qPCR HRM במקום DNA.

אטום היטב את לוחית התגובה עם סרט הדבק האופטי כדי למנוע אידוי במהלך הריצה. ואז סובב אותו ב 780 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. בדוק שהנוזל נמצא בתחתית הבארות בצלחת התגובה והפעל את הבדיקה.

הקצה את הפקדים והדגימות לבארות המתאימות בתוכנת מערכת המכשירים ושנה את פרוטוקול ברירת המחדל של המכשיר ampפרוטוקול. תכנת את המכשיר כמתואר בכתב היד הטקסט לביצוע ניתוח הדיסוציאציה מיד לאחר qPCR. כאשר הריצה מסתיימת סקור ואמת את עלילת ההגברה.

בתפריט הניסוי של תוכנת מערכת המכשירים בחר באפשרות עלילת ההגברה. אם לא מוצגים נתונים, לחץ על לחצן הניתוח הירוק. בכרטיסייה עלילת הגברה מהתפריט הנפתח של סוג העלילה, בחר את העלילה המציגה את נתוני ההגברה כקריאות הקרינה, מנורמל לפלואורסצנציה מההתייחסות הפסיבית כפונקציה של מספר המחזור, בתפריט הנפתח של צבע העלילה, בחר מדגם.

מהתפריט הנפתח סוג גרף, בחר את סוג גרף ההגברה הליניארית, ודא שמחזור ההתחלה והסיום של קו הבסיס מוגדר כהלכה. יש להגדיר את מחזור הסיום כמה מחזורים לפני מספר המחזור שבו מזוהה אות פלורסנט משמעותי. מהתפריט הנפתח של סוג הגרף, בחר את יומן 10 הגברה סוג גרף הצג את קו הסף בגרף על ידי בחירה באפשרות הסף והתאם את הסף.

קו הסף צריך לחצות את השלב המעריכי בעקומות qPCR. ודא שלכל בארות הדגימה והבקרה החיובית יש עקומות הגברה תקינות ושאין הגברה בבארות NTC. תרשים הגברה רגיל מראה עלייה אקספוננציאלית בתפרחת העולה על הסף בין מחזורים 15 ל -35.

בעקומות ההיתוך הנגזרות סקור את אזורי ההיתוך או קווי הטמפרטורה לפני ואחרי ההיתוך. האזורים שלפני ואחרי ההיתוך צריכים להיות באזור שטוח שבו אין פסגות או שיפועים גדולים ברמות הפלורסנט. במידת הצורך הגדר את ההתחלה והעצירה של קווי הטמפרטורה לפני ואחרי ההיתוך, במרחק של כ-0.5 מעלות צלזיוס זה מזה.

הפעל מחדש את הניתוח אם הפרמטרים מותאמים על ידי לחיצה על כפתור הניתוח. בכרטיסיית הגדרות העלילה של לשונית סיר ההבדל, בחר אחד מבקרי הסוג הפראי המשוכפלים כ-DNA הייחוס והפעל מחדש את הניתוח על ידי לחיצה על כפתור הניתוח. בלשונית עקומות ההיתוך המיושרות, אשר שלכל הבקרות החיוביות יש את הגנוטיפ הנכון ושה-NTC לא הצליח להגביר.

מטבלת הבאר, בחר באר בקרה כדי להדגיש את עקומת ההיתוך המתאימה בעלילות הניתוח ולאשר שצבע הקו תואם את הגנוטיפ הנכון. בכרטיסייה עקומות התכה מיושרות סקור בקפידה את תצוגות העלילה עבור הדגימות הלא ידועות והשווה אותן לתצוגות העלילה עבור פקדים. בחר את הבארות המכילות את שכפולי הדגימה הלא ידועים ויישר את עקומות ההיתוך עם הפקדים ברצף מסודר על ידי בחירת הבארות המכילות פקדים בזה אחר זה.

נתח את התוצאה עבור המדגם הלא ידוע בכרטיסיה התוויית הפרש כדי לוודא שהתוצאות המתקבלות עקביות. בחר את הבארות המכילות את שכפולי הדגימה הלא ידועים ויישר את עקומות ההיתוך עם הפקדים ברצף מסודר, ובחר את הבארות המכילות פקדים בזה אחר זה. יש להריץ את מוצרי qPCR HRM על ג'ל טרומי 4% אגרוז המכיל זן חומצות גרעין פלואורסצנטיות.

הפעל רק NTC שלילי חיובי אחד ודגימת qPCR HRM משוכפלת. הסר את הג'ל הטרומי ואת הקסטה מהאריזה, ולאחר מכן הסר את המסרק והכנס את הג'ל למכשיר בהתאם להוראות היצרן. יש לדלל דגימה של 10 מיקרוליטר ל-20 מיקרוליטר ב-RNA סטרילי ומים נטולי DNA ולטעון כל באר ב-20 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת.

מדללים שלושה מיקרוליטרים של תמיסה סטנדרטית בגודל DNA ל-20 מיקרוליטר וטוענים אותה לבאר הסמן. מלאו בארות ריקות ב-20 מיקרוליטר של RNA סטרילי ומים ללא DNA. בחר מיד את התוכנית בהתאם לאחוז הג'ל המופעל והגדר את זמן הריצה במכשיר ל-20 דקות.

התחל את האלקטרופורזה תוך דקה אחת מטעינת הדגימות. לאחר השלמת האלקטרופורזה, דמיין את ה-DNA והג'ל באמצעות אור כחול או תאורת UV. ואזור העניין של ה-DNA המוגבר בהצלחה עם עלייה אקספוננציאלית בפלואורסצנטים החורגת מהסף בין מחזורים 15 ו-35 וערכים צרים מאוד של מחזור הכימות בכל השכפולים והבקרות הוא תנאי מוקדם לזיהוי אמין של שונות גנטית על ידי ניתוח התכה ברזולוציה גבוהה.

ניתוח HRM מבוצע מיד לאחר qPCR, אזורי ההיתוך הפעילים של הדגימות, הפקדים וה-NTC משמשים ליצירת עלילות עקומת ההיתוך המיושרות שלהם. אזורים מוגדרים נכון לפני ואחרי ההיתוך חשובים להדמיה נכונה וזיהוי שונות גנטית בדגימות. עקומות התכה מיושרות ועציצים שונים מוצגים כאן.

הדגימות הלא ידועות מיושרות היטב עם אחד מבקרות הביקורת החיוביות. אזורים או קווי טמפרטורה שנקבעו באופן שגוי לפני ואחרי ההיתוך מביאים לעקומות התכה מיושרות ולחלקות שונות שבהן זיהוי נכון של השונות הגנטית קשה יותר. ניתן לזהות את הגרסה הגנטית בדגימה על ידי השוואת דפוס הלהקה של הדגימה לבקרות.

ועל ידי שילוב של HRM ואלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. זיהוי נכון של וריאנטים גנטיים יכול להיעשות רק עבור דגימות המכילות את אותו וריאנט גנטי כמו אחד מבקרות המשמשות בבדיקת HRM. דגימות המכילות וריאנטים גנטיים נדירים של קלרטיקולין נבדלות בתוצאת HRM ובדפוס פס האלקטרופורזה.

כאשר מנסים פרוטוקול זה, חשוב להשוות בקפידה את תצוגות עלילת עקומת ההיתוך המיושרת של הדגימות הידועות והבקרה.