מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר שימוש במערכות תרגום קיימות ללא תאים לניתוח מולקולה בודדת של תרגום איקריוטי פעיל. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא שומרת על תכונות תרגום בתפזורת, מספקת רזולוציה של מולקולה בודדת והיא פשוטה יחסית להתאמה ממבחני תרגום בתפזורת אחרים. ניתן ליישם שיטה זו על כל מערכת תרגום ללא תאים שאומתה כדי לאפשר תרגום יעיל תלוי מכסה בתנאים בכמות גדולה.

מדגימים את ההליך הונגיון וואנג, עמית מחקר, ואנתוני גאבה, מדען מחקר בכיר ממעבדת שיאוהוי קו. לפחות שלוש שעות לפני ביצוע ניסוי במולקולה בודדת, הפעל את חממת המיקרוסקופ והפחית את זרימת האוויר לקצב נמוך כדי למנוע הפרעה אקוסטית מוגזמת של הניסוי. לאחר מכן הגדר את טמפרטורת החממה לטמפרטורה האופטימלית הספציפית למערכת התרגום נטולת התאים.

לפחות שעה לפני הניסוי, לחץ על לחצן הפעלת הלייזר מאחורי קופסת הלייזר, סובב את מפתח בטיחות הלייזר ולחץ על כפתור ההתחלה כדי להפעיל את הלייזר. הפעל את המיקרוסקופ ובחר את מצב ההדמיה, המטרה וערכת המסננים. הפעל את מצלמת EMCCD, את בקר ה-stage, את משאבת המזרק ואת המחשב ופתח את המצלמה, הלייזר, ה-stage הממונע ותוכנת משאבת המזרק.

בתוכנת בקרת הלייזר, לחץ על התחבר כדי להגדיר את עוצמת הלייזר, בטל את הסימון בתיבת התריס ולחץ על שליטה כדי לגרור את פס ההחלקה של העוצמה בחלון המוקפץ של בקרת הלייזר. הזן את עומק החדירה כדי לכוון את הלייזר לזווית הרצויה ואשר שתיבת התריס סגורה כדי לשמור על הלייזר במצב כבוי כאשר לא מצלמים. כאשר המצלמה התקררה והתייצבה לטמפרטורת העבודה המיועדת לה, בתוכנת המצלמה, בחר קינטי למצב הרכישה והזן את זמן החשיפה, אורך הסדרה הקינטית ופרמטרי ערך הרווח של הכפלת האלקטרונים.

בחרו בספרייה והקצו שמות קבצים לשמירת קובץ תמונת הנתונים. הגדר את משאבת המזרק לקצב זרימה צנוע עד מהיר והוסף 500 מיקרוליטר של 70% אתנול לצינור מיקרופוגה. הכנס את קצה צינור משאבת המזרק לתמיסת האתנול והשתמש בתוכנת משאבת המזרק כדי להחליף את משאבת המזרק בין מצבי הנסיגה והחלוקה כדי לשטוף את הצינור שלוש פעמים באתנול ושלוש פעמים במים ללא RNase.

לאחר שטיפת המים האחרונה, טפחו את קצה הצינור על מגבון טישו נקי כדי להסיר שאריות מים מהחלק הפנימי של הצינור והנח את קצה הצינור לתוך צינור מיקרופוגה נקי. עבור קיבוע mRNA ביוטיניל עם שלושה קצה ראשוני, הנח את תא הזרימה לתוך מחזיק דגימת המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה כלפי מטה ואבטח את החדר בעזרת סרט. השתמש בסרט כדי לכסות את כניסות ויציאות תעלת הזרימה שאינם בשימוש והוסף פי 1.5 נפח של תמיסת סטרפטווידין של 200 מיקרוגרם למיליליטר לתעלת הזרימה.

לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, יש לשטוף ולנגב את התעלה שלוש פעמים בנפח פי שלושה ממאגר הכביסה T50 לכל שטיפה ורקמת המעבדה המקופלת. לאחר הכביסה האחרונה, הניחו טיפת שמן טבילה על מטרת המיקרוסקופ והניחו את המחזיק והתא על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן קרב את המטרה לכיסוי עד ששמן הטבילה על האובייקט יוצר קשר עם הכיסוי והזיז את הדגימה stage כך שמיקום תעלת הזרימה יהיה ישירות מעל עדשת האובייקט.

במסך המגע של בקרת המיקרוסקופ, בחר בלשונית המיקוד ולחץ על חיפוש פוקוס והתחל. צפצוף יישמע כאשר מישור המיקוד יושג בהצלחה. בתוכנת המצלמה, בחר במצב חי.

בתוכנת בקרת הלייזר, פתח את תריס הלייזר והתאם את רמת עוצמת הלייזר. התבונן בתמונת הקרינה בזמן אמת במצב חי ובמסך המגע של בקרת המיקרוסקופ באמצעות בקרת הצעד העדין כדי להתאים את מיקום המטרה. בתוכנת המצלמה, הזז את ה-stage כדי להעריך את רמת הרקע הקרינה באזורים שונים של משטח זיהוי ערוץ הזרימה.

אם הקרינה נמוכה, הפסק את מצב החי וסגור את תריס הלייזר בתוכנת בקרת הלייזר והחלף את מאגר הכביסה מתעלת הזרימה בנפח פי שניים מתמיסת ה-mRNA הביוטינילית. לאחר 15 דקות, שטפו את התעלה שלוש פעמים בנפח גדול פי שלושה מהמאגר התואם לתרגום בכל שטיפה. לזיהוי מולקולה בודדת, הרכיבו פי שלושה מנפח תערובת התרגום הטרייה שהופשרה ללא mRNA והוסיפו ריכוז אופטימלי של נוגדנים עם תווית פלואורסצנטית בצינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח וסובבו לזמן קצר את הצינור כדי לאסוף את התערובת בתחתית הצינור.

העבירו את תערובת התרגום לחלק הפנימי של מכסה צינור מיקרופוגה בנפח 700 מיקרוליטר והגדירו את משאבת המזרק למצב נסיגה. הכנס את קצה צינור המשאבה לתערובת התרגום והתחל בנסיגת המזרק. כאשר תערובת התרגום נכנסה לחלוטין לצינור המשאבה, עצור את הנסיגה, הפוך את הגדרות משאבת המזרק למצב חלוקה והגדר את הזרימה לקצב אופטימלי לאספקת תערובת התרגום.

הפעל ועצור את המזרק כדי לאפשר לתערובת התרגום להגיע לקצה הצינור לפי הצורך והכנס את קצה צינור המשאבה לכניסה של תעלת הזרימה, תוך הקפדה על מניעת בועות. הברג את תושבת המתכת בהתאמה אישית על לוחית מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ כדי לייצב את החיבור ולהעריך את מיקוד המיקרוסקופ ואת הקרינה של אזור ההדמיה. ודא שהפרמטרים של רכישת הסרט נכונים וששם הקובץ והספרייה המתאימים הוזנו לשמירת הקבצים.

הזז את ה-stagכדי לאפשר הדמיה של אזור במרכז משטח זיהוי ערוץ הזרימה. ותחת הכרטיסייה AF רציף, לחץ על כפתורי ההתחלה. צפצוף יישמע כאשר מישור מיקוד הושג בהצלחה.

לאחר הפחתת האור הסביבתי, פתח את תריס הלייזר ולחץ על כפתור האות כדי להתחיל בהקלטה. לאחר חמש שניות, הזן את פקודת ההפעלה כדי להעביר את תערובת התרגום לערוץ הזרימה. לאחר מכן הקלט את הנתונים עד שעתיים ברזולוציה של 0.5 עד שתי שניות לכל זמן פריים.

כדי לנתח אירועי קשירה של Cy3 ANTI-FLAG, עוצמות הקרינה של כתמי דגל אלפא נבחרים של Cy3 חושבו מסגרת אחר מסגרת עבור הסרט כולו וחוברו ליצירת מסלול עוצמה. מסלולים גולמיים יכולים להיראות רועשים ועשויים לדרוש עידון עם מסנן לא ליניארי קדימה/אחורה כדי להפחית את רעשי הרקע. ניתן להשיג חידוד נוסף באמצעות אלגוריתמים לזיהוי צעדים כדי לבצע דיגיטציה של מסלולים.

קשירת נוגדנים לפוליפפטיד מתהווה גורמת לעלייה מיידית בקרינה, ואילו דיסוציאציה של פוליפפטיד נוגדנים גורמת לירידה מיידית בקרינה. היסטוגרמה של זמן השהייה עבור mRNA דגל לוציפראז מתאימה להתפלגות נורמלית לוג ומניבה קצב סינתזה פפטידי של 2.5 פלוס מינוס 0.1 חומצות אמינו לשנייה. היסטוגרמה של זמן ההגעה הראשון מתאימה לפונקציה נורמלית של לוג מוזז, וממחישה את מידת ההטרוגניות הגבוהה בפעילות תרגום mRNA בודד.

כפי שמציינת ההיסטוגרמה, אירוע סינתזת הפפטיד הראשון על מולקולות mRNA בודדות של דגל לוציפראז יכול להתחיל כבר בשתי דקות ומאוחר עד 20 דקות לאחר מסירת תערובת התרגום. בהשוואה לתרגום עם mRNA דגל לוציפראז, ההיסטוגרמה הראשונה של זמן ההגעה עם תרגום mRNA של דגל לוציפראז הראתה קשירת נוגדנים איטית יותר. עם זאת, שימוש במדידות זוהר בתפזורת מתגובות תרגום נטולות תאים עם אותם mRNAs אינו פותר הבדלים בקינטיקה של התרגום.

רזולוציית המולקולה הבודדת של בדיקה זו מספקת תובנות קינטיות יותר של תרגום תלוי כובע שלא ניתן להשיג בקלות בגישות אחרות. תרגום אוקריוטי נטול תאים רגיש לשינויים קטנים ולתנאי ניסוי. לכן, תשומת לב לפרטים ועקביות הם קריטיים בעת שימוש בבדיקה זו כדי לזהות במדויק הבדלים קטנים בתרגום.