Name: פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד הכנת דגימות קריסטלוגרפיה סדרתית באמצעות מזרק זכוכית וחומר צמיג Lipidico בסנכרון האוסטרלי. שיטה זו מאפיינת גבישי חלבון בחומרים רכים וממזערת בזבוז דגימות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המצוינות של מועצת המחקר האוסטרלית בהדמיה מולקולרית מתקדמת (CE140100011) (http://www.imagingcoe.org/). מחקר זה נערך בחלקו באמצעות קרן MX2 ב Synchrotron האוסטרלי, חלק ANSTO, ועשה שימוש בגלאי הקרן האוסטרלית לחקר הסרטן (ACRF).

1. הכנת גבישים במדיה צמיגה גבוהה באמצעות מזרקי זכוכית
<ol><li>צנטריפוגה פתרון גביש בעדינות (~ 1,000 x גרם, ~ 10 דקות ב 22 מעלות צלזיוס) כדי ליצור גלולת גביש רך ולהסיר את החיץ עודף. זה יגרום ריכוז גבוה של גבישים גלולה אשר ניתן להשתמש בהם לאיסוף נתונים. הערה: כדי למנוע דילול של התקשורת הצמיגת להגדיל את ריכוז הגביש בשלב זה. לייעל את היחס בין מדיה צמיגה לנפח גביש עבור כל מדגם כדי לקבל ריכוז גבוה של גבישים תוך שמירה על צמיגות גבוהה עבור התקשורת. צנטריפוגה פתרון גביש כדי ליצור גלולה ולהסיר חיץ עודף כדי להגדיל את ריכוז הגביש בתמיסה, כמתואר Darmanin et. אל.29.</li>
	<li>הגדר שני מזרקים 100 μL עם מצמד.</li>
	<li>הדקו את המצמד לסוף המזרק הראשון והוסיפו 28 μL של תמיסת גביש לחלק העליון של המזרק. לאט, להכניס את הוכנה לתוך החלק העליון של המזרק בעדינות לדחוף את הפתרון עד הסוף של קצה מצמד, הסרת כל בועות אוויר היוצרים. עשה זאת על-ידי ביצוע אחת משתי השיטות הנדונים להלן. הערה: נפח הגבישים שיש להוסיף למדיה הצמיגית הגבוהה יכול להיות מגוון אם זה לא משנה באופן משמעותי את הצמיגות של המדגם הכולל.<ol>
<li>שיטה ראשונה: השתמש בשינויי לחץ מהירים כדי לפוצץ את בועות האוויר.<ol>
<li>מניחים בזהירות אצבע כפפה אחת על החלק העליון של נקודת מחט מצמד קהה (בעדינות רבה) להפעיל לחץ כדי ליצור חותם. אין להפעיל יותר מדי לחץ שכן הדבר עלול לגרום לפציעה במקל המחט.</li>
			<li>עכשיו למשוך את הבוכנה בחזרה כדי למשוך את הפתרון הרחק מנקודת המחט, זה ייצור הצטברות של לחץ במזרק.</li>
			<li>שחררו במהירות את הלחץ בחלק העליון של המזרק על ידי הסרת האצבע הכפפות מקצה המחט הקהה. היזהר, אם המדגם קרוב מדי לקצה כאשר האצבע מוסרת זה עלול לרסס החוצה וכתוצאה מכך אובדן מדגם. השינוי המהיר בלחץ בתוך המזרק יפוצץ את בועות האוויר. חזור על הפעולה עד להסרת כל הבועות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>שיטה שנייה: שימוש ב'צנטריפוגה האנושית' להסרת בועות אוויר.<ol>
<li>מניחים את המזרק ביד אחת עם המחט פונה כלפי מעלה ואת הבוכנה תקוע בין שתי אצבעות, כך שהוא לא יכול לזוז.</li>
			<li>לסובב במהירות את הזרוע מחזיקה את המזרק בכיוון אחד 2-3 פעמים, הכוח הצנטריפוגלי וכתוצאה מכך על המדגם יאלץ את כל בועות האוויר מתוך המזרק. היזהר, אם נעשה מדגם לאט מדי יכול ללכת לאיבוד.</li>
			<li>בדוק את המזרק עבור בועות אוויר, אם בועות להישאר, לחזור על שלבים 1.3.2.1 – 1.3.2.2 עד שכל בועות האוויר יוסרו.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>באמצעות מרית בסדר, להוסיף ~ 42 μL של שומן סיליקון ואקום גבוה ישירות לחלק העליון של המזרק השני. לדחוף את הוכנה כל הדרך עד הסוף, הסרת כל בועות האוויר ולהבטיח כי אין פער אוויר בסוף המזרק. הערה: ההרכב המדויק של גריז הסיליקון אינו קריטי כפי שהוא פועל כמוביל אינרטי. ערך צמיגות של >10 Pa.s או יחס של כ 60:40 גריז סיליקון לתמיסת גביש הוא אופטימלי להזרקה, עם זאת, זה אפשרי זה עשוי להשתנות בהתאם למאפיינים המדויקים של המדגם. כוונן את נפח תמיסת הגביש שנוספה לשמן הסיליקון כדי לייעל את ריכוז הגביש בתערובת, כמתואר בדיון. מדיה צמיגה גבוהה מלבד גריז סיליקון יכול לשמש כל עוד הם תואמים את המדגם30,31,32,33.</li>
	<li>ודא שאין בועות אוויר באחד משני המזרקים ולחבר את המזרקים יחד באמצעות המצמד. החזק את המזרקים אנכית על ידי אחיזה רק את סוף המזרק כמו חימום המזרק בשל החום שנוצר מאצבעות יכול להשפיע על המדגם.</li>
	<li>מערבבים את המדגם יחד על ידי מדכא בעדינות את הבוכנה בצד תמיסת הגביש, כך שהוא מתערבב לתוך גריז סיליקון ולאחר מכן לדחוף את הבוכנה בצד גריז סיליקון, כך שהוא דוחף את המדגם בחזרה לכיוון הצד פתרון גביש. בעדינות, לחזור על תהליך זה 50 עד 100 פעמים, כך המדגם מעורבב ביסודיות ונראה הומוגני. הערה: אם הגבישים גדלים ישירות במדיה צמיגה מאוד (למשל, שלב מעוקב שומני, LCP), שלבים 1.1–1.6 אינם נדרשים. פרוטוקולים לגידול גבישים בתוך המזרקים ניתן למצוא בליו et.al. 34,35. בצע פרוטוקול זה כדי לדגום איחוד, שלב 10, שבו כל המדגם כלול כעת במזרק אחד ומאגר ההתגבשות מוסר. התוספת של 7.9MAG אינה נדרשת עבור פרוטוקול זה. במקום זאת, להסיר את כל הנוזלים העודפים מן המזרק על ידי בעדינות דוחף את הוכנה למטה במדגם עד נוזל לא נשאר יותר במזרק.</li>
	<li>דמיינו את הגבישים תחת מיקרוסקופ אופטי או דרך המזרק או, לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לחלץ כמות קטנה (~ 1 μL) על מגלשת זכוכית ומניחים תלוש כיסוי על החלק העליון.</li>
	<li>בדוק ריכוז גביש.<ol>
<li>לקבוע את ריכוז הגביש בשמן הסיליקון על ידי ספירת מספר הגבישים באזור מסוים באמצעות תמונות מיקרוסקופ אופטי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, צפיפות גבוהה של גבישים מחולקת באופן אחיד בכל המדיה היא אידיאלית (>106 גבישים / מ"ל) על מנת להשיג שיעור פגיעת גביש גבוה.</li>
		<li>התאם את ריכוז הגביש במזרק על-ידי שינוי היחס בין גבישים למדיה צמיגה בשלבים 1.3 ו- 1.4.<ol>
<li>כדי להקטין את ריכוז הגבישים, לדלל את הגבישים במזרק על ידי הגדלת כמות גריז סיליקון / HV מדיה בשלב 1.4 או על ידי דילול גלולת הגביש בתמיסה עם חיץ התגבשות לפני הגדרת המזרקים בשלב 1.1.</li>
			<li>כדי להגדיל את ריכוז הגביש, להקטין את כמות גריז סיליקון בשלב 1.4 אבל להיות זהיר לא להפחית את הצמיגות מתחת 10 Pa.s. הערה: ריכוז הגביש שדווח כאן היה מותאם עבור מדגם ספציפי זה וגודל גביש. עם זאת, ריכוז הגביש האידיאלי יהיה תלוי בגודל הגביש, גודל הקרן, המחט קוטר פנימי (I.D.), ואת שטף רנטגן האירוע. זה יכול להיקבע משיעור הלהיט עם שיעור פגיעה אופטימלי של ~ 30% נחשב 'טוב'. בפועל, ריכוז הגביש חייב להיות מותאם לדגימות שונות במהלך זמן הקרן כדי להשיג את קצב הפגיעה הרצוי. התחל עם ריכוז גבוה של גבישים, 109 גבישים / מ"ל. ההליך להתאמת ריכוז הגביש ניתן בליו et.al. שלושים ו-35.</li>
		</ol>
</li>
		<li>ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן עד שהמזרק יהיה מוכן לאיסוף נתונים.<ol>
<li>אם הגבישים גדלים LCP, ואז לאטום אותם ולתת להם להישאר במזרקים עד כמה ימים בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>אם הגבישים הועברו למדיה צמיגה גבוהה אחרת (למשל, גריז סיליקון), אז בדיקת יציבות של הגבישים לאורך זמן צריך להתבצע לפני המדידה. פעולה זו תקבע כמה זמן הקריסטלים יציבים במדיה האינרטית (באופן אידיאלי > 8 שעות) ואת מגבלת הזמן לאיסוף נתונים. כאן, גבישי lysozyme היו יציבים במשך ימים בשומן סיליקון ולא הראו סימנים של המסה כאשר נבדק באמצעות מיקרוסקופ אופטי.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים את כל הדגימה למזרק אחד לפני ניתוק המצמד. נתק את המצמד מהמזרק וחבר את מחט ההזרקה. בורג המחט בחוזקה לתוך הבסיס של המזרק ולהבטיח כי הוא מהודק בחוזקה כדי למנוע דליפות. 108 מיקרומטר I.D. מחט (אורך מחט 13 מ"מ, סגנון נקודה 3) שימש לניסוי זה. בהתאם לגודל הגביש וגודל הקרן לצרף גם 51 מיקרומטר או 108 μm I.D. מחט. הערה: בדיקה מוקדמת של זרם המדגם לפני זמן הקרן נדרשת כדי להיות מסוגל לבחור את גודל מחט המזרק הנכון. בהתאם למאפייני המדגם (כלומר, צמיגות, טעינה, הרכב חיץ) ותודעת המחט, הדגימות יזרמו באופן שונה. לכן, מומלץ לבדוק מגוון גדלי מחטים כדי לייצר את הזרם היציב ביותר עם המחט הקטנה ביותר האפשרית לתקליטור כדי למקסם את יחס האות לרעש במהלך איסוף הנתונים.</li>
	<li>אם המזרק כבר נטען ומיושר על קו הקרן לעבור לסעיף 3 ולהרכיב את המזרק מדגם ישירות על המזרק. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.</li>
</ol>2. הרכבה ובקרה של מזרק
<ol><li>תרכיב את המזרק על קו הקורה. הסר את הזרבובית הקריוגנית על קו הקורה MX2 והחליף אותו במזרק. שחררו את בורג ההידוק שמחזיק את הזרבובית הקריוגנית וחברו אותה למסגרת הממוקמת בסמוך לשלב הממונע.</li>
	<li>הרם את המזרק מהעגלה שלו על ידי החזקת הידית השחורה והנח אותו על הבמה הממונעת.<ol>
<li>כדי להדק את המזרק לשלב הממונע; היד להדק את ידית בורג הידוק שחור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הר מזרק ריק על המזרק<ol>
<li>בממשק בקרת המחשב מזרק (כלומר, תוכנת בקרת מיקום EPOS), בחר מצב ביות תחת כלים בתפריט התוכנה. לאחר מכן בחרו 'מתג הגבלה שלילית' והתחילו להתביית, תנו לתוכנה לפעול עד שהבורג יתבטל מספיק כדי שהמזרק יתאים מתחת לבורג. אם נותר להפעיל ללא השגחה מתג המגבלה עוצר את הבורג באופן אוטומטי.</li>
		<li>הר מזרק ריק ('דמה') על המזרק על ידי החדרת המחט דרך החריץ במחזיק המזרק. תיישר את המזרק כנגד הסוגר.</li>
		<li>הדק את המזרק עם שתי אורינגים.<ol>
<li>לעטוף את O-ring הראשון על פני החלק האמצעי של המזרק חיבור אותו ווים משני צדי המזרק.</li>
			<li>לולאה O-ring השני סביב הקרסים בחלק העליון של המזרק ולאחר מכן לשים חלק אחד של O-ring על החלק העליון של מזרק זכוכית כפי שמוצג בהדגמה איור 1B.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>יישור המזרק לקרן רנטגן<ol>
<li>הזז את השלב הממונע עם המזרק לכיוון נקודת האינטראקציה של קרני הרנטגן באמצעות תוכנת הבקרה של קו הקרן. ניתן לדמיין זאת באמצעות המצלמה בתוך השורה. הגודל והמיקום של הקרן מסומנים על ידי צלב אדום על המסך ואת השלב הממונע ניתן להזיז כדי ליישר את המחט עם אזור אינטראקציית רנטגן.</li>
		<li>להתאים את המיקום x ו- y של הבמה כדי ליישר את המחט עם הצלב האדום.</li>
		<li>כוונן את תנוחת z עד קצה המחט נכנס לפוקוס.</li>
		<li>ודא יישור של קצה המחט וקרן רנטגן חזותית על ידי בדיקה כי קצה המזרק פוגש את הכוונת אשר גלויים בתמונה מיקרוסקופ אופטי שנוצר על ידי המצלמה קרן.</li>
		<li>לאחר קצה המחט מיושר להזיז את הקצה מעל שערות הצלב ~ 100 מיקרומטר. זה מבטל פיזור רנטגן מקצה המחט. הערה: הרכבה ויישור של המזרק על קו הקורה MX2 בסנכרון חייב להתבצע על ידי מדעני קו הקרן וניתן להשלים אותו תוך פחות מ-30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הרכבה של מזרק המדגם
<ol><li>החלף את המזרק הריק במזרק לדוגמה על-ידי ביצוע שלב 2.3.</li>
	<li>מניחים את מכסה המזרק על ראש בוכנה מזרק מדגם.</li>
	<li>הזז את בורג הכונן לחלק העליון של המכסה.</li>
	<li>בתוכנת בקרת המזרק בחר מצב מהירות.</li>
	<li>קלט 3000 סל"ד (~ 115 nL/s) כערך ההגדרה והקשה על החל ערך הגדרה.</li>
	<li>כאשר בורג הכונן נוגע בכובע על ראש הכועסה המזרק, לעצור את המנוע.<ol>
<li>הגדר את ערך הסל"ד לאפס בתוכנת בקרת המזרק על-ידי שינוי ערך ההגדרה ל- '0' כאשר הבורג מתקרב למכסה.</li>
		<li>לאחר יצירת מגע, הפעל את הערך המוגדר מראש על-ידי הקשה על החל הגדרת ערך כדי לעצור את הבורג באופן מיידי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בעדינות לנענע את הכובע כדי לוודא שהוא מוחזק בחוזקה במקום. הערה: בכל פעם שמוזנים ערך ערכה חדש בתיבה הגדרת ערך בתוכנת הבקרה הוא מופעל רק לאחר הקשה על החל ערך הגדרה.</li>
</ol>4. הפעלת המזרק
<ol><li>לאחר בורג כונן כובע יצר קשר איתן עם החלק העליון של הכוכנה לשנות את סל"ד הגדרת ערך ל 100. זה שווה ערך ~ 4 nL / s.</li>
	<li>ויזואלית לבדוק את קצה המחט כאשר המדגם הראשון יוצא או להסתכל על תמונת המצלמה beamline של המחט להתבונן כאשר המדגם מתחיל להבליט מקצה המחט.</li>
	<li>לבצע חיפוש של האץ', לסגור את דלת האץ', ולהדליק את קרן הרנטגן. מנקודה זו יש להפעיל את המזרק מרחוק מחוץ לאצרף.</li>
	<li>כוונן את הסל"ד עד להיווצרות זרם יציב.<ol>
<li>הקטן את ערך הגדרת הסל"ד ל- 90.</li>
		<li>חזור על שלב 4.4.1, הפחתת ערך הגדרת סל"ד במרווחים של 10, כדי להאט את הזרם אך עדיין לשמור על זרם יציב. עבור גריז סיליקון נעשה שימוש בערך של 30 סל"ד. הערה: טווח הסל"ד הטיפוסי נע בין 30 ל-100 סל"ד (1 - 4 nL/s) בהתאם למאפייני הדגימה ולזמן החשיפה לרנטגן. באופן כללי, יש לכוונן את הסל"ד כדי לייצר את קצב הזרימה האיטי ביותר (כדי למזער את צריכת הדגימה) תוך שמירה על זרם יציב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניהול זרם לדוגמה שאינו זורם היטב.<ol>
<li>המשך להגדיל את ערך הגדרת הסל"ד במרווחים של 10 עד שהזרם יתיישר. אם הזרם אינו מתייצב, גם לאחר הגדלת ערך הגדרת הסל"ד לערך המרבי של 100 סל"ד נסה לשפר את היציבות על-ידי יישום אחת משתי השיטות המתוארות להלן.<ol>
<li>שיטה ראשונה: הוסף לוכד מדגם פוליסטירן מתחת לזרם לדוגמה כדי לסייע בהנחיית הדגימה. שיטה זו פועלת היטב עבור זרמי מדגם טעונים מאוד.</li>
			<li>שיטה שנייה: הכנס משפך יניקה venturi לתופס מדגם. כדי לספק אוויר למשפך, חבר אותו לצינור שקע האוויר הממוקם בצריף. שיטה זו יכולה לסייע בהכוונה ובייצוב זרימת הדגימה ללא תלות במטען הנחל.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר שיושג זרם קבוע ויציב, התחל איסוף נתונים ומטב את מרחק הגלאי לפי ניסוי קריסטלוגרפיה רגיל של קרני רנטגן. הערה: הסל"ד מומר לקצב זרימה באמצעות טבלת ההמרות שסופקה במידע המשלים, 'מחשבון ההתקנים של Lipidico'. הזן את ערך הסל"ד, קטרי המחט ונפחי המזרק כדי לחשב את קצב הזרימה באמצעות מחשבון זה.</li>
</ol>

<ol><li>Boutet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+protein+structure+determination+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution protein structure determination by serial femtosecond crystallography.</a> Science. 337 (6092), 362-364 (2012).</li>
<li>Spence, J. C. H., Weierstall, U., Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+lasers+for+structural+and+dynamic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">X-ray lasers for structural and dynamic biology.</a> Reports on Progress in Physics. 75 (10), 102601(2012).</li>
<li>Aquila, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+protein+nanocrystallography+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser.</a> Optics Express. 20 (3), 2706-2716 (2012).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> International Union of Crystallography. 2, 246-255 (2015).</li>
<li>Lee, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nylon+mesh-based+sample+holder+for+fixed-target+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nylon mesh-based sample holder for fixed-target serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 9, 6971(2019).</li>
<li>Martin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation+X-ray+diffraction+reveals+three-dimensional+nanostructure+and+disorder+in+self-assembled+lipid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Materials%22%5BJournal%5D)">Fluctuation X-ray diffraction reveals three-dimensional nanostructure and disorder in self-assembled lipid phases.</a> Communications Materials. 1 (1), 1-8 (2020).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+fixed-target+serial+virus+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed fixed-target serial virus crystallography.</a> Nature Methods. 14 (8), 805(2017).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-81 (2011).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nature Communications. 5, 3309(2014).</li>
<li>Weierstall, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+sample+delivery+techniques+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B-Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Liquid sample delivery techniques for serial femtosecond crystallography.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 369 (1647), 20130337(2014).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+delivery+media+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Sample delivery media for serial crystallography.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1094(2019).</li>
<li>Batyuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+phasing+of+x-ray+free-electron+laser+data+for+a+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor.</a> Science Advances. 2 (9), 1600292(2016).</li>
<li>Kern, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+intermediates+of+Kok%27s+photosynthetic+water+oxidation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the intermediates of Kok's photosynthetic water oxidation clock.</a> Nature. 563 (7731), 421(2018).</li>
<li>Suga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxyl%2Foxo+mechanism+for+oxygen-oxygen+coupling+in+PSII+revealed+by+an+x-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An oxyl/oxo mechanism for oxygen-oxygen coupling in PSII revealed by an x-ray free-electron laser.</a> Science. 366 (6463), 334-338 (2019).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Pande, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+structural+dynamics+drives+the+trans%2Fcis+isomerization+in+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein.</a> Science. 352 (6286), 725-729 (2016).</li>
<li>Ishigami, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot+of+an+oxygen+intermediate+in+the+catalytic+reaction+of+cytochrome+c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Snapshot of an oxygen intermediate in the catalytic reaction of cytochrome c oxidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3572-3577 (2019).</li>
<li>Nango, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+movie+of+structural+changes+in+bacteriorhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin.</a> Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+isomerization+in+bacteriorhodopsin+captured+by+a+femtosecond+x-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser.</a> Science. 361 (6398), (2018).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+millisecond+crystallography+of+membrane+and+soluble+protein+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation.</a> International Union of Crystallography. 4, 439-454 (2017).</li>
<li>Berntsen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+millisecond+crystallography+instrument+at+the+Australian+Synchrotron+incorporating+the+%22Lipidico%22+injector%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">The serial millisecond crystallography instrument at the Australian Synchrotron incorporating the "Lipidico" injector.</a> Review of Scientific Instruments. 90 (8), 085110(2019).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 71, 387-397 (2015).</li>
<li>DePonte, D. P., Nass, K., Stellato, F., Liang, M., Chapman, H. N. Sample injection for pulsed X-ray sources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDePonte%2C+DP+%22Advances+in+X-Ray+Free-Electron+Lasers%3A+Radiation+Schemes%2C+X-Ray+Optics%2C+and+Instrumentation%3A+Proceedings+of+Society+of+Photo-Optical+Instrumentation+Engineers%22">Advances in X-Ray Free-Electron Lasers: Radiation Schemes, X-Ray Optics, and Instrumentation: Proceedings of Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers</a>. Tschentscher, T., Cocco, D. , Prague, Czech Republic. 8078(2011).</li>
<li>Park, S. Y., Nam, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+delivery+using+viscous+media%2C+a+syringe+andasyringe+pump+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Sample delivery using viscous media, a syringe andasyringe pump for serial crystallography.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26, 1815-1819 (2019).</li>
<li>Shimazu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-viscosity+sample-injection+device+for+serial+femtosecond+crystallography+at+atmospheric+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">High-viscosity sample-injection device for serial femtosecond crystallography at atmospheric pressure.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1280-1288 (2019).</li>
<li>Kovacsova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+hydrophilic+injection+matrices+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography.</a> International Union of Crystallography. 4, 400-410 (2017).</li>
<li>Darmanin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+screening+and+characterization+for+serial+femtosecond+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography.</a> Scientific Reports. 6, 25345(2016).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> International Union of Crystallography. 2, 421-430 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oil-free+hyaluronic+acid+matrix+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography.</a> Scientific Reports. 6, 24484(2016).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+of+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> International Union of Crystallography. 2, 545-551 (2015).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Hadian-Jazi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peak-finding+algorithm+based+on+robust+statistical+analysis+in+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">A peak-finding algorithm based on robust statistical analysis in serial crystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 50, 1705-1715 (2017).</li>
<li>Kong, F. W., Yuan, L., Zheng, Y. F., Chen, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Liquid+Handling+for+Life+Science%3A+A+critical+review+of+the+current+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">Automatic Liquid Handling for Life Science: A critical review of the current state of the art.</a> Journal of Laboratory Automation. 17 (3), 169-185 (2012).</li>
</ol>

ח"כ עובד עבור עיצובי Kusel. Kusel Design, מפתחת מכשיר מעבדה מותאמת אישית, הייתה מאורסת על ידי ד"ר פיטר בנסן מאוניברסיטת לה טרובה וד"ר טום קרדוק-דייויס מ- ANSTO ולפתח מכשיר בעלות נמוכה כדי לאפשר מחקרים צמיגים גבוהים בקו קרן MX2 בסינכרוטרון האוסטרלי. המכשיר פותח בהתייעצות הדוקה עם ד"ר קרדוק-דייויס. למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

HVI חלופי פותח, אידיאלי לביצוע ניסויי SX במקורות synchrotron. יש לו שני יתרונות מרכזיים על פני HVIs קיימים. ראשית, קל להתקין על קו הקרן המאפשר מעבר מהיר בין קריסטלוגרפיה קונבנציונלית SX, רק ~ 30 דקות נדרש להתקנה ויישור על MX2. שנית, מזרקי המדגם המשמשים לגידול גבישים יכולים לשמש ישירות כמאגרים להזרקה, הגבלת בזבוז במהלך העברת מדגם. הפרוטוקול לשינוי דוגמאות תואר והוכח. העיצוב מבטל את הצורך בזרם גז מסובך כדי לשלוט במטוס בהשוואה ל- HVIs אחרים. תהליך פשוט לשינוי קצב הזרימה של המזרק הודגם אשר ניתן להתאים ללא תגובה מאוחרת.
<...

קריסטלוגרפיה סדרתית (SX) היא טכניקה שפותחה בתחילה בהקשר של לייזרים אלקטרונים ללא קרני רנטגן (XFELs)1,2,3,4. למרות גישות היעד קבוע יכול לשמש SX5,6,7, בדרך כלל, מערכות מזרק משמשים כדי לספק גבישים בזרם רציף לקרן הרנטגן. מכיוון שהוא משלב נתונים ממספר רב של גבישים, SX נמנע מהצורך ביישור גביש במהלך הניסוי, ומאפשר איסוף נתונים בטמפרטורת החדר8,9. בעזרת מזרק מתאים, הגבישים מוזרמים בזה אחר זה לאזור האינטראקציה של קרני הרנטגן ונתוני עקיפה וכתוצאה מכך נאספים על גלאי אזור9,10. עד כה, SX הצליחה לפתור מספר מבני חלבון1,11,12,13 כולל גבישים קטנים מכדי למדוד באמצעות קריסטלוגרפיה קונבנציונלית. היא גם סיפקה תובנות חדשות על הדינמיקה המולקולרית שנפתרה בזמן על ידי ניצול משך הדופק femtosecond של XFEL. על ידי ייזום תגובות משאבה בדיקה עם מקורות לייזר אופטיים, מחקרים מעמיקים בוצעו על פוטוסיסטם II14,15, חלבון צהוב פוטואקטיבי16,17, ציטוכרום C אוקסידאז18, כמו גם בקטריאורהודופסין19,20,21. מחקרים אלה בדקו את הדינמיקה של העברת אלקטרונים המתרחשת בעקבות הפעלת אור המדגימה את הפוטנציאל המשמעותי של קריסטלוגרפיה סדרתית להבנת תהליכים ביולוגיים שנפתרו בזמן.
פיתוח של קריסטלוגרפיה סדרתית הוא גם הופך נפוץ יותר ויותר במקורות synchrotron9,12,20,22,23,24. SX מבוסס Synchrotron מאפשר למספר גדול של גבישים בודדים להימדד ביעילות בטמפרטורת החדר באמצעות מערכת מזרק מתאימה. גישה זו מתאימה גבישים קטנים יותר ומכאן, בנוסף לדרוש גלאי קצב מסגרות מהיר כדי לאסוף את הנתונים, קרן מיקרו ממוקדת נדרשת גם. בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית, SX אינו כרוך בהרכבה ויישור של גבישים בודדים בקרן הרנטגן. מכיוון שנתונים ממספר רב של גבישים בודדים ממוזגים, ניתן להפחית באופן משמעותי את מינון הקרינה המתקבל על ידי כל גביש בהשוואה לקריסטלוגרפיה קונבנציונלית. ניתן להחיל את Synchrotron SX גם על חקר התגובות שנפתרו בזמן, אפילו עד למשטר אלפיות השניה, בתנאי שגלאי עם קצב מסגרות גבוה מספיק זמין (למשל, 100 הרץ או יותר). מספר ניסויים קריסטלוגרפיים סדרתיים בוצעו בסנכרון באמצעות מזרקים שפותחו בתחילה במקורות XFEL20,22,23. שני הסוגים הנפוצים ביותר של מזרק הם זרבובית וירטואלית דינמי גז (GDVN)25 מזרק צמיג גבוה (HVI)9,24,26,27,28. GDVN הוא אידיאלי להזרקת צמיגות נמוכה, דגימות נוזליות, אבל דורש שיעורי זרימה גבוהים כדי להשיג זרמים יציבים, אשר בתורו מוביל לשיעורי צריכת מדגם גבוהים. לעומת זאת, HVI's מתאימים לדגימות צמיגות גבוהות המאפשרות יצירת זרם יציב בקצב זרימה נמוך בהרבה, מה שמוביל לצריכת מדגם נמוכה בהרבה. מזרק HVI, אם כן, מעדיף משלוח של דגימות שבו נשא צמיג עדיף (למשל, שומנים מבוססי חלבונים קרום) ו / או כמויות גדולות של מדגם אינם זמינים. מזרקי SX הם בדרך כלל מאתגרים לשימוש ודורשים הכשרה נרחבת כדי לפעול. הם כוללים גם פרוטוקולי העברה מדגם ארוכים, כמו המדגם צריך להיות טעון לתוך מאגר מיוחד, זה בדרך כלל יש סיכון גבוה הקשורים אליו של מדגם הולך לאיבוד או "נפח מת" או באמצעות דליפות בחיבורים. לכן, רצוי לייעל את עיצוב המזרק כדי למתן את כל ההפסדים לפני המדגם להגיע קרן רנטגן.
לאחרונה, תוצאות SX הראשון פורסמו באמצעות Lipidico23 עם יעד lysozyme, באמצעות גלאי Eiger 16M. עיצוב מזרק זה מגביל את בזבוז הדגימה על ידי מזעור מספר השלבים המעורבים במעבר מהתגבשות ראשונית להעברת גבישים למזרק ואחריו מסירת דגימה לקרן הרנטגן. כתב יד זה מתאר ומדגים את הליך ההעברה לדוגמה החל מהכנת מדגם, מעבר לתהליך ההזרקה, ולבסוף איסוף נתונים, באמצעות אותו כלי התגבשות. הפעולה של המזרק מתוארת גם.

<table><tbody><tr><td>ליזוזים חלבון תרנגולת</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>משמש לגידול גבישים לבדיקת המזרק והגבישים מועברים לשומן סיליקון. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>שומן סיליקון בוואקום גבוה</td><td>Dow Corning</td><td>Z273554-1EA</td><td>משמש לבדיקת מזרק. https://www.sigmaaldrich.com/</td></tr> <tr><td>מחט מזרק (108 ומיקרו; m ID)</td> <td>המילטון</td><td>חלק מס': 7803-05</td><td>www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>מזרקי זכוכית אטומים לגז, 100 ומיקרו; l</td><td>המילטון</td><td>חלק מס': 7656-01</td><td>מזרקים המשמשים להזרקת דגימה. www.hamiltoncompany.com</td></tr><tr><td>מצמד מזרקים LCP</td><td>Formulatrix</td><td>209526</td><td>מצמד מזרק לערבוב הדגימות</td></tr><tr><td>מזרק ליפידיקו</td><td>La Trobe Univerity/ANSTO</td><td></td><td>זהו ציוד ספציפי שניתן לגשת אליו דרך אוניברסיטת לה טרוב / מתקן הסינכרוטרון האוסטרלי ANSTO</td></tr></tbody></table>

פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי

Lipidico Injection Protocol for Serial Crystallography Measurements at the Australian Synchrotron

מתקן לביצוע מדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות פותח בסנכרון האוסטרלי. מתקן זה משלב מזרק צמיג גבוה שנבנה למטרה, Lipidico, כחלק מקו הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית (MX2) למדידת מספר גדול של גבישים קטנים בטמפרטורת החדר. מטרת טכניקה זו היא לאפשר גידול/העברה של גבישים למזרקי זכוכית ישירות במזרק לאיסוף נתונים קריסטלוגרפיה סדרתית. היתרונות של מזרק זה כוללים את היכולת להגיב במהירות לשינויים בקצב הזרימה ללא הפרעה של הזרם. קיימות מספר מגבלות עבור מזרק צמיגות גבוה זה (HVI) הכוללות הגבלה על צמיגות הדגימה המותרת ל- >10 Pa.s. יציבות זרם יכולה גם להיות בעיה בהתאם למאפיינים הספציפיים של המדגם. פרוטוקול מפורט כיצד להגדיר דגימות ולהפעיל את המזרק למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי מוצג כאן. השיטה מדגימה הכנת המדגם, כולל העברת גבישי lysozyme לתוך מדיה צמיגה גבוהה (גריז סיליקון), ואת הפעולה של המזרק לאיסוף נתונים ב MX2.

ליפידיקו היא HVI שנבנתה כמערכת משלוחים חלופית לשימוש ב-MX2 (איור 1). הוא מתאים באופן אידיאלי עבור SX שבו גבישים גדלים או בשלב מעוקב השומנים או מועברים למדיה אינרטית צמיג גבוהה.
כדי להדגים את יישום מזרק גריז סיליקון מעורבב עם גבישי lysozyme שימש כדי לאסוף נתוני SX בקו הקורה MX2 ב synchrotron האוסטרלי. כדי להרכיב את המזרק על קו ה-MX2, הזרבובית הקריוגנית מוסרת ומוחלפת במזרק כפי שמוצג באיור 1. דגימות המזרק מותקנות ישירות על המזרק ומהודקות...

מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להכין דגימות קריסטלוגרפיה סדרתיות לאיסוף נתונים על מזרק צמיג גבוה, Lipidico, שהוזמן לאחרונה בסנכרון האוסטרלי.

A facility for performing serial crystallography measurements has been developed at the Australian synchrotron. This facility incorporates a purpose built ...

פרוטוקול זה מספק הזדמנות למדענים לאפיין גבישי חלבון המשובצים בחומרים צמיגים מאוד, כמו גם חומרים רכים אחרים שכיום קשה לאפיין באמצעות הגדרות קיימות. בשיטה זו, הדגימות מוכנות במזרקי זכוכית, מותקנות ישירות על המזרק, מה שהופך את מערכת המזרק לקלה לשימוש וממזער את פסולת הדגימה. להכנת גבישים בתווך צמיג גבוה, תחילה צנטריפוגה את תמיסת הגביש במהירות נמוכה ליצירת כדור גביש רך.לאחר הסרת המדיום העודף, מהדקים מצמד לקצה מזרק זכוכית אחד של 100 מיקרוליטר וטוענים 28 מיקרוליטר מתמיסת הגביש לתוך חבית המזרק. הכנס לאט את הבוכנה לחלק העליון של המזרק ודחף בעדינות את התמיסה לקצה קצה המצמד. כדי להסיר בועות, השתמש באצבע אחת עטויה כפפה כדי להפעיל לחץ עדין מאוד על החלק העליון של נקודת המחט הקהה של המצמד כדי ליצור אטימה ולמשוך את הבוכנה כדי למשוך את התמיסה הרחק מקצה המחט כדי ליצור הצטברות לחץ בתוך המזרק, ולאחר מכן הסר את האצבע כדי לשחרר במהירות את הלחץ ולפוצץ בועות בתוך המזרק.לחלופין, החזק את המזרק ביד אחת כשהמחט פונה כלפי מעלה והבוכנה תקועה בין שתי אצבעות וסובב במהירות את הזרוע המחזיקה את המזרק בכיוון אחד פעמיים-שלוש. הכוח הצנטריפוגלי שנוצר יאלץ כל בועות אוויר לצאת מהמזרק. לאחר הסרת כל הבועות, השתמש במרית דקה כדי להוסיף 42 מיקרוליטר של שומן סיליקון בוואקום גבוה ישירות לחלק העליון של מזרק שני של 100 מיקרוליטר ולחץ על הבוכנה עד הסוף כדי להסיר בועות אוויר וכדי להבטיח שאין מרווח אוויר בקצה המזרק.לאחר שכל הבועות הוסרו משני המזרקים, אוחזים בשני המזרקים בקצוות, חבר את המזרקים עם המצמד. כדי לערבב את הדגימות יחד, לחץ בעדינות ברצף הן את תמיסת הגביש והן את בוכנות מזרק שומן הסיליקון 50 עד 100 פעמים עד שהחומרים מעורבבים היטב ונראים הומוגניים. לאחר מכן דמיין את הגבישים תחת מיקרוסקופ אופטי.כדי לקבוע את ריכוז הגביש בשומן הסיליקון, ספרו את מספר הגבישים באזור מסוים באמצעות תמונות המיקרוסקופ האופטי. כדי להפחית את ריכוז הגביש, חזור על הכנת הגביש באמצעות נפח גבוה יותר של שומן סיליקון או דלל את כדור הגביש במאגר התגבשות לפני הגדרת המזרק. כדי להגדיל את ריכוז הגביש, חזור על הכנת הגביש באמצעות נפח קטן יותר של שומן סיליקון, תוך הקפדה לא להפחית את הצמיגות מתחת ל-10 שניות פסקל.לאחר שהתקבל ריכוז הגביש המתאים, העבירו את הדגימה כולה למזרק יחיד והחליפו את המצמד במחט הזרקה בקוטר פנימי של 108 מיקרון המוברגת היטב בבסיס המזרק. כדי להגדיר את המזרק, בחר כלים ומצב ביות ומתג גבול שלילי והתחל ביות ותן לתוכנה לפעול עד שהבורג נסוג מספיק כדי שמזרק של 100 מיקרוליטר יתאים מתחת לבורג. הכנס את המחט של מזרק ריק דרך החריץ במחזיק המזרק כדי להרכיב את המזרק על המזרק וליישר את המזרק כנגד התושבת.עטפו טבעת O אחת על פני החלק האמצעי של המזרק, הצמידו את הטבעת לווים משני צידי המזרק ולולאו טבעת O שנייה סביב הווים בחלק העליון של המזרק. ודא שחלק אחד של טבעת ה-O השנייה ממוקם על גבי מזרק הזכוכית. כדי להכין את מזרק הדגימה, יש להניח את המזרק, להניח את מכסה המזרק על ראש הבוכנה של מזרק הדגימה ולהעמיס את המזרק על המזרק.הזז את בורג הכונן לחלק העליון של המכסה. בתוכנת בקרת המזרק, בחר מצב מהירות והפעל את מצב המהירות. הגדר את ערך ההגדרה ל-3,000 סיבובים לדקה ולחץ על החל ערך הגדרה.כאשר הבורג מתקרב למכסה שעל ראש הבוכנה של המזרק, שנה את ערך ההגדרה לאפס. לאחר יצירת המגע, לחץ על החל ערך הגדרה כדי להפעיל את הערך שנקבע מראש, ועצור את הבורג באופן מיידי. לאחר מכן נענע בעדינות את המכסה כדי לוודא שהוא מוחזק היטב במקומו.כדי להפעיל את המזרק, שנה את ערך ההגדרה ל-100 סיבובים לדקה ובדוק חזותית את הקצה כדי להתבונן בדגימה כשהיא מתחילה להוציא. לאחר סגירת הצריף, הפחת את ערך ההגדרה בהפחתות של 10 עד שנצפה זרם חומר איטי אך יציב. אם זרם הדגימה אינו זורם היטב, הגדל את ערך ההגדרה במרווחים של 10 סיבובים לדקה עד שהזרם יתיישר .אם הזרם אינו מתייצב, הכנס לוכד דגימות פוליסטירן מתחת לזרם הדגימה כדי לעזור בהנחיית הדגימה. לחלופין, הכנס משפך יניקה של ונטורי ללוכד הדגימות, אותו ניתן לחבר לצינור יציאת האוויר הממוקם בצריף של הסינכרוטרון האוסטרלי. כדי לקבוע את קצב הזרימה של הזרם, השתמש במחשבון הזרימה של מכשיר Lipidico.קביעת מהירות ריצת הדגימה האופטימלית עבור המזרק היא חיונית ליציבות הזרם. קצב זרימה איטי מביא להתרחבות של שומן הסיליקון היוצא מהמזרק, בעוד שקצב זרימה מהיר יותר מייצר זרם דק יותר. סלסול של זרם המדיה הצמיג נצפה באופן קבוע.כדי להתגבר על בעיה זו בדגימות טעונות מאוד, ניתן להשתמש בלוכד פוליסטירן כדי להכניס כוח אלקטרוסטטי חלש. בניתוח זה נעשה שימוש במזרק זכוכית המכיל 26 מיקרוליטר של גבישי ליזוזים תלויים בשומן סיליקון. כמות מספקת של נתונים נאספה תוך 38 דקות המאפשרת יצירת מפת צפיפות האלקטרונים המקיפה את קשרי הדיסולפיד במבנה הליזוזים.זכור להשתמש בנפח קטן של דגימה על שקופית הזכוכית כדי להעריך את ריכוז הגביש של הדגימה כדי לקבוע אם יש לתקן את הצמיגות. הרבגוניות של המזרק מאפשרת אפיון רנטגן של חומרים צמיגים אחרים. לדוגמה, מבנים נוזליים יוניים המשתמשים במחקר סוללות או חומרים קולואידים המשתמשים במוצרי חלב.

lipidico-injection-protocol-for-serial-crystallography-measurements

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים נהלים להכנה ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון ממברנה בשלב מעוקב ליפידי עבור קריסטלוגרפיה סדרתית בלייזרים אלקטרונים חופשיים של קרני רנטגן ומקורות סינכרוטרון. ניתן ליישם פרוטוקולים אלה גם לשילוב ואספקה של מיקרו-גבישי חלבון מסיסים, מה שמוביל להפחתה משמעותית בצריכת הדגימה בהשוואה להזרקת נוזלים.

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

פרוטוקול מוצג עבור קריסטלוגרפיה רנטגן באמצעות microcrystals חלבון. שתי דוגמאות ניתוח vivo- microcrystals מגודלים לאחר טיהור או תאמול מושווים.

Microcrystallography של קריסטלים חלבון ו<em&gt; בסולו</em&gt; השתברות

פרוטוקול יעילה לביצוע הביוכימי ומבניים נרחב של איפיון פרוטאין מחייב המצע פחמימות של סטרפטוקוקוס pneumoniae מוצג.

אפיון הביוכימי ומבניים של SP0092 המצע-מחייב-חלבון פחמימות תחבורה

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לפברק ופועלים microfluidic התקנים עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. בנוסף, הוא מתאר כיצד לפקח התגבשות חלבונים על ידי פיזור אור דינאמי וקיבלתי כיצד לעבד ולנתח נתונים עקיפה.

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

ההצלחה של ניסוי קריסטלוגרפיה הפמטו-זמן לפתור שנייה טורי תלויה משלוח הדגימה היעילה. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים כדי למטב את ההבלטה של bacteriorhodopsin microcrystals של מזרק מיקרו-הבלטה צמיגות גבוהה. המתודולוגיה מתבססת על מדגם המגון עם מצמד-כיוונית הרומן והדמיה עם מצלמה במהירות גבוהה.

שיפור ההבלטה צמיגות גבוהה של Microcrystals עבור זמן לפתור את טורי קריסטלוגרפיה הפמטו-שנייה-רנטגן לייזרים

אנו מציגים מדריך מקיף להכנת מדגם יעד קבוע, איסוף נתונים ועיבוד נתונים עבור קריסטלוגרפיה סינכרוטרון סדרתית בקו קרן יהלום I24.

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת מדגם קריוגני והעברת גבישים לתוך תחנת הקצה ואקום על קו קרן I23 במקור אור יהלום, לניסויים קריסטלוגרפיה באורך גל ארוך רנטגן מקרומולקולרי.

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש בצינורות הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית האוטומטית לניתוח מורכב של חלבון למבנה, ניתוח מורכב מהיר של חלבון ליגנד והקרנת שברים בקנה מידה גדול המבוססת על טכנולוגיית CrystalDirect במעבדת HTX ב- EMBL Grenoble.

צינורות הקריסטלוגרפיה האוטומטית במתקן EMBL HTX בגרנובל

תרומה זו מתארת כיצד להגדיר התגבשות חלבונים בהתקני גביש על גביש וכיצד לבצע איסוף נתונים סדרתי אוטומטי בטמפרטורת החדר באמצעות פלטפורמת ההתגבשות על השבב.

התגבשות על השבב ודיפרקציה טורית בקנה מידה גדול בטמפרטורת החדר

אנו מציגים פרוטוקול להתגבשות חלבונים באמצעות מתקן ההתגבשות במתחם המחקר בהארוול ולאחר מכן באתרו איסוף נתונים קריסטלוגרפיים מקרני רנטגן מגבישים בתוך הלוחות בקריסטלוגרפיה מקרומולקולרית רב-תכליתית באתרו (VMXi) של דיאמונד. אנו מתארים דרישות לדוגמה, פרוטוקולי התגבשות והנחיות לאיסוף נתונים.

התגבשות ואיסוף נתונים באתרם של טמפרטורת החדר באמצעות מתקן ההתגבשות בהארוול וב-Beamline VMXi, Diamond Light Source

למד הכנת דגימות קריסטלוגרפיה סדרתית באמצעות מזרק זכוכית וחומר צמיג Lipidico בסנכרון האוסטרלי. שיטה זו מאפיינת גבישי חלבון בחומרים רכים וממזערת בזבוז דגימות.

פרוטוקול הזרקת ליפידיקו למדידות קריסטלוגרפיה סדרתיות בסנכרון האוסטרלי

גלה סרטונים נוספים