כימות המיקרו-סביבה של גידול גרורתי במוח באמצעות דגם תלת-מימד של שבב איבר-און-איי, למידת מכונה וטומוגרפיה קונפוקלית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להכנת ואיסוף של מחסום דם במוח גרורתי מיקרו סביבה ולאחר מכן לכמת את מצבה באמצעות הדמיה confocal ובינה מלאכותית (למידת מכונה).

טומוגרפיה confocal פותחה כדי להשיג את מכלול מלא של התנהגויות תאים סרטניים, כפי שהם אינטראקציה עם מחסום הסלולר נישה. שיטה זו מספקת בסיס ללימוד גרורות בעת התרחשותן. גישה זו שימושית לכמת אופן פעולה של תאים חיים.

טומוגרפיה קונפוקל, בשילוב עם למידת מכונה, שימושי עבור מגוון רחב של איברים על שבב פלטפורמות. ניתוח גידול ראשוני או חוזר או תאים סרטניים במחזור יכול להוות כלי אבחון חשוב לחיזוי גרורות במוח ולהבחנה גרורתית במוח מתאים גרורתיים שאינם מוח. כדי להרכיב את התקן BBN microfluidic, להעביר מכשיר מידש ואקום על משטח מתאים עם המשחים פונה כלפי מטה ולמקם את ההתקנה כולה לתוך תא פלזמה.

מניחים את כל ההתקנה לתוך תא פלזמה ולמשוך ואקום לפני הטיפול במכשיר עם פלזמה במשך 30 שניות ב 80 וואט. בסוף הטיפול, השתמש במדריך כדי למקם במהירות את המכשיר, צד ההצבה למעלה על מגלשת הזכוכית על ספסל המעבדה כדי ליצור קשר קבוע בין מחשבי ה- PDMs של המכשיר לבין השקופית. לאחר מכן, הכנס 200 טיפים פיפיאט microliter, לחתוך שני מילימטרים מהקצה לתוך כל הכניסות והשקעים ולכניס את המכשיר לתוך תא הפלזמה במשך שמונה דקות, 200 וואט טיפול פלזמה.

לאחר שהמכשיר התקרר, מניחים את המכשיר במיכל משני סטרילי ובתוך 15 דקות של טיפול פלסמיד, מעבירים 120 מיקרוליטרים של תמיסת אסטרוציטים קולגן למכשיר דרך קצה הפיפלטה לתא התחתון. אפשר לפתרון לחצות את התא לתוך קצה פיפטה הנגדי ולמלא את הערוץ הבא של המכשיר. כאשר כל ארבעת הערוצים של המכשיר מולאו, מניחים את השבב בהמה לתרבות התאים למשך שעה אחת.

כאשר הקולגן קבע, לחייב את כל טיפים פיפטה להאכיל את התא התחתון עם בינוני תרבות התא המלא המתאים מצופה את התא העליון עם 2%גדילה גורם מטריגל מופחת, במדיום אנדותל מלא. כאשר שני התאים קודדו, מניחים את המכשיר באינקובטור במשך שעה אחת לפני שטיפה של התא העליון עם המדיום המתאים. טיפים לסירוגין, לראות 30 microliters של אחד פעמים 10 לתאי אנדותל השישי למיליליטר של המדיום המתאים, דרך הקצות לתוך התא העליון כל 15 דקות, עבור סך של ארבעה aliquots של תאים לכל קצה.

דגירה המכשיר בין הזרעים. כאשר כל תאי ה אנדותל כבר זרע, למלא את כל הטיפים עם המדיום ולהחזיר את המכשיר החממה תרבות התא במשך 48 שעות. כאשר השכבה ה אנדותל התבגר, להחליף את המדיום בשבב כדי לחדש את מדיום תרבות התאים ולזרע כל ערוץ התא העליון עם 30 microliters של פעם 10 לשישה תאים סרטניים למיליליטר של מדיום מתאים.

לאחר כל 30 aliquot microliter של תאים כבר זרע, להחזיר את המכשיר לאנקובטור במשך 15 דקות ולאחר מכן למלא את כל הטיפים עם המדיום המתאים להחזיר את המכשיר לאנקובטור תרבות התא במשך 24 עד 48 שעות. לאחר המכשיר כבר תרבותית בתמונה, כדי למדוד את הפנוטיפ של התאים הסרטניים, לפתוח את התוכנה שסופקה ולקרוא את התמונה confocal לזיכרון. התוכנה תשמור כל ערוץ צבע מהתמונה confocal 3D לתוך קובץ TIFF נפרד.

בחרו 'שנה ערכי אטימות' של כל ערוץ מיקרוסקופ והתאימו את ערך אלפא הערוץ לערוצי הצבע הקיימים בתמונה, כך שהרקע יוסר ורק הפלואורסצנטים שבתאים יישארו. להצגה חזותית של האפקט, בחרו 'הצג רינדור תלת-ממדי' כדי לוודא שהסף מוגדר כראוי ואם התמונה נראית נכונה, שמרו את ערכי האטימות בגיליון האלקטרוני של עוקב הניסוי. לאחר מכן, השתמשו בקוביות צועדות כדי להמיר את תמונת עוצמת הקול לאובייקטי רשת שינוי תלת-ממדיים בודדים שנשמרו בתבנית הנתונים VTK.

כדי להתאים מטוס למחסום ה אנדותל, תחילה לאתר את centroids התא. השתמש במסנן הקישוריות polydata כדי לחזור על רשימת רשתות שינוי בקובץ VTK כדי לחלץ את האזורים אינם מחוברים. חשב את המרכז של כל רשת שינוי והוסף את המדידה לרשימת centroids המסננת עבור רשתות שינוי גדולות מדי או קטנות מדי.

כדי להתאים מישור לרשימת centroids עבור התאים אנדותל, להשתמש במזעור של שיטת השגיאה, להפעיל לדמיין centroids RFP והתאמת מטוס 'כדי ליצור ולתוות את המטוס להתאים ולבדוק את ההתאמה של המישור, התאמת ההתאמה באופן ידני לפי הצורך. כאשר המטוס הותאם כראוי, שמור את תקינות המטוס בקובץ מעקב הניסויים. כדי למדוד כל פנוטיפ תאים סרטניים לאחר אפיון שכבת אנדותל עם מישור, לטעון את פונקציית ניתוח התא ולהפעיל קרא במידע מעקב הניסוי ולנתח את הערוצים הקיימים"לחזור ולנתח כל אזור בקובץ VTK.

עבור כל אזור, הפונקציה תגזור כל תא כך שקו רשת שינוי מתחת לממברנה יחושב. כדי למדוד את פנוטיפ הסלולר, לחשב את הצורה, נפח ומיקום של כל תא סרטני. לאחר מכן למדוד את הנפח והמיקום של כל תא סרטני קצוץ כדי לחשב את אחוז התא כי בזבזני דרך מחסום אנדותל.

לאחר ביצוע שלבים אלה עבור מספר ניסויים להפעיל ייצוא הנתונים כקובץ xlsx יחיד', כדי לשמור את הנתונים בגיליון אלקטרוני. שבב BBN מיקרופלואידי עם מחסום אנדותל נוח מקובל לניסויים, בעוד שבב BBN מיקרופלואידי עם כיסוי אנדותל גרוע במיוחד, אינו. בניתוח מייצג זה המוח המחפש קו תאים סרטניים, מציג תת-פוזה של תאים המתפשטת לאורך מחסום ה אנדותל ונודדת עמוק לתוך מרחב נישה במוח של שבב BBN מיקרופלואידי ביומיים ותשעה ימים לאחר החשיפה, התאים הסרטניים ההוריים שמרו על חלק ניכר מהתאים על גבי המחסום הרחק ממרחב נישה במוח בעוד שאוכלוסיית התאים הסרטניים גרורתיים במוח שמרה על שיעור תאים גדול מ-100%.

כימות מורפולוגי של צורת התא הסרטני הצביע על כך שתאי הורים הדגימו פחות תאים בצורת כדורית ביום אחד לאחר הזריעה, ואילו לאחר יומיים ותשעה ימים של אינטראקציה שני קווי התאים הסרטניים טרנדים לכיוון הפחתת הכדוריות שלהם. בנוסף, תת-התפקודים של התאים הסרטניים שהתפזרו לתוך הנישה האצרידית היו קטנים יותר בגודלם, בהשוואה לתאים הסרטניים שנשארו באינטראקציה עם מחסום ה אנדותל מבלי להתפזר לתוך המוח. המוח מחפש קווי תאים סרטניים החולה נגזר xenografts, להפגין דפוס פנוטיפי בשבב BBN microfluidic שניתן לנצל כדי להבדיל בין המוח גרורתי תאים סרטניים גרורתיים שאינם מוח על ידי למידת מכונה.

בחירה עצמית חשובה. תאי אנדותל עם מספר מעבר גבוה ונמוך יותר הציגו התנהגויות מחסום משתנות. בנוסף, תאים סרטניים והביטוי הפלואורסצנטי שלהם עשויים להשתנות עם הזמן.

לאחר הליך זה, החוקרים עשויים להשתמש פרופיל מולקולרי של הבית או התאים של הסוד במכשיר על מנת ללמוד מנגנונים מולקולריים של גרורות. טכניקה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות מורכבות בין תאים סרטניים לבין המיקרו-וירוסים שלהם, על ידי שילוב של מיקרו-וירוס מהונדס עם הדמיה כמותית של רכיבי נישה לאורך זמן.