Name: כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: למד טכניקת Western blotting מהירה במיוחד באמצעות טכנולוגיית CDR וסוכן חיזוק Immunoreaction. השיטה משלימה את התהליך ב-20 דקות תוך שמירה על רגישות גבוהה לזיהוי אנטיגנים במחקר ביורפואי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר פנים-ארצי, מכון הלב, הריאות והדם הלאומי, המכונים הלאומיים לבריאות. S.H. נתמך על ידי יפן ציבורית-פרטית שותפות סטודנטים ללמוד בחו"ל תוכנית, ו H.N. ו K.Y. היו על ידי גבור ו V סמים בחו"ל הכשרה מלגת.

1. SDS-PAGE והעברה לקרום PVDF
<ol><li>בצעו SDS-PAGE להפרדת חלבונים לפי גודל יחסי. הערה: כל מערכת ג'ל מסחרית או ביתית היא בסדר. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
	<li>מעבירים חלבונים מופרדים מג'ל לקרום PVDF. הערה: שיטות העברה נפוצות (העברה יבשה למחצה או רטובה) מתאימות. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
</ol>2. חסימת קרום PVDF
<ol><li>דגירה את הממברנות במאגרי חסימה מתאימים במשך 1 שעות עם עצבנות בטמפרטורת החדר. הערה: בהתאם למערכת הנוגדנים והזיהוי העיקרית, יש לבחור מאגר חסימה מתאים. לדוגמה, החוסמים האופייניים ביותר הם BSA, חלב יבש דל שומן, קזאין ופולימרים סינתטיים מסחריים. PBS ו/או TBS עם 0.1% Tween20 הם המאגרים הנפוצים ביותר. שלב חסימה זה יכול להיעשות בן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>3. דגירה עם נוגדן ראשוני
<ol><li>הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-1 פתרון (IRE-1) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.</li>
	<li>הכינו את הנוגדן העיקרי המדולל עם 10% IRE-1. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.</li>
	<li>אם משתמשים בקרום גדול יותר (4 ס"מ x 8 ס"מ – 8 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 8 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינורות צנטריפוגה חרוטים של 50 מ"ל. אם משתמשים בקרום קטן יותר (2 ס"מ x 8 ס"מ – 4 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 3 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינור פוליפרופילן עגול 14 מ"ל(שולחן החומרים).</li>
	<li>להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון החסימה לזמן קצר. הכנס את קרום PVDF לתוך צינור זה עם אצבעות כפפות ולהבטיח כי הממברנה כולה נצמדת לקיר הצינור. כאשר קרום PVDF מוכנס לתוך צינור, פנים "צד החלבון" של הממברנה כי היה במקור במגע עם הג'ל פנימה. סגור את המכסה בחוזקה.</li>
	<li>הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה. הערה: כאשר צינורות 14 מ"ל משמשים דגירה זו, להכניס צינור 14 מ"ל לתוך הצינור 50 מ"ל, באמצעות זוג מחזיקי טבעת פלסטיק כדי לשמור על הצינור הפנימי במרכז הצינור 50 מ"ל.</li>
	<li>הפעל את תנור ההכלאה.</li>
	<li>דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות. הערה: ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות את הממברנה עם פתרון הנוגדן באופן שווה. כייל את הדילול של זמן הנוגדן והדגירה לפני הניסוי עצמו.</li>
</ol>4. שטיפת ממברנות
<ol><li>עצור את הסיבוב.</li>
	<li>בזהירות להסיר את קרום PVDF מהצינור עם פינצטה, ומניחים את הממברנה לתוך מיכל עם 50 מ"ל של PBS-T.</li>
	<li>יש לשטוף את הממברנה לזמן קצר באמצעות PBS-T.</li>
	<li>יש לשטוף את הממברנה במיכל במים מזוקקים עד שלא יופיעו בועות. זה כדי להסיר את רוב הנוגדן.</li>
	<li>מעבירים את קרום ה-PVDF מהמכל לטווח הסלט המכיל 250 מ"ל של PBS-T.</li>
	<li>מניחים את סל מסננת ספינר. ודא שהמכסה הונח בצורה מאובטחת.</li>
	<li>הפעל את ספינר ולהפעיל אותו במשך כ 20-30 שניות.</li>
	<li>להשליך את הפתרון ולשטוף בקצרה את החלק הפנימי של ספינר עם מים מזוקקים.</li>
	<li>הוסף 250 מ"ל של PBS-T לתוך ספינר שוב.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.6 ו- 4.7.</li>
</ol>5. דגירה עם הנוגדן המשני
<ol><li>הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-2 פתרון (IRE-2) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.</li>
	<li>הכינו את הנוגדן המשני המדולל עם 10% IRE-2. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.</li>
	<li>בחר את נפח פתרון הנוגדנים והצינור כאמור בשלב 3.3.</li>
	<li>להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה. הכנס את קרום PVDF לתוך הצינור כאמור בשלב 3.4.</li>
	<li>הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.</li>
	<li>הפעל את תנור ההכלאה.</li>
	<li>דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות. ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות באופן שווה את הממברנה עם פתרון הנוגדן. הערה: כייל את זמן הדגירה לפני הניסוי עצמו. כאשר הנוגדן המשני מצומד באופן פלואורסצנטי, בצע את הדגירה בחושך.</li>
</ol>6. שטיפת ממברנות
<ol><li>בצע את שלבים 4.1 עד 4.10.</li>
</ol>7. רכישת תמונה
<ol><li>זיהוי צ'מילומינסנטי<ol>
<li>מניחים חתיכת סרט גמיש חצי השתלה (10 ס"מ x 15 ס"מ) על משטח שטוח.</li>
		<li>מערבבים 2 מרכיבים של המצע המלומינסנטי בצינור 5 מ"ל.</li>
		<li>להעביר מיד 1.5 מ"ל של המצע המעורב לסרט חצי השתלה גמיש ומניחים את קרום PVDF על זה. לאחר מכן, להעביר את שאר פתרון המצע על הממברנה.</li>
		<li>דגירה קרום PVDF עם מצע מעורב על סרט גמיש שקוף למחצה במשך 1 דקות.</li>
		<li>להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון המצע בקצרה.</li>
		<li>כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.</li>
		<li>לרכוש את התמונה תחת מצב chemiluminescent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>זיהוי פלואורסצנטי<ol>
<li>להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה.</li>
		<li>כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.</li>
		<li>רכוש את התמונה במצב פלואורסצנטי. הערה: יש לבצע את שלבים 7.1 ו- 7.2 בסמיכות למכונת ההדמיה כדי להבטיח רגישות מרבית.</li>
		<li>כאשר אות הרקע גבוה, בצע שלב כביסה במיכל עם 80-100 מ"ל של PBS-T: 10 דקות לשטוף 3 פעמים עבור הנוגדן העיקרי 5 דקות לשטוף 6 פעמים עבור הנוגדן המשני. הערה: הן נוגדנים ראשוניים והן משניים מדוללים עם 10% פתרונות IRE ניתן להשתמש עד 8-10 פעמים ללא אובדן רגישות6. הפתרון צריך להישמר ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>MacPhee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+considerations+for+improving+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacol+Toxicology+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodological considerations for improving Western blot analysis.</a> Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).</li>
<li>Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+critical+factors+for+quantitative+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting.</a> Science Signaling. 8 (371), (2015).</li>
<li>Schuck, P., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mass+transport+limitation+and+surface+heterogeneity+in+the+biophysical+characterization+of+macromolecular+binding+processes+by+SPR+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing.</a> Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).</li>
<li>Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eliminating+Size-Associated+Diffusion+Constraints+for+Rapid+On-Surface+Bioassays+with+Nanoparticle+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes.</a> Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).</li>
<li>Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html">http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html</a> (2020).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+but+not+Obsolete%3A+An+Enhanced+High+Speed+Immunoblot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot.</a> Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+and+analysis%3A+next+generation+Western+blotting+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li>
<li>Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+analysis+of+EGF+receptor+signaling+dynamics+with+microwestern+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays.</a> Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).</li>
<li>Treindl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bead-based+western+for+high-throughput+cellular+signal+transduction+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses.</a> Nature Communications. 7, 12852(2016).</li>
<li>Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+western+blot+assay+by+rotational+cyclic+draining+and+replenishing+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure.</a> Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).</li>
<li>Kurien, B. T., Scofield, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+review+of+other+notable+protein+detection+methods+on+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A brief review of other notable protein detection methods on blots.</a> Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).</li>
<li>Nagase, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+Sensitive+Detection+of+Glycosaminoglycan+Chains+with+Immunoblots%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots.</a> Glycobiology. , (2020).</li>
</ol>

המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים הרלוונטיים ישירות לתוכן מאמר זה.

כתם מערבי הוא טכניקה אנליטית בשימוש נרחב כדי לזהות חלבונים ספציפיים שפותחו ~ לפני 40 שנה7,8. מאז, הטכניקה המשיכה להתפתח, עם חידושים הבאים לשפר את הרגישות, המהירות, ואת הכמות של הטכניקה2,9,10,11,12,13. פרוטוקול סופג מערבי מהיר במיוחד המוצג כאן מבצע מספר שיפורים משמעותי...

כתם מערבי (ידוע גם בשם immunoblot) היא טכניקה חזקה ויסודית על פני מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות וקליניות. טכניקה זו משמשת לבחינת הנוכחות, השפע היחסי, המסה המולקולרית היחסית והשינויים שלאחר התרגום של חלבונים1. בשילוב עם ניתוח תמונה דיגיטלית, שיטה זו יכולה לנתח באופן אמין את שפע החלבונים ושינויי החלבון2. למרות כתם המערבי מבוצע באופן שגרתי, היא שיטה זמן רב ועבודה אינטנסיבית. דגירה ארוכה של הנוגדן עם ממברנות נדרשים. כאן, אנו מתארים שינוי בשיטת הדגירה המתגברת על מגבלה זו מבלי להקריב רגישות.
במהלך הדגירה של הממברנה, נוגדנים צפים בתמיסה בעוד אנטיגנים משותקים על הממברנה. בגלל הזיקה הגבוהה שלהם, שיעור הנוגדנים המחייבים את האנטיגן מהיר יותר מפיזור הנוגדנים מהתמיסה בתפזורת לקרום. פעולה זו יוצרת "שכבת דלדול" בריכוז נמוך (איור 1). זה עלול לקחת שעות עבור נוגדנים רחוקים יותר להגיע לקרום באמצעות דיפוזיה פסיבית, שהוא הגורם העיקרי האחראי על זמני דגירה ארוכים בטכניקה זו. אפקט זה נקרא הגבלת הסעת המונים (MTL)3. הוצע כי ניקוז חוזר ונשנה וחידוש הפתרון המכיל נוגדנים עלול לשבש את שכבת הדלדול ולהתגבר על MTL4. כאן, פיתחנו טכניקה ייחודית המיישמת את המושג הזה ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) כדי להפחית את ההשפעה של MTL בפרוטוקול סופג מערבי מסורתי ולקצר באופן הערות את תקופת הדגירה הנדרשת.
על מנת לשמור על רגישות הגילוי עם זמן דגירה קצר, עשינו שימוש בטכנולוגיה לשיפור אימונוריאציה המאיצה את תגובת האנטיגן-נוגדנים, ובכך משפרת את יחס האות לרעש5. סוכנים רבים לשיפור האימונו-ראציה הזמינים מסחרית (IRE) מורכבים מ-2 רכיבים (פתרון 1 ו-2, ראו טבלת חומרים). ההרכב הקנייני או מנגנון הפעולה של IRE לא נחשפו, אך מצאנו בעבר כי IRE הפחית את קבוע הדיסוציאציה בין האנטיגן והנוגדן ב מבחני כריכת פאזה מוצקים, מה שמצביע על זיקה מוגברת היא, לפחות בחלקה, אחראית לשיפור ההשפעה של IRE6. השילוב של CDR עם IRE מניב פרוטוקול נפיחות מערבי במהירות גבוהה במיוחד המפחית את זמן ההליך כולו מבלי להתפשר על הרגישות.

<table><tbody><tr><td>מבחנה PP עם בהירות גבוהה של 14 מ"ל תחתית עגולה, בוגרת, עם</td> סרט שקפים של <td>פלקון</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>אפולו למדפסות לייזר</td><td>N/A</td><td>N/</td><td>A כל סוג של סרט שקיפות למדפסת לייזר הם בסדר.</td></tr><tr><td>Azure Imaging System 600</td><td>Azure Biosystems</td><td>Azure 600</td><td>כל סוג של מערכת רכישת תמונה מתאים לזיהוי כימילומינסנט ו/או פלואורסצנטי.</td></tr><tr><td>יכול לקבל פתרון משפר תגובה חיסונית</td><td>אות TOYOBO</td><td>NKB-101</td><td></td></tr><tr><td>ציפורן חלב יבש מיידי ללא שומן</td><td>ציפורן</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ECL אנטי עכבר IgG, חזרת פרוקסידאז מקושר F(ab')2 שבר מכבשים</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9310V</td><td></td></tr><tr><td>ECL נגד ארנב IgG, חזרת פרוקסידאז מקושר F(ab')2 שברים מחמור</td><td>GE Healthcare</td><td>NA9340V</td><td></td></tr><tr><td>HYBAID Micro-4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>כל תנור הכלאה הוא בסדר כל עוד הצינורות מסובבים באופן שווה במצב אופקי.</td></tr><tr><td>קרום Immobilon-P PVDF, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביות</td><td>Millipore Sigma</td><td>IPVH304F0</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD עז נגד עכבר IgG נוגדן משני</td><td>LICOR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW עז נגד ארנב IgG נוגדן משני</td><td>LICOR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate</td><td>seracare</td><td>5430-0049</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן עכבר נגד &szlig; נוגדן אקטין</td><td>Millipore Sigma</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>מאגר חסימת אודיסיאה (PBS)</td><td>LICOR</td><td>927-40100</td><td>מאגר חוסם לזיהוי פלורסנט</td></tr><tr><td>ספינר סלט OXO</td><td>OXO</td><td>32480V2B</td><td>כל ספינר סלט הוא בסדר כל עוד ממברנות ה-PVDF נשטפות במרץ ללא קרע.</td></tr><tr><td>סרט איטום פרפילם</td><td>Bemis</td><td>Parafilm M PM996</td><td>סרט גמיש שקוף למחצה</td></tr><tr><td>פוליאתילן מכסי בורג שטוחים לצינורות צנטריפוגה תחתונים חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>טבעות להחזקת צינור 14 מ"ל במרכז צינור 50 מ"ל</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>מוכן בחנות מכונות ארנב</td></tr><tr><td>אנטי-6X נוגדן התג שלו</td><td>Abcam</td><td>ab9108</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>מיליפור סיגמא</td><td>P2287</td><td></td></tr></tbody></table>

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור immunoreaction

Ultra-High-Speed Western Blot using Immunoreaction Enhancing Technology

כתם מערבי (באנגלית: Western blot) היא שיטה קנונית למחקר ביו-רפואי. הוא משמש בדרך כלל כדי לקבוע את הגודל היחסי ואת השפע של חלבונים ספציפיים, כמו גם שינויים בחלבון שלאחר התרגום. טכניקה זו יש היסטוריה עשירה ונשאר בשימוש נרחב בשל הפשטות שלה. עם זאת, הליך הבליעה המערבי המפורסם לוקח שעות, אפילו ימים, כדי להשלים, עם צוואר בקבוק קריטי להיות זמני הדגירה הארוכים המגבילים את התפוקה שלה. צעדי דגירה אלה נדרשים עקב דיפוזיה איטית של נוגדנים מהתמיסה בתפזורת לאנטיגנים משותקים על הממברנה: ריכוז הנוגדנים ליד הממברנה נמוך בהרבה מהריכוז בצובר. כאן, אנו מציגים חידוש המפחית באופן דרמטי מרווחי דגירה אלה על ידי שיפור כריכת אנטיגן באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) של פתרון הנוגדנים. השתמשנו גם בטכנולוגיה לשיפור האימונוריאציה כדי לשמר את הרגישות של ההסתעפות. שילוב של שיטת CDR עם סוכן שיפור אימונוריאציה מסחרי הגביר את אות הפלט והפחית באופן משמעותי את זמן הדגירה של הנוגדנים. הכתם המערבי במהירות גבוהה במיוחד יכול להתבצע בתוך 20 דקות ללא כל אובדן רגישות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כתמים מערביים באמצעות זיהוי chemiluminescent ו פלואורסצנטי. פרוטוקול פשוט זה מאפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את הניתוח של ביטוי חלבון בדגימות רבות.

דוגמה זו ממחישה את האפקטיביות של שיטת CDR יחד עם טכנולוגיית אימונוהאנסינג על כתם מערבי. הדגירה הסטטית בוצעה על סרט גמיש שקוף למחצה שבו קרום PVDF דגירה עם פתרון הנוגדנים, ואילו דגירה CDR היה בתנור הכלאה על ידי סיבוב צינורות שהכילו את הממברנות ואת פתרון הנוגדנים (סרט). איור 2 הראה כמויות של אנטיגן ונוגדנים, בהתאמה, הדרושים לגילוי צ'מילומינסנט על כתמים מערביים. הן בדגירה סטטית והן בדגירה CDR, השימוש בתמיסת IRE הגביר את הרגישות: IRE הפחית את הכמות הנמוכה ביותר של ליסטטים של תאים (אנטיגן) הדרושים...

טכניקת סופג מערבית במהירות גבוהה במיוחד מפותחת על ידי שיפור הקינטיקה של אנטיגן-נוגדנים מחייב באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) טכנולוגיה בשילוב עם סוכן שיפור immunoreaction.

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

A western blot (also known as an immunoblot) is a canonical method for biomedical research. It is commonly used to determine the relative size and ...

Western Blotting היא שיטה מבוססת המזהה אנטיגנים על ממברנה מועברת ונמצאת בשימוש נפוץ במחקר ביו-רפואי, אך לוקח שעות או ימים להשלים את ההליך כולו. באמצעות השילוב של טכנולוגיה לחיזוק מערכת החיסון עם ניקוז וחידוש מחזורי, ברגע שיש לך קרום בלוק, ניתן לבצע את ההליך כולו תוך 20 דקות בלבד מבלי לוותר על הרגישות. מכיוון שהכתמים המערביים נפוצים בתחומי מחקר רבים ושונים, יש לו תחולה רחבה להאצת המחקר.השימוש המוצלח בפרוטוקול זה מסתמך על אופטימיזציה של דילול הנוגדנים עם ריאגנט משפר תגובה חיסונית וזמן הדגירה. התחל בדגירה של ממברנות ה-PVDF במאגרי חסימה מתאימים למשך שעה אחת עם תסיסה בטמפרטורת החדר. בזמן שהממברנות דוגרות, הכינו תמיסה אחת של 10% משפר תגובה חיסונית או IRE1 עם מים מזוקקים ומערבלו אותו היטב, ואז דללו את הנוגדן הראשוני ב-10% IRE1, ערבבו אותו בעדינות וביסודיות.הרם את קרום ה- PVDF בעזרת פינצטה ונקז בקצרה את תמיסת החסימה. הכנס את הממברנה לצינור חרוטי עם נוגדן ראשוני, וודא שכל הממברנה נצמדת לדופן הצינור ושצד הממברנה שהיה במקור במגע עם הג'ל פונה פנימה. מכסים את הצינור בחוזקה.הכנס את הצינור לבקבוק זכוכית לתנור ההיברידיזציה והפעל את התנור. דגרו את הממברנה בסיבוב של שישה סל"ד למשך חמש דקות לפחות. עצור את הסיבוב והסר בזהירות את קרום ה- PVDF מהצינור בעזרת פינצטה.הכניסו את הממברנה למיכל עם 50 מיליליטר PBST ושטפו אותה, ואז שטפו אותה בכלי עם מים מזוקקים עד שלא יופיעו בועות, מה שיסיר את רוב הנוגדן. מעבירים את הממברנה לספינר סלט המכיל 250 מיליליטר PBST. הנח את סל המסננת בספינר וודא שהמכסה הונח היטב, ולאחר מכן הפעל את הספינר והפעל אותו למשך 20 עד 30 שניות.השליכו את התמיסה ושטפו בקצרה את פנים הספינר במים מזוקקים. הוסף 250 מיליליטר PBST לתוך הספינר וחזור על הסיבוב, ולאחר מכן דגר את הממברנה עם הנוגדנים המשניים ושטוף אותה שוב כמתואר בכתב היד הטקסט. הניחו חתיכת סרט גמיש שקוף למחצה על משטח ישר.מערבבים שני מרכיבים של המצע הכימילומינסנט בצינור של חמישה מיליליטר ומעבירים מיד 1.5 מיליליטר מהמצע המעורב לסרט השקוף למחצה. הנח את קרום ה-PVDF על התמיסה והעביר את שאר תמיסת המצע אל הממברנה. דגרו את קרום ה- PVDF עם המצע המעורב למשך דקה אחת.הרם את קרום ה- PVDF בעזרת פינצטה ונקז את תמיסת המצע בקצרה. סנדוויץ' את הממברנה בין זוג סרטי שקיפות ודמיין אותה במצב כימילומינסנציה. כמויות האנטיגן והנוגדנים הנחוצות בהתאמה לזיהוי כימילומינסנט של כתם מערבי מוצגות כאן.הן בדגירה סטטית והן ב-CDR, השימוש בתמיסות IRE הגביר את הרגישות. באופן דומה, הריכוז המינימלי של נוגדן התג שלו ירד מ-100 ל-50 ננוגרם למיליליטר בתנאים סטטיים ומ-100 ל-12.5 ננוגרם למיליליטר בתנאי CDR. דגירה של CDR במשך 5 או 10 דקות הורידה באופן דרמטי את מגבלת הזיהוי בהשוואה לדגירה סטטית.יתר על כן, השילוב של CDR עם IRE חשף רגישות מעולה בכתם המערבי, אפילו בתקופת הדגירה הקצרה ביותר. יישום מוצלח של שיטה זו על כתם מערבי עם זיהוי פלואורסצנטי מודגם כאן. לזיהוי פלואורסצנטי בניגוד לזיהוי כימילומינסנט יש את היכולת הייחודית לזהות מספר מטרות על אותו כתם בו זמנית מבלי להפשיט ולפגוע בנוגדנים.פוספטאז אלקליין ובטא-אקטין המתויגים שלו בליזאטים של התא זוהו בו זמנית באמצעות פלואורופור דו-צבעוני. דגירה של CDR עם IRE לא רק האיצה את הזיהוי, אלא גם הגבירה את הרגישות. במהלך הדגירה, הממברנה צריכה להישאר מחוברת לדופן הצינור.יש לסובב את הצינור אופקית כך שהתמיסה תשטוף ללא הרף על פני הממברנה. פרוטוקול זה האיץ משמעותית את פרודוקטיביות המחקר שלנו, שתלויה מאוד בהליכי הכתמה מערביים.

ultra-high-speed-western-blot-using-immunoreaction-enhancing

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Immunoblotting (המערבי סופג) הוא assay מהיר ורגיש לגילוי ואפיון של חלבונים אשר עובד על ידי ניצול סגוליות הטמון בזיהוי אנטיגן נוגדן. וידאו זה מספק פרוטוקולים להפרדת חלבון, חלבונים סופג על ממברנות, immunoprobing, להדמיה באמצעות מצעים chromogenic או chemiluminescent.

Immunoblot ניתוח

המערבי סופג היא שיטה אנליטית לשמש כדי לזהות חלבונים ספציפיים בדגימה נתון homogenate רקמה או לחלץ.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

סרטון זה מתאר את הכתמים המערביים מבוססי הכימילומינסנציה של ליזטים מדוכאי חיסון. הטכניקה מסייעת לקבוע עיבוד והפעלה של חלבונים. האות הכימילומינסנטי שזוהה פרופורציונלי לרמת עיבוד החלבון במהלך הפעלתו.

בדיקת כתם מערבי Chemiluminescent לעיבוד חלבונים

זרימת עבודה V3 היא הליך כתם מערבי באמצעות ג'לים ללא כתמים. הטכנולוגיה נטולת הכתמים מאפשרת לחוקרים לדמיין את איכות הפרדת החלבון, לאמת את יעילות ההעברה, והכי חשוב, לאמת את השינוי בחלבון המעניין באמצעות כימות חלבונים כולל כבקרת טעינה אמינה.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.

זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

מערבון רגיל סופג פרוטוקול היה אופטימיזציה עבור ניתוח גם 500 hematopoietic גזע או ובתאים בהיקף. אופטימיזציה כרוך זהיר טיפול המדגם תא, הגבלת העברות בין צינורות ו ישירות lysing התאים במאגר מדגם Laemmli.

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

למד טכניקת Western blotting מהירה במיוחד באמצעות טכנולוגיית CDR וסוכן חיזוק Immunoreaction. השיטה משלימה את התהליך ב-20 דקות תוך שמירה על רגישות גבוהה לזיהוי אנטיגנים במחקר ביורפואי.

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

גלה סרטונים נוספים