כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction
26 בספטמבר 2020
טכניקת סופג מערבית במהירות גבוהה במיוחד מפותחת על ידי שיפור הקינטיקה של אנטיגן-נוגדנים מחייב באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) טכנולוגיה בשילוב עם סוכן שיפור immunoreaction.
Western Blotting היא שיטה מבוססת המזהה אנטיגנים על ממברנה מועברת ונמצאת בשימוש נפוץ במחקר ביו-רפואי, אך לוקח שעות או ימים להשלים את ההליך כולו. באמצעות השילוב של טכנולוגיה לחיזוק מערכת החיסון עם ניקוז וחידוש מחזורי, ברגע שיש לך קרום בלוק, ניתן לבצע את ההליך כולו תוך 20 דקות בלבד מבלי לוותר על הרגישות. מכיוון שהכתמים המערביים נפוצים בתחומי מחקר רבים ושונים, יש לו תחולה רחבה להאצת המחקר.
השימוש המוצלח בפרוטוקול זה מסתמך על אופטימיזציה של דילול הנוגדנים עם ריאגנט משפר תגובה חיסונית וזמן הדגירה. התחל בדגירה של ממברנות ה-PVDF במאגרי חסימה מתאימים למשך שעה אחת עם תסיסה בטמפרטורת החדר. בזמן שהממברנות דוגרות, הכינו תמיסה אחת של 10% משפר תגובה חיסונית או IRE1 עם מים מזוקקים ומערבלו אותו היטב, ואז דללו את הנוגדן הראשוני ב-10% IRE1, ערבבו אותו בעדינות וביסודיות.
הרם את קרום ה- PVDF בעזרת פינצטה ונקז בקצרה את תמיסת החסימה. הכנס את הממברנה לצינור חרוטי עם נוגדן ראשוני, וודא שכל הממברנה נצמדת לדופן הצינור ושצד הממברנה שהיה במקור במגע עם הג'ל פונה פנימה. מכסים את הצינור בחוזקה.
הכנס את הצינור לבקבוק זכוכית לתנור ההיברידיזציה והפעל את התנור. דגרו את הממברנה בסיבוב של שישה סל"ד למשך חמש דקות לפחות. עצור את הסיבוב והסר בזהירות את קרום ה- PVDF מהצינור בעזרת פינצטה.
הכניסו את הממברנה למיכל עם 50 מיליליטר PBST ושטפו אותה, ואז שטפו אותה בכלי עם מים מזוקקים עד שלא יופיעו בועות, מה שיסיר את רוב הנוגדן. מעבירים את הממברנה לספינר סלט המכיל 250 מיליליטר PBST. הנח את סל המסננת בספינר וודא שהמכסה הונח היטב, ולאחר מכן הפעל את הספינר והפעל אותו למשך 20 עד 30 שניות.
השליכו את התמיסה ושטפו בקצרה את פנים הספינר במים מזוקקים. הוסף 250 מיליליטר PBST לתוך הספינר וחזור על הסיבוב, ולאחר מכן דגר את הממברנה עם הנוגדנים המשניים ושטוף אותה שוב כמתואר בכתב היד הטקסט. הניחו חתיכת סרט גמיש שקוף למחצה על משטח ישר.
מערבבים שני מרכיבים של המצע הכימילומינסנט בצינור של חמישה מיליליטר ומעבירים מיד 1.5 מיליליטר מהמצע המעורב לסרט השקוף למחצה. הנח את קרום ה-PVDF על התמיסה והעביר את שאר תמיסת המצע אל הממברנה. דגרו את קרום ה- PVDF עם המצע המעורב למשך דקה אחת.
הרם את קרום ה- PVDF בעזרת פינצטה ונקז את תמיסת המצע בקצרה. סנדוויץ' את הממברנה בין זוג סרטי שקיפות ודמיין אותה במצב כימילומינסנציה. כמויות האנטיגן והנוגדנים הנחוצות בהתאמה לזיהוי כימילומינסנט של כתם מערבי מוצגות כאן.
הן בדגירה סטטית והן ב-CDR, השימוש בתמיסות IRE הגביר את הרגישות. באופן דומה, הריכוז המינימלי של נוגדן התג שלו ירד מ-100 ל-50 ננוגרם למיליליטר בתנאים סטטיים ומ-100 ל-12.5 ננוגרם למיליליטר בתנאי CDR. דגירה של CDR במשך 5 או 10 דקות הורידה באופן דרמטי את מגבלת הזיהוי בהשוואה לדגירה סטטית.
יתר על כן, השילוב של CDR עם IRE חשף רגישות מעולה בכתם המערבי, אפילו בתקופת הדגירה הקצרה ביותר. יישום מוצלח של שיטה זו על כתם מערבי עם זיהוי פלואורסצנטי מודגם כאן. לזיהוי פלואורסצנטי בניגוד לזיהוי כימילומינסנט יש את היכולת הייחודית לזהות מספר מטרות על אותו כתם בו זמנית מבלי להפשיט ולפגוע בנוגדנים.
פוספטאז אלקליין ובטא-אקטין המתויגים שלו בליזאטים של התא זוהו בו זמנית באמצעות פלואורופור דו-צבעוני. דגירה של CDR עם IRE לא רק האיצה את הזיהוי, אלא גם הגבירה את הרגישות. במהלך הדגירה, הממברנה צריכה להישאר מחוברת לדופן הצינור.
יש לסובב את הצינור אופקית כך שהתמיסה תשטוף ללא הרף על פני הממברנה. פרוטוקול זה האיץ משמעותית את פרודוקטיביות המחקר שלנו, שתלויה מאוד בהליכי הכתמה מערביים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקת western blotting במהירות גבוהה במיוחד, המקצבת באופן משמעותי את הזמן הנדרש לביצוע הפרוצדורה. באמצעות שימוש בטכנולוגיית ניקוז ומילוי מחזורי (CDR) יחד עם חומר להגברת התגובה האימונולוגית, ניתן להשלים את התהליך כולו בתוך 20 דקות בלבד, מבלי לפגוע ברגישות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מחקר ביו-רפואי
- טכניקות של Western blotting
- טכנולוגיה להגברת חיסון
רקע
- Western blotting היא שיטה נפוצה לזיהוי אנטיגנים.
- נהלי Western blotting מסורתיים עשויים להימשך שעות או אפילו ימים.
- שיפור המהירות של טכניקה זו יכול להגביר את יעילות המחקר.
- המחקר מתמקד באופטימיזציה של דילול הנוגדנים וזמני הדגירה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהיר יותר ל-western blotting.
- שמירה על הרגישות תוך קיצור זמן הפרוצדורה.
- הדגמת היישומיות הרחבה של הטכניקה בתחומי מחקר שונים.
שיטות שנבחרה
- שימוש בטכנולוגיית ניקוז ומילוי מחזורי (CDR).
- שילוב של חומר להגברת תגובה חיסונית (IRE1).
- חסימה של ממברנות PVDF בבופרים מתאימים.
- אופטימיזציה של דילול הנוגדנים וזמני האינקובציה.
תוצאות עיקריות
- ניתן להשלים את כל הליך ה-western blotting בתוך 20 דקות.
- רגישות גבוהה נשמרת לאורך כל התהליך.
- אופטימיזציה מוצלחת מובילה לזיהוי יעיל של אנטיגנים.
- השיטה מראה פוטנציאל לשימוש נרחב בתחומי מחקר שונים.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה מאיצה באופן משמעותי את תהליך ה-western blotting.
- שילוב של טכנולוגיית CDR עם חומרים מגבירי אימונוגניות הוא יעיל.
- התקדמות זו יכולה לסייע להשגת תוצאות מחקר מהירות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
Western blotting נותר טכניקה בסיסית בתיקוף מטרות ובניתוח סממנים ביולוגיים, אך תקופות האינקובציה הממושכות שלו יוצרות צווארי בקבוק בתהליכי גילוי בעוצמה גבוהה. שיטה זו, המהירה באופן קיצוני, מקצרת את זמן הבדיקה משעות ל-20 דקות תוך שמירה על הרגישות, ובכך מאפשרת ניתוח מהיר של ביטוי חלבונים במספר דגימות. הגישה תומכת בבדיקת השערות ובזיהוי מובילים מהירה יותר על ידי שיפור ספיקת הבדיקה ללא פגיעה באיכות הנתונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה מהירה של היפותזות טיפוליות באמצעות זיהוי מואץ של חלבונים.
- ערך תפעולי: מקצר את הזמן למספר בלוט (blot), ובכך מאפשר סריקה של יעדים רבים יותר במקביל במהלך שלבי התיקוף המוקדמים של היעד.
- ערך ניבוי: שומר על רגישות הבדיקה, ובכך תומך בהערכות מהימנות של מעורבות היעד (target engagement) ושל מודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות וניתנות לשחזור של ביטוי חלבונים, המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות.
- ערך תפעולי: תואם לגילוי כימילומניסנטי ופלואורסצנטי כאחד, מה שמאפשר ריבוי בדיקות (multiplexing) ובחירה גמישה של שיטת הקריאה.
- יכולת הרחבה: פורמט של ניקוז ומילוי מחזורי תומך בהתאמה למסלולי עבודה אוטומטיים או חצי-אוטומטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מאפשר ניתוח חלבונים עקבי משלב הגילוי ועד למודלים פרה-קליניים באמצעות אותה שיטה לזיהוי מהיר.
- סנכרון ביומרקרים: תומך בהערכה של מודיפיקציות לאחר תרגום ואיסופורמות של חלבונים הרלוונטיים למנגנוני מחלה.
- הפחתת סיכונים: מאיץ את תיקוף הביומרקרים של המטרה, ובכך מפחית את חוסר הוודאות בהחלטות הנוגעות להתקדמות פרה-קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקת מעורבות מטרה ועד לאופטימיזציה של מובילים, כאשר כימות מהיר של חלבונים מספק מידע למחזורי תכנון איטרטיביים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי כך שהיא מאפשרת מדידה מהירה וחזרנית של רמות חלבון תחת תנאים ניסיוניים משתנים.
- סריקה: מייצרת פלטים כמותיים וסטנדרטיים המאפשרים השוואה של קישור נוגדנים בין תנאים ודגימות שונות.
- אנליזה: מספקת ספי גילוי רגישים (למשל, דרישות נמוכות יותר לריכוז נוגדנים) המשפרים את יחס אות לרעש בניתוח של מטרות בעלות שכיחות נמוכה.
- מחקר תרגומי: מאפשרת ניטור עקבי של חלבונים על פני סוגי דגימות שונים, ובכך תומכת בתיקוף של סמנים ביולוגיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה טכניקה בעלת יכולת פלטפורמה שניתן להחילה על פרויקטים ותחומי טיפול מרובים הודות לתאימות רחבה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה באמצעות זיהוי חלבונים מהיר וניתן לשחזור.
- ערך תפעולי: משפר את התפוקה במעבדה ואת יעילות הריאגנטים על ידי הפחתת זמני הדגירה וצריכת הנוגדנים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בבחירת המטרה על ידי האצת מחזורי הפקת הנתונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתוני תיקוף מטרה בזמן לביצוע החלטות השקעה.
שיקולי יישום
- דורש היכרות עם טכניקות של ריקון ומילוי מחזוריים וטיפול בחומרים להגברת התגובה האימונית.
- נדרש ציוד סטנדרטי ל-western blotting, כולל תנור היברידיזציה, צנטריפוגת סלט (salad spinner) ומערכות גילוי לקריאות כימולומינסנטיות או פלואורסצנטיות.
- דורש אופטימיזציה של דילול הנוגדנים וזמני האינקובציה בעת שילוב החומר להגברת התגובה האימונית.
- נדרש אימון להבטחת טיפול נכון בממברנה במהלך שלבי הריקון והסבב כדי לשמור על שלמות האות.
- מתאים ביותר למעבדות המבצעות western blots בתדירות גבוהה, שבהן החסכון בזמן מצטבר על פני מספר יעדים ותנאים.
