Name: מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: למדו הדמיית סידן in vivo באמיגדלה של עכברים באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר פעילות נוירונים בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות, ומספקת כלים חיוניים לחקר מנגנוני מוח ותגובות רגשיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של קרן המדע והטכנולוגיה של סמסונג (פרויקט מספר SSTF-BA1801-10).

<ol><li>Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+neuronal+representations+through+time+and+damage+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus.</a> Science. 365 (6455), 821-825 (2019).</li>
<li>Ghandour, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+ensemble+activities+constitute+a+hippocampal+memory+engram%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram.</a> Nature Communications. 10 (1), 2637(2019).</li>
<li>Grundemann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amygdala+ensembles+encode+behavioral+states%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amygdala ensembles encode behavioral states.</a> Science. 364 (6437), (2019).</li>
<li>Krabbe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+disinhibitory+gating+by+VIP+interneurons+permits+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning.</a> Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).</li>
<li>Betley, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+for+hunger+and+thirst+transmit+a+negative-valence+teaching+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal.</a> Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).</li>
<li>Jennings, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+hypothalamic+network+dynamics+for+appetitive+and+consummatory+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors.</a> Cell. 160 (3), 516-527 (2015).</li>
<li>LeDoux, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emotion+circuits+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Emotion circuits in the brain.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).</li>
<li>Burgoyne, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+calcium+sensor+proteins%3A+generating+diversity+in+neuronal+Ca2%2B+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).</li>
<li>Miyakawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+activated+increases+in+Ca2%2B+concentration+in+hippocampal+CA1+pyramidal+cells+are+primarily+due+to+voltage-gated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels.</a> Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).</li>
<li>Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+dynamics+in+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium dynamics in dendritic spines.</a> Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Zariwala, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Huber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Grewe, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+ensemble+dynamics+underlying+a+long-term+associative+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory.</a> Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Compact+Head-Mounted+Endoscope+for+In+vivo+Calcium+Imaging+in+Freely+Behaving+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51(2018).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Xiong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Cerebral+Vascular+Atlas+in+Stereotaxic+Coordinates+of+Whole+Mouse+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128(2017).</li>
<li>Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+cellular+signals+from+large-scale+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data.</a> Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).</li>
<li>Millhouse, O. E., DeOlmos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+configurations+in+lateral+and+basolateral+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala.</a> Neuroscience. 10 (4), 1269-1300 (1983).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+organization+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).</li>
<li>McDonald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+of+the+lateral+and+basolateral+amygdaloid+nuclei%3A+a+Golgi+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).</li>
</ol>

למחבר אין מה לחשוף

טכניקות ניתוח מיומנת חיוניות להשגת מוצלח בהדמיית סידן אופטי vivo עם מיקרוסקופיה מיניאטורית ראש הר באזורים עמוקים יותר במוח כגון האמיגדלה כפי שתיארנו כאן. לכן, למרות שפרוטוקול זה מספק קו מנחה לתהליכים כירורגיים ממוטבים של חיבור baseplate והשתלת עדשות GRIN, ייתכן שיהיה צורך בתהליכי אופטימיזציה נוספים לשלבים קריטיים. כפי שצוין בסעיף הפרוטוקול, קואורדינטות אמיגדלה בניתוח, מהירות זרימת אוויר בשלב מצורף baseplate, הגדרות רכישת תמונה (קצב מסגרות, כוח LED,וכו') בהקלטת סידן ומשתנים (משקל זמן ICA, זמן הריקבון הקטן ביותר א...

סידן הוא שליח שני בכל מקום, ממלא תפקיד מכריע כמעט בכל פונקציות הסלולר8. בנוירונים, ירי פוטנציאלי פעולה וקלט סינפטי לגרום לשינוי מהיר של חינם תאיים [Ca2+]9,10. לכן, מעקב אחר סידן חולף מספק הזדמנות לפקח על פעילות עצבית. GECIs הם כלים רבי עוצמה המאפשרים ניטור [Ca2+] באוכלוסיות תאים מוגדרות ותאים פנים-תאיים11,12. בין סוגים רבים ושונים של מחוון סידן מבוסס חלבון, GCaMP, בדיקה Ca2 + המבוססת על מולקולת GFP אחת13, הוא GECI אופטימיזציה ביותר ולכן בשימוש נרחב. באמצעות סבבים מרובים של הנדסה, מספר גרסאות של GCaMP פותחה12,14,15,16. אנו משתמשים באחד GCaMP שפותחו לאחרונה, GCaMP7b, בפרוטוקול זה16. חיישני GCaMP תרמו רבות לחקר תפקודי מעגלים עצביים במספר אורגניזמים לדוגמה כגון הדמיה של Ca2 + חולפים במהלך הפיתוח17, בהדמיית vivo בשכבה קליפתית ספציפית18, מדידת דינמיקת מעגלים בלמידה מוטורית19 והדמיה של פעילות הרכב התא הקשורה לזיכרון הפחד האסוציאטיבי בהיפוקמפוס ובאמיגדלה20,21.
הדמיה אופטית של GECIs יש מספר יתרונות22. קידוד גנטי מאפשר ל-GECIs לבוא לידי ביטוי ביציבות לתקופה ארוכת טווח בקבוצת משנה ספציפית של תאים המוגדרים על ידי פרופיל גנטי או דפוסים ספציפיים של קישוריות אנטומית. הדמיה אופטית מאפשרת ניטור בו זמנית של מאות עד אלפי נוירונים בבעלי חיים. כמה מערכות הדמיה אופטית פותחו עבור הדמיה ואנליזה של GECIs בתוך המוח של עכברים מתנהגים בחופשיות עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים מיניאטוריים הר הראש21,23,24,25. למרות טכניקת ההדמיה האופטית in vivo המבוססת על GECIs, עדשת GRIN, ומיקרוסקופ מיניאטורי להרכבת ראש להיות כלי רב עוצמה ללמוד את הקשר בין פעילות מעגל עצבי והתנהגות, החלת טכנולוגיה זו על האמיגדלה כבר קשה בשל מספר בעיות טכניות הקשורות מיקוד עדשת GRIN לתאים המבטאים GECIs באמיגדלה מבלי לגרום חפצי תנועה להפחית באופן חמור את איכות רכישת התמונה ומציאת תאים המבטאים GECIs. פרוטוקול זה נועד לספק קו מנחה מועיל עבור הליכים כירורגיים של התקשרות baseplate והשתלת עדשת GRIN כי הם צעדים קריטיים להדמיית סידן אופטי vivo מוצלח באמיגדלה. למרות פרוטוקול זה מטרות האמיגדלה, רוב ההליכים המתוארים כאן הם בדרך כלל ישימים לאזורים אחרים במוח עמוק יותר. למרות שפרוטוקול זה מבוסס על מערכת מסוימת (למשל, Inscopix), ניתן להשיג בקלות את אותה מטרה עם מערכות חלופיות אחרות.

<table><tbody><tr><td>מחט 26 גרם</td><td>BD</td><td>302002</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE</td><td>Addgene</td><td>104493-AAV1</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>AAV2/1-CaMKii&alpha;-GFP</td><td>בהתאמה</td><td></td> אישית <td>ניתוח</td></tr><tr><td>אקרילי-צמנט דנטלי (אורתו-ג'ט אקריליק ורוד)</td> <td>Lang</td><td>1334-ורוד</td><td>ניתוח & מצורף ללוחית בסיס</td></tr><tr><td>מניפולטור זרימת אוויר</td><td>Neurotar</td><td>NTR000253-04</td><td>חיבור לוחית בסיס</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>SIGMA</td><td>A8523-5G</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td></td><td>לוחית בסיס INSCOPIX</td><td>1050-002192</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי לוחית בסיס</td> מצורף <td>INSCOPIX</td><td>1050-002193</td><td>מצורף</td></tr> לוחית <tr><td>בסיס מכשיר התנהגותי (תא)</td> <td>קולבורן מבחן מכשיר</td><td></td><td>מבחן התנהגות</td></tr><tr><td>מכשיר התנהגותי (תוכנה)</td> <td>מכשיר קולבורן</td><td>הקפאת מסגרת</td><td>מבחן התנהגות</td></tr><tr><td>כלוב פחמן</td><td>נוירוטאר</td><td>180 מ"מ x 70 מ"מ</td><td>מצורף לוחית בסיס</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>SIGMA</td><td>PHR1452-1G</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד נתונים</td><td>INSCOPIX</td><td>INSCOPIX תוכנת עיבוד נתונים</td><td>לוחית בסיס התקשרות & מבחן התנהגות</td></tr><tr><td>דקסמתזון</td><td>SIGMA</td><td>D1756-500MG</td><td></td></tr><tr><td>תרגיל</td> ניתוח <td>מרתון סייאנג-4</td><td></td><td>תרגיל ניתוח</td></tr><tr><td>ELA</td><td></td><td>US1/2, Shank104</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מחט זכוכית</td><td>WPI</td><td>PG10165-4</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח עדשת GRIN (בדיקת עדשת INSCOPIX Proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-002208</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>המילטון מזרק</td><td>המילטון</td><td>84875</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>לוחית ראש</td><td>נוירוטאר</td><td>דגם 5</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מפתח משושה</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004195</td><td>מצורף לוחית בסיס</td></tr><tr><td>מחשב נייד</td><td>סמסונג</td><td>NT950XBV</td><td>כירורגיה & מחזיק עדשה לחיבור לוחית בסיס</td></tr><tr><td>, מוט סטריאוטקסי (ערכת שתל INSCOPIX proview)</td><td>INSCOPIX</td><td>1050-004223</td><td></td></tr><tr><td>תפסן מיקרוסקופ</td> כירורגי <td>INSCOPIX</td><td>1050-002199</td> מיקרוסקופ <td>חיבור ללוחית בסיס</td></tr><tr><td>, תוכנת DAQ, חומרה</td><td>INSCOPIX</td><td>nVista 3.0</td><td>חיבור לוחית בסיס & מבחן התנהגות</td></tr><tr><td>כלוב ביתי נייד</td><td>Neurotar</td><td>MHC V5</td><td>Baseplate Attachment</td></tr><tr><td>זרוע מוטרית Neurostar</td><td></td><td>ניתוח</td><td>מותאם אישית</td></tr><tr><td>תוכנת זרוע Moterized</td><td>Neurostar</td><td>ניתוח</td><td>מותאם אישית</td></tr><tr><td>לוח NI</td><td>מכשיר</td><td></td> לאומי <td>מבחן התנהגות</td></tr> קשר <tr><td>אפוקסי נשלף</td><td>WPI</td><td>Kwik-Cast</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>צמנט שרף (סופר-בונד)</td><td>סאן רפואי</td><td>סופר בונד C& B</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>בורג גולגולת</td><td>סטולטינג</td><td>51457</td><td></td></tr><tr><td>ניתוח מחזיק אלקטרודה סטריאוטקסית</td><td>ASI</td><td>EH-600</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מסגרת סטריאוטקסית</td><td>סטולטינג</td><td>51600</td><td>ניתוח</td></tr><tr><td>מניפולטור סטריאוטקסי</td><td>סטולטינג</td><td>51600</td><td>מצורף בסיס</td></tr></tbody></table>

מוצלח בהדמיית סידן vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות

Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse

ניטור בזמן אמת של פעילויות עצביות בבעלי חיים הנעים בחופשיות היא אחת הגישות המרכזיות לקשר פעילות עצבית להתנהגות. לשם כך, טכניקת דימות in vivo המזהה סידן חולף בנוירונים באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs), מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיניאטורי, ועדשת שבירה הדרגתית (GRIN) פותחה ויושמה בהצלחה על מבני מוח רבים1,2,3,4,5,6. טכניקת הדמיה זו חזקה במיוחד משום שהיא מאפשרת הדמיה סימולטנית כרונית של אוכלוסיות תאים מוגדרות גנטית לתקופה ארוכת טווח של עד מספר שבועות. למרות השימושיות, טכניקת הדמיה זו לא יושמה בקלות על מבני מוח המאתרים עמוק בתוך המוח כגון אמיגדלה, מבנה מוח חיוני לעיבוד רגשי וזיכרון פחד אסוציאטיבי7. ישנם מספר גורמים המקשה ליישם את טכניקת ההדמיה על האמיגדלה. לדוגמה, ממצאי תנועה מתרחשים בדרך כלל בתדירות גבוהה יותר במהלך ההדמיה שנערכה באזורי המוח העמוקים יותר מכיוון שמיקרוסקופ להרכבה על הראש המושתל עמוק במוח הוא יחסית לא יציב. בעיה נוספת היא כי החדר לרוחב ממוקם קרוב לעדשת GRIN המושתלת ותנועתו במהלך הנשימה עלולה לגרום לחפצי תנועה לא סדירים מאוד שלא ניתן לתקן בקלות, מה שמקשה על יצירת תצוגת הדמיה יציבה. יתר על כן, מכיוון שתאים באמיגדלה שקטים בדרך כלל במצב מנוחה או הרדמה, קשה למצוא ולמקד את תאי היעד המבטאים GECI באמיגדלה במהלך הליך baseplating להדמיה מאוחרת יותר. פרוטוקול זה מספק קו מנחה מועיל כיצד למקד ביעילות תאים המבטאים GECI באמיגדלה עם מיקרוסקופ מיניאטורי להרכבה על הראש להדמיה מוצלחת של סידן ויוו באזור מוח כה עמוק. יצוין כי פרוטוקול זה מבוסס על מערכת מסוימת (למשל, אינסקופיקס) אך אינו מוגבל אליה.

אימות השתלת עדשת GRIN לפני הצמדה כרונית של לוח הבסיס למוח על ידי מלט, השתלת עדשת GRIN צריכה להיות מאומתת. בבעלי חיים עם השתלת עדשה מוצלחת, הן תאי GCaMP מבטאים והן כלי דם נצפו בבירור בטווח מישור מוקדי שנקבע על ידי המרחק בין העדשה האובייקטיבית של מיקרוסקופ לבין עדשת GRIN מושתלת (איור 2A ו- B). לעומת זאת, בבעלי חיים עם השתלה מחוץ ליעד, תמונה ברורה של תאים מבטאים GCaMP לא נצפתה בתוך טווח המישור המוקד (או מחוץ לפוקוס או מחוץ לתצוגה). במקרה של...

דימות סידן מיקרונדוסקופי In vivo הוא כלי רב ערך המאפשר ניטור בזמן אמת של פעילויות עצביות בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות. עם זאת, יישום טכניקה זו על האמיגדלה היה קשה. פרוטוקול זה נועד לספק קו מנחה שימושי עבור מיקוד מוצלח תאי אמיגדלה עם מיקרוסקופ מיניאטורי בעכברים.

מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות

In vivo real-time monitoring of neuronal activities in freely moving animals is one of key approaches to link neuronal activity to behavior. For this ...

אתגרים רבים יכולים להתעורר בעת שימוש במיקרוסקופיה ממוזערת להדמיית סידן in vivo של האמיגדלה. פרוטוקול זה מספק הנחיות לחיסכון בזמן להשגת הדמיית סידן מוצלחת in vivo. הדמיית סידן in vivo מאפשרת הדמיה סימולטנית רציפה של אוכלוסיות תאים מוגדרות גנטית לאורך תקופה של עד מספר שבועות, תהליך שלא היה אפשרי בעבר.להזרקת AAV, כאשר העכבר המורדם מאובטח במסגרת סטריאוטקסית, יישר את גובה הברגמה והלמבדה עם הסיכה וזהה את המיקום הספציפי על הגולגולת החשופה והמחוטאת לקרניוטומיה. השתמש במקדחה המצוידת בביט של 0.6 מילימטר כדי לבצע בזהירות קרניוטומיה של 1.6 מילימטר עם מהירות קידוח של 18,000 סיבובים לדקה ולשטוף את הגולגולת ב-PBS סטרילי. הפחיתו את ההבדל הגב-וונטרלי בין הברגמה למשטח המוח החשוף מ-4.2 מילימטרים, את הקואורדינטה הדורסוובנטרלית של השתלת העדשה על בסיס ברגמה כדי לחשב את הערך מרחק A, וטענו שלושה מיקרוליטרים של שמן מינרלי ו-0.7 מיקרוליטר של יותר מ-1 כפול 10 לגנום הנגיפי ה-13 למיליליטר של תמיסת AAV לתוך פיפטה מזכוכית.הסר את הסיכה ממחזיק הבדיקה הסטריאוטקסית כדי לאפשר לקיבוע הפיפטה למסגרת ולמקם את הפיפטה מעל אתר ההזרקה המוכן. כאשר הדימום נעצר לחלוטין, הכנס את קצה פיפטת הזכוכית 4.3 מילימטרים לרקמת המוח מקואורדינטת הברגמה האחורית והשתמש במשאבת הזרקה כדי להעביר את כל נפח הנגיף לפני הסרה איטית של הפיפטה. לאחר הזרקת כל הנגיף, קדחו את הגולגולת פעמיים נוספות כפי שהודגם כדי לאפשר השתלה של שני ברגי גולגולת ושטפו את שברי הגולגולת עם PBS.לאחר מכן, השתלו את הברגים המעוקרים באתנול 70% עמוק ככל האפשר והתקינו זרוע ניתוח ממונעת על המסגרת הסטריאוטקסית. חבר את החומרה הנדרשת למחשב נייד עליו מותקנת תוכנת הבקרה והשתמש במחזיק צינורית כדי לאבטח ביציבות מחט בגודל 26 על המסגרת הסטריאוטקטית. לאחר חישוב הקואורדינטות עבור אתר החדרת המחט, השתמש במניפולטור הסטריאוטקסי כדי למקם את קצה המחט על פני השטח החשוף של המוח ולהרטיב את רקמת המוח עם שתיים עד שלוש טיפות של PBS.הזן את קואורדינטות האמיגדלה הדורסובנטרלית והרוחבית המתאימות לתוכנה ולחץ על GoTo כדי להוריד את המחט. כאשר המחט נעצרה לחלוטין, הזן 45 מילימטרים לתיבת מיקום ההתחלה ולחץ על GoTo כדי להרים את המחט. כאשר המחט מפסיקה לנוע, הסר את ה-PBS משטח המוח והסר את המחט ומחזיק הצינורית מהמסגרת הסטריאוטקסית.חבר את מחזיק העדשה למוט הסטריאוטקסי וקבע את עדשת ה-GRIN למחזיק העדשה. עקר את העדשה עם אתנול 70% והצמד את המוט הסטריאוטקסי למסגרת הסטריאוטקסית. מקם את קצה עדשת ה-GRIN באתר המיועד על פני המוח והחסר את הערך המוחלט של A מהקואורדינטה הדורסובנטרלית של פני המוח כדי לקבוע את הקואורדינטה הדורסובנטרלית להשתלת עדשה.הרטיבו את רקמת המוח עם שתיים עד שלוש טיפות נוספות של PBS והשתמשו בזרוע הממונעת כדי להגדיר את עומק ההורדה ל-1,000 מיקרומטר ואת גובה ההרמה ל-300 מיקרומטר. כאשר עדשת ה-GRIN מגיעה לאתר היעד, הסר את ה-PBS ומרח בזהירות מלט דנטלי שרף סביב עדשת ה-GRIN, הברגים ודפנות הברגים. כאשר המלט הדנטלי התקשה, הסר את מחזיק העדשה מהעדשה ומרח מלט אקרילי על משטח הגולגולת.לאחר מכן, החלף את מחזיק העדשה בלוחית ראש המודבקת לקצה המוט בכיוון אופקי. הורד לאט את המוט עד שלוחית הראש ממוקמת בחלק העליון של שרוול העדשה לפני הורדת לוחית הראש 1,000 מיקרומטר עד שהעדשה ממוקמת בקצה הימני של הטבעת הפנימית של לוחית הראש. השתמש במלט אקרילי כדי לחבר את לוחית הראש לשכבות המלט והשתמש בסרט פרפין כדי להגן על משטח עדשת ה-GRIN המושתל מפני אבק, ולאחר מכן החל קשר אפוקסי נשלף על סרט הפרפין כדי להדק את הסרט למשטח העדשה ולהחזיר את החיה לכלוב שלה עם ניטור עד לשכיבה מלאה.כדי להעריך את איכות השתלת עדשת ה-GRIN, הנח כלוב פחמן מתחת לעכבר המורדם על מוט הראש של מערכת כלוב ביתית ניידת והפעל את זרימת האוויר כך שהכלוב ינוע בחופשיות ללא חיכוך. השתמש בתופס מיקרוסקופ ובמניפולטור סטריאוטקסי כדי ליישר אנכית מיקרוסקופ ממוזער למסגרת לפני הורדת המיקרוסקופ עד שפני השטח של עדשת ה-GRIN המושתלת יופיעו בשדה הראייה של התמונה בתוך התוכנה. יישר את מרכז עדשת ה-GRIN המושתלת עם מרכז שדה הראייה וצלם את התמונה של משטח עדשת ה-GRIN המושתל, ולאחר מכן הרם לאט את עדשת האובייקט של המיקרוסקופ תוך התבוננות בתמונה למראה תאים מבטאים GCaMP.בבעלי חיים עם השתלת עדשה מוצלחת, ניתן להבחין בבירור הן בתאי ביטוי GCaMP והן בכלי דם בטווח מישור מוקד יחיד. לעומת זאת, בבעלי חיים עם השתלה מחוץ למטרה, תמונה ברורה של תאים המבטאים GCaMP אינה נצפית בטווח מישור המוקד, אם כי ניתן לצפות בכלי הדם בקושי מסוים. במקרה של עדשה מחוץ לטווח הראייה, לא ניתן לדמיין כלי דם או תאים המבטאים GCaMP וניתן לראות קצה בהיר על עדשת ה-GRIN המושתלת.בבעלי חיים עם השתלת עדשת GRIN מוצלחת, כ-50 עד 150 תאים פעילים באופן ספונטני מציגים בדרך כלל שינוי פלואורסצנטי משמעותי בשדה הראייה באמיגדלה הצדדית גם ללא גוון. עם הצגת הצלילים, רק תאים מעטים מציגים שינוי ספציפי לטון של אות GCaMP כפי שנקבע על ידי ניתוח תמונה דלתא F. כאשר אותו ניתוח נערך על עכברים שהוזרקו עם AAV המבטא GFP כבקרה, תאים המבטאים GFP מזוהים בטווח מישור המוקד ואף תא לא מציג שינוי פלואורסצנטי משמעותי עם או בלי טון.אימות היסטולוגי של ביטוי GCaMP ומיקוד עדשת GRIN אינו מגלה סימן לנזק לרקמות עקב דלקת ברקמת המוח סביב עדשת ה-GRIN. אם מהירות המחט או העדשה אינה עקבית, היא עלולה לגרום לחפצי תנועה ולאיכות תמונה ירודה. שימוש בזרוע ניתוח ממונעת יכול לעזור.אם מערכת הטיפול הביתית הניידת אינה מוכנה במהלך שלב חיבור לוחית הבסיס, ניתן להשתמש בריכוז נמוך של גז איזופלורן כדי להרדים את העכבר במהלך חיבור לוחית הבסיס.

successful-vivo-calcium-imaging-with-head-mount-miniaturized

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

מקור: Lee, H. et. al., הדמיית סידן מוצלחת in vivo עם מיקרוסקופ ממוזער המותקן על הראש באמיגדלה של עכבר שמתנהג בחופשיות. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית סידן in vivo בעכבר באמצעות מקדם שבירה שיפוע, או עדשת GRIN, ומיקרוסקופ ממוזער. המערך משלב קיבוע ראש בתוך מערכת כלובים ניידת ללא חיכוך, מגרה נוירונים ומעורר זרם יוני סידן. עדשת GRIN לוכדת איתות סידן במוח, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית.

הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית בזמן אמת בעכבר הנע בחופשיות

מקור: Thapa, R., et. al., הזרקה ויראלית סטריאוטקסית והשתלת עדשות אינדקס שיפוע למוח עמוק  In Vivo הדמיית סידן.  J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הדמיית סידן בזמן אמת באמצעות מיניסקופ בעכבר שעבר התמרה, ומתאם בין פעילות עצבית להתנהגות.

הדמיית סידן בזמן אמת של קליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית של עכבר באמצעות מיניסקופ

כאן אנו מתארים את הפרוצדורות כרוכות בהדמיה שני פוטונים של קליפת המוח עכבר בהתנהגות בסביבת מציאות מדומה.

סידן הדמיה שני פוטונים בעכברים ניווט סביבת מציאות מדומה

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המשלב הזרקת וירוסים הקשורים באדנו עם השתלת חלון גולגולתי לצורך הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים.

הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

פרוטוקול זה מפרט את ההליך לדימות תגובות סידן בקוליקולוס העליון (SC) של עכברים ערים, כולל הדמיה של פעילות נוירון יחיד במיקרוסקופ של שני פוטונים תוך השארת קליפת המוח שלמה בעכברי בר, והדמיית ה-SC כולו במיקרוסקופ רחב שדה בעכברים מוטנטיים בעלי קליפת מוח חלקית.

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

פרוטוקול זה חוקר את הקשר בין המוח להתנהגות בהיפוקמפוס CA1 בעכברים המנווטים בפלומת ריח. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב, כולל ניתוח לגישה להדמיה של ההיפוקמפוס, אימון התנהגותי, הקלטה ועיבוד של המוח במיניסקופ GCaMP6f, ונתונים התנהגותיים לפענוח מיקום העכבר מפעילות עצבית ROI.

מיניסקופ מקליט אותות סידן בהיפוקמפוס של עכברים המנווטים בפלומת ריח

פרוטוקול זה מפרט הדמיית סידן ב-vivo של נוירונים היפותלמיים באמצעות מיקרוסקופ מוקטן (מיניסקופ) בעכברים המתנהגים בחופשיות במהלך מניפולציה של מצב חברתי (בידוד חברתי ואיחוד חברתי). שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה של נוירון יחיד של פעילות ההיפותלמוסית שמייצגת צורך חברתי וסיפוק חברתי, ומאפשרת מחקרים מכניים של הומאוסטזיס חברתי.

In Vivo הדמיית סידן עם מיקרוסקופ מיניאטורי בהיפותלמוס להבנת התנהגויות חברתיות בעכברים

למדו הדמיית סידן in vivo באמיגדלה של עכברים באמצעות מיקרוסקופ מיניאטורי. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת אחר פעילות נוירונים בבעלי חיים מתנהגים בחופשיות, ומספקת כלים חיוניים לחקר מנגנוני מוח ותגובות רגשיות.

מוצלח בהדמיית סידן Vivo עם מיקרוסקופ מיניאטורי ראש הר באמיגדלה של עכבר מתנהג בחופשיות

גלה סרטונים נוספים