אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים
6 באוקטובר 2020
מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.
טרנספקציה של גנים היא גישה חיונית למחקרי נוירוביולוגיה. טכניקת האלקטרופורציה שלנו מאפשרת לנו להעביר אינטרנוירונים של גנים מעניינים בתרבית פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות ללא תופעות לוואי הניתנות לזיהוי. לפרוטוקול זה יש יעילות טרנספקציה גבוהה בהרבה בהשוואה לפרוטוקולים אחרים של תא בודד, אך הוא עדיין זול יחסית ופשוט לביצוע.
טכניקה זו תהיה שימושית לחוקרים המעוניינים בהבנת פונקציות מולקולריות ופיזיולוגיות ספציפיות של נוירונים, כולל מנגנונים אוטונומיים של תאים ואינטראקציות חלבון טרנס-סינפטיות. כדי להכין תרביות פרוסות לאלקטרופורציה, העבירו את תוספות התרבות המעניינות לצלחות פטרי בודדות של שלושה סנטימטרים עמוסות ב-900 מיקרוליטר של מדיום תרבית, והניחו את התרביות בחממת פחמן דו חמצני על השולחן. לאחר מכן, תוספות תרבית טרייה לפני הדגירה עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית פרוסות לכל תוספת בצלחת פטרי של 3.5 סנטימטר למשך 30 דקות לפחות, ועיקרו את קווי אסדת האלקטרופורציה עם 10% אקונומיקה למשך חמש דקות.
בתום הזילוף, שטפו את הקווים במים המיוננים למשך 30 דקות לפחות לפני החדרה עם ACSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 טטרודוטוקסין מילי-מולרי. הגדר את דופק האלקטרופורטור למשרעת של מינוס חמישה וולט, דופק מרובע, רכבת של 500 אלפיות השנייה, תדר של 50 הרץ ורוחב דופק של 500 מיקרו-שניות. מלאו פיפטה מזכוכית בחמישה מיקרוליטרים של תמיסה פנימית המכילה פלסמיד, והחליקו בעדינות והקישו על הקצה מספר פעמים כדי להסיר בועות כלואות.
השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי לוודא שהקצה אינו פגום, והצמד היטב את קצה הפיפטה לאלקטרודה. כאשר הקצה יוצר מגע עם ה-ACSF, רשום את קריאת התנגדות הפיפטה של האלקטרופורטור. כדי לבודד תרבית פרוסה, חותכים את קרום הכנסת התרבות עם להב חד, והשתמש במלקחיים בזווית חדה כדי להעביר בזהירות את תרבית הפרוסות לתא האלקטרופורציה.
ואז תקן את מיקום התרבות עם עוגן פרוסה. לצורך אלקטרופורציה של התאים המעניינים, הפעל לחץ חיובי על הפיפטה דרך הפה, והשתמש בפקדי הכפתור התלת מימדיים כדי לתמרן את קצה הפיפטה קרוב לפני השטח של תרבית הפרוסות. בצפייה בתרבית במיקרוסקופ, התקרב לתא המטרה עם הקצה, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על פני התא.
עם הדמיה של הגומה, הפעל במהירות לחץ שלילי קל דרך הפה כך שייווצר אטימה רופפת בין קצה הפיפטה לקרום הפלזמה. הממברנה תיכנס מעט לפיפטה. יש להבחין בעלייה של פי 2.5 בערך בהתנגדות הראשונית של הפיפטה, כפי שמצוין על ידי עלייה בטון מהרמקולים.
הפעל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שהגומה תשתנה. לאחר מכן השלם מיד לפחות שני מחזורי לחץ נוספים כפי שהודגם זה עתה ללא הפסקה. לאחר דופק הלחץ האחרון, החזק את הלחץ השלילי למשך שנייה אחת.
כאשר הצליל מהרמקולים מגיע לקודקוד יציב בגובה הצליל, השתמש בדוושת הרגל כדי לדופק במהירות את האלקטרופורטור. לאחר האלקטרופורציה, החזירו בעדינות את הפיפטה כ-100 מיקרון מהתא מבלי להפעיל לחץ, והפעילו שוב לחץ חיובי, וודאו שההתנגדות דומה לקריאת קו הבסיס לפני שמתקרבים לתא הבא. לאחר שכל התאים המעניינים עברו אלקטרופורציה, העבירו את תרבית הפרוסות לאחת מתוספות התרבית הטריות המוכנות, והניחו את התוספת בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה ימים.
בניסוי מייצג זה, EGFP הועבר לחמישה עד 20 נוירונים פירמידליים באזור CA1 בהיפוקמפוס על פני שבעה, 14 ו-21 ימים בגילאי תרבית פרוסות מבחנה. פרוואלבומין ושלפוחית גלוטמט סוג 3 יכולים גם הם להיות אלקטרופוטיים בהצלחה באזור CA1 בהיפוקמפוס. מעניין שטרנספקציה אינה מושפעת באופן משמעותי מגיל תרבית פרוסות מבחנה, ואינה שונה מיעילות הטרנספקציה שנצפתה בנוירונים פירמידליים CA1.
תאי עצב הם מאוד שבריריים. עליך להיות זהיר ועדין ביותר כאשר אתה מתקרב ולוחץ על התאים ומחזיר את קצה הפיפטה לגרימת נזק חמור. לאחר האלקטרופורציה, התאים יכולים לעבור ניתוחים ניסיוניים שונים, כולל אלקטרופיזיולוגיה והדמיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לאלקטרופורציה של תא בודד המאפשרת החדרה של גנים לנוירונים מעוררים ומעכבים בתרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות. טכניקה זו מאפשרת בקרה מדויקת על ביטוי גנים, ובכך מקלה על חקירת מנגנונים אוטונומיים של התא ואינטראקציות בין-תאיות בשלבי התפתחות שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- טרנספקציית גנים
- אלקטרופיזיולוגיה
רקע
- טרנספקציית גנים היא קריטית למחקר נוירוביולוגי.
- אלקטרופורציה מאפשרת יעילות טרנספקציה גבוהה עם מינימום תופעות לוואי.
- השיטה פשוטה וזולה יחסית בהשוואה לטכניקות אחרות.
- הבנת תפקודים מולקולריים ופיזיולוגיים בנוירונים היא חיונית לנוירוביולוגיה.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה יעילה להחדרת גנים (טרנספקציה) לאוכלוסיות נוירונים.
- חקר תפקודים ומנגנונים מולקולריים ספציפיים בנוירונים מעוררים ומעכבים כאחד.
- הערכת יעילות הטרנספקציה בגילאים שונים של תרביות פרוסות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורציה בוצעה על תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות.
- נוירונים פירמידליים ונוירונים אינטרנוינליים היו המודלים הביולוגיים המרכזיים ששימשו למחקר.
- יעילות הטרנספקציה נבדקה בפרוסות בגילאים שונים (7, 14 ו-21 ימים in vitro).
- השלבים המפורטים כוללים הכנה, טכניקות פיפטאציה ומעקב אחר שינויים בהתנגדות.
- פגיעות בתאים במהלך התהליך צומצמו באמצעות מניפולציה זהירה.
תוצאות עיקריות
- הושגה יעילות גבוהה של טרנספקציית גנים בנוירונים המטרה, ללא הבדלים משמעותיים בין הגילאים השונים של תרביות הפרוסות.
- האלקטרופורציה לא השפיעה לרעה על החיוניות, ושמרה על השלמות התאית לאחר הטרנספקציה.
- השיטה אפשרה מחקרים מפורטים על תגובות פיזיולוגיות ומנגנוני אינטראקציה פוטנציאליים בין נוירונים.
- הודגמה גם טרנספקציה מוצלחת של נוירונים בינ-נוירונליים מסוג parvalbumin ו-vesicular glutamate transporter 3.
מסקנות
- מחקר זה מציג פרוטוקול חסון לטרנספקציית גנים בתרביות נוירונליות, המרחיב את יכולות המחקר בביולוגיה של מערכת העצבים.
- השיטה מניחה את התשתית לחקירות נוספות של מנגנונים נוירונליים ותפקודים בין-תאיים.
- הבנת תהליכים אלו חיונית להשגת תובנות לגבי פלסטיות נוירונלית ויישומים טיפוליים פוטנציאליים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אלקטרופורציה של תא בודד בתרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות מאפשרת הובלה מדויקת של גנים לנוירונים מעוררים ומעכבים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילויים בתחום מדעי המוח. השיטה מספקת יעילות טרנספקציה גבוהה (~80%) לאורך שלבי התפתחות שונים, מה שמאפשר סריקת פנוטיפ עקבית ופיתוח בדיקות לחקירת מסלולים ביולוגיים. גישה זו מפחיתה אי-ודאות ביולוגית בבדיקה מוקדמת של היפותזות לגבי מטרות, על ידי מתן אפשרות למחקרי ביטוי גנים כמותיים וניתנים לשחזור במערכות נוירונליות רלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בנוירונים עירוריים ובנוירונים מעכבים ספציפיים למחלקה בהיפוקמפוס.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי קישור ביטוי גנים למדדים פיזיולוגיים במעגלים מיקרוסקופיים שלמים.
- ערך תפעולי: משיג יעילות טרנספקציה גבוהה ללא תופעות לוואי ניתנות לזיהוי, ובכך מפחית את השונות הניסויית.
- ערך תפעולי: יעיל בטווח גילאים של תרביות פרוסות (7–21 days in vitro), מה שמאפשר מחקרי סדרת זמן של מעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: הכנת מערכות נוירונליות שעברו ולידציה עבור בדיקות אלקטרופיזיולוגיה ודימוי בהמשך התהליך.
- ערך מדעי: אספקת נתונים כמותיים ברזולוציית תא בודד על תפקוד גנים ואינטראקציות בין חלבונים.
- ערך תפעולי: שימוש בציוד אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטי, המאפשר שילוב ניתן להרחבה בתהליכי עבודה קיימים.
- ערך תפעולי: שמירה על יעילות טרנספקציה לאורך תקופות תרבית ממושכות, התומכת במערכי סריקה אורכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מעגלים היפוקמפליים רלוונטיים למחלה לצורך חקר מנגנוני מטרה בהקשרים פתופיזיולוגיים.
- ערך מדעי: מאפשר הערכה של אינטראקציות חלבוניות טרנס-סינפטיות ומנגנונים תאיים-אוטונומיים.
- ערך תפעולי: מקל על הרצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על בריאות הנוירונים לאחר טרנספקציה.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מבוססות ניהול סיכונים באמצעות הובלה אמינה וחוזרת של גנים בתרביות נוירונים ראשוניות.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזת המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), ובכך היא מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטיים לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באוכלוסיות של נוירונים בהיפוקמפוס.
- סריקה: מספק מערכות מוכנות לבדיקה עם טרנספקציה ניתנת לשחזור ותוצרים כמותיים להערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר ניטור מבוסס עמידות ומדידות אלקטרופיזיולוגיות כדי לקשר בין ביטוי גנים לפנוטיפים תפקודיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מחקרי תפקוד גנים להמשכיות פרה-קלינית באמצעות טרנספקציה יציבה בחתכים אורגנוטיפיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ממנף תשתיות אלקטרופיזיולוגיות קיימות, וממצב את השיטה כפלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לתיקוף מטרות נוירונליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות הובלת גנים ביעילות גבוהה ורעילות נמוכה בנוירונים ראשוניים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרמטרי פולסים עקביים ופרוטוקול מחזורי לחץ.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במעורבות מטרה נוירונלית.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מותאם סיכונים באמצעות הערכה מהימנה של תפקוד גנים במחלקות נוירונליות ובשלבי התפתחות שונים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה ובמניפולציה של מיקרופיפטים לצורך מיקוד בתא בודד.
- תלוי באלקטרודות זכוכית, באלקטרופורטור וב-ACSF סטרילי עם טטרודוטוקסין לשמירה על בריאות הנוירונים.
- מחייב סטנדרטיזציה של רצפי פולסי לחץ וניטור התנגדות בין משתמשים שונים.
- שיקולי התאמה כוללים כיוונון של ריכוז הפלסמיד ורוחב הפולס עבור סוגי נוירונים שונים או גדלי גנים שונים.
- מגבלה מעשית: שבירות הנוירונים מחייבת טכניקה קפדנית כדי למנוע קריעה של הממברנה במהלך מחזורי הלחץ.
