בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

שיטה יעילה חדשה זו לבידוד subpopulations של spermatocytes ו spermatids מעכברים בוגרים ניתן להשתמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס meiosis ו spermatogenesis. שיטה זו משתמשת בצבע מחייב DNA ציטוטוקסיות נמוך עם ספקטרום גירוי רחב שניתן להחיל על רוב ההזמנות המשמשות כיום FACS. שיטה זו היא פשוטה מאוד.

ההיבט המאתגר ביותר הוא גתיון ציטומיית הזרימה, אך אסטרטגיית הגתות המפורטת אמורה לסייע בהתאמת הפרוטוקול למיון תאים אחרים. הפגנת ההליך תהיה יו-האן יה, עוזרת מחקר במעבדתו של סאטושי נמקאווה. לאחר קצירת שני האשכים מעכבר זכר בן שמונה שבועות, מניחים את הרקמות בצלחת פטרי 60 מילימטר המכיל שני מיליליטר של קרח קר PBS ולהסיר את אלבינאה טוניקה.

מפרידים בעדינות את האשכים עם מדפים כדי לפזר מעט את הצינורות החצי-חצי-חצי. ולהעביר את הצינורות לתוך טיפה של PBS קר קרח טרי בצלחת פטרי 100 מילימטר. השתמש במטחנים כדי להתיר בעדינות את הצינוריות ולשטוף את הצינורות בשלוש טיפות נוספות של PBS כפי שהוכח רק.

לאחר הכביסה האחרונה, מניחים את הצינורות החצי-חצי-בלתי-מגולסלים בצינור של 15 מיליליטר, המכיל שני מיליליטר של חיץ דיסוציאציה עבור דגירה של 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, השתמש פיפיטה 1000 מיקרוליטר בעדינות pipette הצינורות 20 פעמים, לפני החזרת הצינור לאנקובטור במשך שש דקות נוספות. בסוף הדגירה, פיפטה את הרקמות 20 פעמים נוספות, לפני החזרת הצינור לאנקובטור.

לאחר שלוש דקות, בעדינות pipette הצינורות 10 פעמים או עד לא חתיכות רקמה גלוי להישאר, לפני עצירת הדיסוציאציה עם 10 מיליליטר של חיץ FACS. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה רקמה פעמיים באמצעות 10 מיליליטר נוספים עבור חיץ FACS טרי עבור לשטוף השני כדי להסיר את spermatozoa וכמה שיותר פסולת ככל האפשר. כדי להכתים את התאים לניתוח ציטומטרי של זרימה, השהה מחדש את גלולת הכדור בשלושה מיליליטר של מאגר FACS.

ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרון, לתוך צינור 50 מיליליטר. לאחר הספירה, להעביר 10% מהתאים לתוך צינור חדש על הקרח כמו שליטה שלילית נגועה. ומערבבים ביסודיות שישה מיקרוליטרים של כתם DCV לתוך ההשעיה הנותרת של התא.

לאחר דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך עם רעידות עדינות כל 10 דקות, להוסיף חמישה microliters של DNase אני לתאים. ולסנן את התאים דרך מסננת רשת ניילון 35 מיקרון לתוך צינור FACS חמישה מיליליטר על קרח. לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה של התאים, צור ניסוי חדש בתוכנת ניתוח הזרימה ותחת תפריט כלי גליון העבודה, לחץ על צפיפות חדשה כדי ליצור אזור פיזור קדימה לעומת התוויית צפיפות אזור backscatter בקנה מידה ליניארי.

לחץ על היסטוגרמה חדשה כדי ליצור התוויית היסטוגרמה בצבע כחול DCV בקנה מידה לוגריתמי. ולחץ על התחל והקליט כדי להתחיל לעבד את הדוגמה שאינה מוכתמת. בזמן שהדגימה פועלת, לחץ על הגדרות גלאי וסף כדי להתאים הן את מתחי PMT של פיזור קדימה והן לצד כדי למקם את התאים שאינם נגועים בסולם התוויית פיזור קדימה ואחיד.

התאם את מתח PMT עבור ערוץ jappy כדי לאתר את המיקום של האוכלוסייה השלילית DCV בעשור הראשון של העלילה לוגריתמית היסטוגרמה כחול DCV. לאחר מכן, לחץ על עצור כדי לבטל את טעינת הדגימה שאינה נגועה. לאחר מערבולת קצרה וטעינת המדגם המוכתם, לחץ על הצינור הבא כדי ליצור גליון עבודה חדש עבור המדגם.

הגדר את הציטרומטר לרכוש לפחות פעם אחת 10 עד ששת האירועים, ולחץ על התחל והקליט. לאחר מכן, לחץ על צפיפות חדשה כדי ליצור גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה. ו DCV כחול לעומת DCV צפיפות אדומה חלקות בקנה מידה ליניארי.

באזור פיזור קדימה לעומת התוויית צפיפות אזור backscatter, השתמש בכלי מצולע כדי לצייר שער שנקרא תאים כדי לכלול את רוב התאים ולא לכלול פסולת קטנה. החל שער זה על גובה פיזור קדימה לעומת התוויית רוחב פיזור קדימה ולהשתמש בכלי המלבן כדי לצייר שער של תא בודד כדי לא לכלול תאים שאינם בודדים. החל את שער התא הבודד על התוויית הצפיפות האדומה DCV כחול לעומת DCV והתאם את קנה המידה כדי ללכוד פרופיל מורחב.

השתמש בכלי מצולע כדי לצייר שער DCV כדי לא לכלול את התאים שאינם נגועים ואת אוכלוסיית הצד, ולהחיל את השער על התוויית היסטוגרמה כחולה DCV בקנה מידה ליניארי. שלוש הפסגות העיקריות מתייחסות לתכולת הדנ"א השונה של 1C, 2C ו- 4C. צור תרשים צפיפות אדום DCV שני לעומת DCV בקנה מידה ליניארי.

ושער אחורי שער DCV על החלקה כדי לאתר את אוכלוסיות 1C ו 4C. צור תרשים נוסף של צפיפות אדומה בצבע כחול DCV לעומת DCV בקנה מידה ליניארי. ולהשתמש בכלי אליפסה כדי לצייר שער על האוכלוסייה 1C.

השתמש בכלי מצולע כדי לשער את אוכלוסיית 4C עם עקומה רציפה. וליצור עוד התוויית צפיפות אדומה DCV כחול לעומת DCV בקנה מידה ליניארי. השתמש בכלי מצולע כדי ליצור שער אחד 4C.

בחלקת פיזור חדשה קדימה, השתמש בכלי האליפסה כדי ליצור שערי פצ'יטן, דיפלוטן ולפטוטן, זיגוטן זרע. כאשר כל השערים צוירו, צור עלילה חדשה של נקודה בצבע כחול DCV לעומת DCV בצבע אדום בקנה מידה ליניארי כדי להחיל את השער עבור 4C כדי להבטיח ששלוש האוכלוסיות נמצאות בסדר מתמשך בתוך השער. לאחר מכן, צור אזור פיזור קדמי חדש לעומת התוויית צפיפות אזור backscatter בקנה מידה ליניארי, ובחר את הגודל המאוחד של תאים כאוכלוסיית זרע עגולה טהורה.

לאחר המיון, הטהרונים הייצוגיים של שברי הלפטוטן המופרד, הזיגוטן, הפצ'יטן והדיפלוטן הם בדרך כלל בין 80% ל -90% כפי שאושרו על ידי SYCP3 ו- Gamma H2AX immunostaining. הטוהר של סיעת spermatid עגול יכול להיות מאושר על ידי כתמי גרעין עם DCV בשילוב עם Sp56 וכתמים H1t, והוא גם בדרך כלל סביב 90%הכדאיות של אוכלוסיות התאים המבודדים הוא בדרך כלל מעל 95%ואת התשואה הכוללת הממוצעת של כל שבר מעכבר מבוגר אחד הוא בדרך כלל מספיק לניתוח במורד הזרם שונים. התאים ממוינים יכול לשמש לניתוח רצף הדור הבא שונים כדי לחקור טוב יותר ביטוי גנים ורגולציה במהלך spermatogenesis.