ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

SM FISH מכמת במדויק את הרמות והלוקליזציה של RNase ספציפי. שיטה זו שימושית במיוחד לניתוח תא לתא ואלל על ידי וריאציה של אלל ב-RNA. שעתוק גנים הוא תהליך חיוני בביולוגיה של התא, SM FISH מאפשר לחקור את תכולת ה-RNA בתגובה לגירויים חיצוניים ברמת התא הבודד ולספק מידע מרחבי.

לאחר טיפול אגוניסט לקולטן אסטרוגן, שטפו את התאים עם PBS סטרילי קר עם סידן ומגנזיום וקבעו את התאים עם 500 מיקרוליטר של מאגר קיבוע למשך 30 דקות על קרח. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי קר עם סידן ומגנזיום למשך שלוש דקות לפני הוספת 500 מיקרוליטר של 70% אתנול לכל באר. לאחר מכן אטמו את צלחת 24 הבאר בסרט פלסטיק פרפין והניחו את הצלחת על מסובב בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות ועד 16 שעות.

עבור הכלאת RNA FISH, בתום הדגירה שוטפים את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של מאגר SSC 2X בתוספת 10% פורממיד למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על מסובב. במהלך הדגירה, הניחו חתיכת סרט פלסטיק פרפין לא חשוף כלפי מעלה לתוך צלחת פטרי מזכוכית מנוקה עם משטח RNA והניחו על מגבות נייר סטריליות רוויות במים לאורך שולי המנה. בסוף הדגירה, הנח 30 טיפות מיקרוליטר במרווחים שווים של מאגר בדיקה אקסון טרי שהוכנו לאינטרון GREB1 ו-GREB1 על הצד הנקי של סרט הפלסטיק של הפרפין והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להניח בעדינות החלקה אחת של תאים בצד התא כלפי מטה על כל טיפה ללא בועות.

לאחר איטום המנה בסרט פלסטיק פרפין, מכסים את הצלחת בנייר כסף ודוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס על משטח שטוח שאינו מסתובב. למחרת בבוקר, השתמש במלקחיים כדי להחזיר את החלקות הכיסוי לצד תא צלחת 24 הבארות כלפי מעלה לשתי שטיפות של 15 דקות ב-500 מיקרוליטר של מאגר SSC 2X טרי בתוספת 10% פורממיד לשטיפה ב-37 מעלות צלזיוס על מסובב מחומם. לאחר הכביסה השנייה, כתם את ה-DNA עם מיקרוגרם אחד למיליליטר של DAPI במאגר SSC 2X למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב ולאחר מכן שטיפה של חמש דקות במאגר SSC 2X בטמפרטורת החדר.

השתמש במגבת נייר כדי להסיר את מאגר ה-SSC העודף 2X ושטוף את הדגימות במים נטולי נוקלאז כדי לסלק עודפי מלחים. לאחר מכן השתמש במדיום הרכבה שאינו מתקשה כדי להרכיב את החלקות הכיסוי על שקופיות זכוכית ולאטום את החלקות הכיסוי עם לק שקוף. להדמיה לדוגמה, טען את השקופית בעוצמה הצפויה הגבוהה ביותר על שלב מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בשדה רחב המצויד באובייקט שמן פי 60 או 100 במצלמת sCOMS והנח טיפה של שמן טבילה על המטרה.

לרכישת Zstack, התמקד בדגימה בערוץ DAPI ובחר את החלק העליון והתחתון של ה-Zstack במרחקים שבהם הגרעינים המוכתמים ב-DAPI יוצאים מהמיקוד. השתמש בשקופית כדי למטב את כמות התאורה ממקור האור וזמני החשיפה עבור כל ערוץ וקבל תמונות מכל השקופיות בתנאים המונעים הלבנת תמונות או רוויית פיקסלים של המצלמה. לאחר הרכישה, השתמש ב-10 מחזורים של אלגוריתם משקם אגרסיבי כדי לפרק את התמונות ולשמור את כל תמונות ההקרנה בהתאם לעומק הסיביות של המצלמה בה נעשה שימוש.

לניתוח תמונה, הורד תחילה את Jupiter Notebook מ-GitHub והתקן את Python Anaconda Distribution גרסה 3.6 ומעלה. פתח את שורת Anaconda והזן את פקודת ההתקנה כדי להתקין את SimpleITK עבור Anaconda. פתח את Anaconda Navigator והפעל את Jupiter Notebook.

ייפתח דפדפן אינטרנט המציג ספריות וקבצים. דפדף במבני הספריות כדי להגיע לספרייה המכילה את מחברת יופיטר שהורדת מ-GitHub. לאחר מכן פתח את המחברת והקש Shift ו- Enter כדי להפעיל כל תא.

בניסוי מייצג זה, תאי סרטן שד דבקים טופלו באגוניסט קולטן אסטרוגן, או רכב, למשך 24 שעות. ערכות בדיקה מופרדות ספקטרלית כנגד רצפים אינטרוניים ואקסוניים של GREB1 אפשרו הדמיה וכימות בו זמנית של mRNA מתהווה ובוגר. חשוב לציין, ניתן לסמן את מספר האללים הפעילים מבחינה שעתוק בכל תא שהוכח כחלק ממהלך זמן התגובה של אסטרוגן.

בספירת כתמי האינטרון והאקסון החופפים, התאים שטופלו ב-E2 נקבעו כבעלי חלק מוגבר פי ארבעה של תאים המציגים שני אללים פעילים או יותר של GREB1 בהשוואה לתאים שטופלו ברכב. מכיוון שאינטרונים מחוברים מתוך mRNA מתהווה כדי לייצר mRNA בוגר המורכב מרצפי אקסונים בלבד, ניתן לספור את מספר ה-mRNA הבוגר לכל תא על ידי כימות מספר הכתמים הירוקים. שרטוט נתונים אלה מאפשר לראות את השינוי בהתפלגות של תא mRNA GREB1 בוגר ואת שינוי הקפל המצטבר באוכלוסיית התאים לאחר טיפול ב-E2.

C-FISH מאפשר לחקור מיני RNA מרובים ברצף, MERFISH היא טכניקת ברקוד להגברת ריבוב מסיבי, ו-iFISH משמשת לחקר RNA וחלבונים בו זמנית.