זיהוי SERS כמותי של חומצת שתן באמצעות היווצרות של ננו-צווים פלסמוניים מדויקים בתוך אגרגטים של ננו-חלקיקי זהב ו-Cucurbit[n]uril

פרוטוקול זה מציע שיטה רב-תכליתית לאיתור וכימות חומצת שתן ברגישות גבוהה. לפיכך, זהו פרוטוקול ליישומים אבחנתיים וקליניים. פרוטוקול זה יכול לכמת במהירות סמנים ביולוגיים במטריצה מורכבת, כגון נוזלי גוף.

ניתן להרחיב טכניקה זו לאבחון מחלות המשתמשות בחומצת שתן כסמן ביולוגי כגון צנית, יתר לחץ דם ומחלות לב וכלי דם. זה יכול לשמש גם לאיתור וכימות חומרים מסוכנים אחרים לניטור סביבתי. כאשר מנסים את הפרוטוקול בפעם הראשונה, החוקרים עשויים להתקשות ליצור אגרגטים יציבים של ננו-חלקיקי CB7 וזהב.

מומלץ לערבב את ננו-חלקיקי הזהב בתמיסות CB7 באמצעות סוניקציה מכיוון שטכניקות אחרות עשויות להשפיע על קינטיקה של הצבירה. סרטון המציג שלבים קריטיים של הוספת ערבוב CB7 יכול להגדיל את סיכויי ההצלחה והשחזור עבור חוקרים כאשר הם חדשים במערכת. לסינתזה של זרעי זהב, ממיסים 98.5 מיליגרם של אאוריק ב-10 מיליליטר מים נטולי יונים בבקבוקון זכוכית כדי לקבל תמיסת אוריק כלוריד של 25 מילי-מולרית ו-64.5 מיליגרם של אבקת נתרן ציטראט ב-500 מיקרוליטר מים נטולי יונים בבקבוקון זכוכית.

לאחר מכן, יש לדלל מיליליטר אחד של תמיסת כלוריד אוריק עם 99 מיליליטר מים בבקבוק מכסה כחול של 250 מיליליטר כדי לקבל תמיסת כלוריד אורית של 0.25 מילי-מולרית ולהוסיף 99.5 מיליליטר מתמיסת כלוריד אורית 0.25 מילי-מולרית לבקבוק תחתון עגול בעל שלושה צווארים בנפח 250 מיליליטר המצויד במעבה. לאחר מכן מחממים את התמיסה בחום של 90 מעלות צלזיוס תוך ערבוב נמרץ במשך 15 דקות לפני הזרקת 500 מיקרוליטר מתמיסת הנתרן ציטראט לתוך הבקבוק וממשיכים לערבב עד שהתמיסה הופכת לאדומה. כדי ליזום גידול זרעים של ננו-חלקיקי הזהב, העבירו 25 מיליליטר מתמיסת זרעי הזהב לצינור של 50 מיליליטר וקררו את התמיסה ל-70 מעלות ב-ThermoMixer.

בזמן שהתמיסה מתקררת, מלאו מזרק חד פעמי של שלושה מיליליטר Luer Lock ב-2.5 מיליליטר של תמיסת כלוריד אורית של 25 מילי-מולרית ומלאו עוד מזרק חד פעמי של שלושה מילימטר Luer Lock ב-2.5 מיליליטר של תמיסת נתרן ציטראט של 60 מילי-מולרי. הכנס את המזרקים למשאבות מזרקים והשתמש במתאמי Luer-to-MicroTight כדי לחבר צינורות PEEK בקוטר פנימי של 150 מיקרומולרי למזרקים. הכנס את הצינור לתוך צינור הצנטריפוגה המכיל את תמיסת זרעי הזהב שהתקררה ב-ThermoMixer והגדר את שתי משאבות המזרק להוציא 167.5 מיקרוליטר של תמיסה במשך 20 דקות.

הגדר את מהירות הסיבוב של ThermoMixer ל-600 סיבובים לדקה ולחץ על התחל במשאבת המזרק המכילה את תמיסת כלוריד ההילה של 25 מילי-מולאר. לאחר שתי דקות, לחץ על התחל במשאבת המזרק המכילה את תמיסת הנתרן ציטראט של 60 מילי-מולרי. לאחר 30 דקות, הסר את הכמות של תמיסת ננו-חלקיקי הזהב לניתוח.

להכנת תמיסת CB7 של 0.4 מילי-מולרי, הוסיפו 4.65 מיליגרם CB7 לבקבוקון זכוכית של 15 מיליליטר ו-10 מיליליטר מים לבקבוקון. לאחר מכסה הדוק, סוניקציה של הבקבוקון בטמפרטורת החדר עד להמסה מלאה של מוצק ה-CB7. להכנת תמיסת חומצת שתן של 0.4 מילי-מולאר, הוסיפו 2.69 מיליגרם של חומצת שתן לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר והוסיפו 40 מיליליטר מים לצינור.

לאחר מכסה הדוק, מערבבים את התערובת ב-ThermoMixer המוגדר ל-70 מעלות צלזיוס ו-800 סיבובים לדקה למשך שעתיים. כאשר התמיסה התקררה לטמפרטורת החדר, יש לדלל מיליליטר אחד מתמיסת חומצת השתן של 0.4 מילי-מולרית בתשעה מיליליטר מים בבקבוקון זכוכית של 15 מיליליטר כדי לקבל תמיסת חומצת שתן של 0.04 מילי-מולאר. לאחר מכסה הדוק, יש להגביל את הבקבוקון למשך 30 שניות.

כדי להכין את קומפלקסי חומצת השתן CB7, הוסף 750 מיקרוליטר מתמיסת CB7 0.4 מילי-מולרית ו-750 מיקרוליטר מתמיסת חומצת השתן 0.4 מילי-מולרית לצינור של 1.5 מיליליטר וסוניקציה של התערובת למשך 30 שניות. לאחר מכן החזק את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי להבטיח את היווצרות מתחמי המארח-אורח. לחץ על סמל אשפי יישום הספקטרוסקופיה בתוכנת המערכת Raman ובחר Raman.

התחל רכישה חדשה והגדר את זמן האינטגרציה ל-30 שניות, את הסריקות לממוצע לחמש ואת הקרון לאפס. לאחר מכן אחסן את ספקטרום הרקע והזן את אורך גל הלייזר. ליצירת מצע SERS, הוסף 900 מיקרוליטר של תמיסת ננו-חלקיקי זהב 40 ננומטר ו-100 מיקרוליטר של תמיסה מורכבת של חומצת שתן CB7 מוכנה מראש לצינור של 1.5 מיליליטר וסוניקט עד שהתמיסה משתנה מאדום אודם לסגול.

העבירו את תמיסת הדגימה לקובטה חצי מיקרו והנחו את הקובט לתוך מחזיק הדגימה של ראמאן. סגור את המכסה והתחל במדידה. לאחר מכן הגדר את השמירה האוטומטית כדי להקליט חמישה ספקטרום SERS רצופים.

הספקטרום הנראה האולטרה סגול עבור ננו-חלקיקי הזהב המסונתזים מראה שינוי של שיאי תהודת הפלזמון המקומיים של פני השטח מ-521 ל-529 ננומטר לאחר 10 צעדי גידול, בעוד שנתוני פיזור האור הדינמי מראים התפלגות גודל צרה ככל שגודל הננו-חלקיקים גדל מ-25.9 ל-42.8 ננומטר. הגדלים הממוצעים של G0, G5 ו-G10 הנמדדים מתמונות אלקטרונים שידור הם כ-20, 33 ו-40 ננומטר בהתאמה. בניתוחים מייצגים אלה, קומפלקסים מארחים-אורחים של CB7 וחומצת שתן נוצרו עם CB7 ריק המתווך את היווצרותם של ננו-צמתים פלזמוניים מדויקים בתוך ננו-חלקיקי הזהב CB7 ננו-אגרגטים כפי שנתמכים על ידי אותות חומצת השתן האופייניים בספקטרום SERS.

לעומת זאת, לא ניתן להבחין באותות SERS של חומצת שתן בהיעדר CB7, מה שממחיש את תפקיד המפתח של CB7 בהפעלת צבירת ננו-חלקיקי זהב. הרגישות הגבוהה של תוכנית הזיהוי המוצגת בפרוטוקול זה מודגמת על ידי תצפית על אותות SERS ברורים משיאי חומצת השתן ב-640 ו-1130 סנטימטרים הדדיים עד לגבול הזיהוי של 0.2 מיקרו-מולרי. בנוסף, מתאמים חזקים מאוד בין עוצמת ה-SERS וריכוזי הלוג של חומצת שתן התקבלו על ידי חוק הספק עבור שתי הפסגות עם אזורים ליניאריים שנמצאו בטווח של 0.2 עד 2 מיקרומולר.

לחומצת שתן יש מסיסות נמוכה במים, ולכן יש לוודא שאבקת חומצת השתן רכה לפני השלב הבא. ניתן לבצע ניתוח נתונים מתקדם, המאפשר לכמת סמנים ביולוגיים מרובים הקיימים במטריצה.