בידוד של נוזלים פרוקסימליים כדי לחקור את המיקרו-סביבה של הגידול של אדנוקרצינומה של הלבלב
5 בנובמבר 2020
מיץ לבלב הוא מקור יקר של סמנים ביולוגיים לסרטן הלבלב האנושי. אנו מתארים כאן שיטה להליך איסוף תוך ניתוחי. כדי להתגבר על האתגר של אימוץ הליך זה במודלים של מורין, אנו מציעים דגימה חלופית, נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול, ומתארים כאן שני פרוטוקולים לבידודו.
השיטה המתוארת כאן לבידוד נוזל פרוקסימלי הן בבני אדם והן בעכברים, יכולה להיות מיושמת לחקר המיקרו-סביבה של סרטן הלבלב כדי לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלה. באמצעות פרוטוקול פשוט זה, ניתן לתרגם ממצאים קליניים ממיץ לבלב למודלים עכבריים של PDAC לביצוע מחקרים מכניסטיים. מיץ לבלב הוא נוזל גוף שלא נחקר ברובו והראה הבטחה כמקור לסמנים ביולוגיים יקרי ערך המסייעים באבחון טרום ניתוח ופרופיל מטופלים.
אני אדגים את החלק הראשון של הפרוטוקול, ומריאליסה ברבגאלו, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלנו, תדגים את החלק השני של הפרוטוקול. הערך את מיקום צינור הלבלב באמצעות מדידות שנרכשו במהלך ההדמיה. לאחר מכן משש את המשטח הקדמי של הלבלב כדי לזהות את מיקומו המדויק.
החזיקו את ראש הלבלב בתריסריון מלמטה, והרימו אותו ביד שמאל, וסמנו את מיקום צינור הלבלב בספרה הראשונה. השתמש ביד ימין כדי להכניס מזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בגודל 25 לתוך הלבלב, רק דיסטלי לאגודל שמאל. החליטו על עומק החדירה ומידת הנטייה של המחט על סמך מדידות לפני הניתוח, ועל התפיסה שחדרה לדופן הצינור.
משוך את המיץ עם המזרק. אם לא ניתן להחזיר את המיץ, העבר את המחט בניסיון לקנולציה של צינור הלבלב. לאחר החזרת מיץ הלבלב, העבירו אותו אל מחוץ לשדה הסטרילי, והעבירו אותו למבחנת ואקום של שלושה מיליליטר EDTA.
שמור את הצינור בארבע מעלות צלזיוס עד להעברת הדגימה למעבדה. כדי לעבד את מיץ הלבלב, צנטריפוגה אותו בחום של 400 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר תאים או פסולת. החזר את הסופרנטנט, הוציא אותו ואחסן אותו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוחים נוספים.
כדי לבודד נוזל אינטרסטיציאלי של גידול או TIF, על ידי צנטריפוגה, חותכים את הגידול לשניים, שוטפים את שני החלקים ב-PBS ומכבים אותם בעדינות על נייר פילטר, תוך תנועה מהירה ככל האפשר כדי למנוע אידוי מהגידול. העבר מיד את הגידול למסננת תאי ניילון של 20 מיקרומטר, המוצמדת לצינור חרוטי של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב -400 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שחזר את ה-TIF מתחתית הצינור, ואז הוציא אותו והקפיא אותו מיד על קרח יבש. יש לאחסן בחום של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף. כדי לבודד את ה-TIF באמצעות פליטה, חותכים את הגידול לחתיכות קטנות בעזרת מספריים או אזמל, ושוטפים אותם בזהירות עם PBS קר.
העבירו את חלקי הגידול לתוך צינור של 1.5 מיליליטר, והוסיפו 500 מיקרוליטר PBS עם קוקטייל מעכב פרוטאז כדי למנוע השפלה של אנליטים. דגרו על הרקמה למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר, ובצעו סדרה של צעדי צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים מהדגימה.
שחזור הסופרנטנט לאחר כל צנטריפוגה והעברתו לצינור חדש. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, יש להקציא מיד ולהקפיא את דגימת ה-TIF על קרח יבש. אחסן אותו בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח נוסף.
פרוטוקול זה שימש להשגת מיץ הלבלב מחולים עם PDAC ומחלות לבלב שפירות. לאחר סינון אותות ה-NMR הרחבים של מקרומולקולות, האותות ממטבוליטים קטנים במשקל מולקולרי היו ברורים. ניתוח OPLS-DA מפוקח הראה כי הפרופיל המטבולי במיץ הלבלב הצליח להבחין בין חולי PDAC לחולים שאינם PDAC בדיוק של 82.4%מעניין לציין כי ניתוח מטבולומי שבוצע על דגימות פלזמה מאותם חולים, לא הניב את אותו כוח הבחנה.
כדי להוכיח שתכולת הנוזל הבין-רקמתי של הגידול משקפת באופן אמין שינויים במיקרו-סביבת הגידול, הוזרקו לעכברים שני קווי תאי סרטן לבלב עם שיעורים גליקוליטיים מנוגדים. לאחר כריתת הגידולים כומתו ריכוזי הגלוקוז והלקטט. נוזל אינטרסטיציאלי של גידול מגידולים גליקוליטיים מאוד הכיל פחות גלוקוז ויותר לקטט בהשוואה לגידולים גליקוליטיים נמוכים.
במחקר זה ביצענו ניתוח מטבולומי. עם זאת, נוזלים פרוקסימליים אלה מתאימים ליישומים רבים אחרים במורד הזרם, כגון ספקטרומטריית מסה ופרופיל מיקרו-RNA.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לאיסוף תוך-ניתוחי של מיץ לבלב, המהווה מקור בעל ערך לסממנים ביולוגיים לסרטן הלבלב. בנוסף, הוא מציג דגימה חלופית, נוזל אינטרסטיציאלי של הגידול, יחד עם פרוטוקולים לבידודו במודלים של עכברים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- גילוי סמנים ביולוגיים
רקע
- מיץ הלבלב אינו נחקר מספיק כמקור לסמנים ביולוגיים.
- יש לו פוטנציאל לסייע באבחנה טרום-ניתוחית.
- הבנת המיקרו-סביבה של סרטן הלבלב היא קריטית.
- תרגום ממצאים ממחקרי בני אדם למודלים עכבריים יכול לשפר את המחקר.
מטרת המחקר
- לבידוד מיץ לבלב ונוזל בין-רקמי של גידול לצורך זיהוי סמנים ביולוגיים.
- לספק פרוטוקולים ישימים הן במודלים אנושיים והן במודלים של עכברים.
- להקל על מחקרים מכניסטיים של סרטן הלבלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף מיץ לבלב תוך-ניתוחי.
- בידוד נוזל בין-תאי גידולי.
- טכניקות דימות לאיתור תעלת הלבלב.
- מישוש של הלבלב לצורך זיהוי מדויק.
תוצאות עיקריות
- פרוטוקולים מודגמים לבידוד נוזלים.
- הדגשה של הפוטנציאל של מיץ הלבלב כמקור לסמנים ביולוגיים.
- הצגת הישימות של תרגום ממצאים קליניים למודלים של עכברים.
- מתן תשתית למחקרי מנגנונים עתידיים.
מסקנות
- מיץ לבלב ונוזל בינתיים של גידול הם מבטיחים למחקר של סמנים ביולוגיים.
- הפרוטוקולים יכולים להעמיק את ההבנה של סרטן הלבלב.
- דרושים מחקרים נוספים כדי לבחון את מלוא הפוטנציאל של נוזלים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד נוזלים פרוקסימליים מאפשר בחינה ישירה של הסביבה המיקרוסופית של אדנוקרצינומה הלבלב, ומספק נתיב לגילוי סמנים ביולוגיים המגשר בין תצפיות קליניות לבין מחקרים מכניסטיים פרה-קליניים. על ידי אספקת שיטות נגישות טכנית לאיסוף מיץ לבלב ונוזל intersticial של הגידול, הן במערכות אנושיות והן במערכות עכברים, הפרוטוקול תומך במאמצי תיקוף מטרות ובפיתוח בדיקות המתמקדות בשינויים בסביבה המיקרוסופית. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הפקת נוזלים רלוונטיים למחלה המשקפים אינטראקציות בין תאי הסביבה (stroma) לתאי הגידול, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) בתוכניות לגילוי תרופות לסרטן הלבלב.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינת השערות טיפוליות על ידי בידוד נוזלים המרכזים סממנים ביולוגיים של הסביבה המיקרוסקופית של הגידול.
- ערך תפעולי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות סממנים ביולוגיים בנוזל פרוקסימלי.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות ניתוח השוואתי של פנוטיפים גליקוליטיים של גידולים, באמצעות כימות של גלוקוז ולאקטט ב-TIF.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת נוזלים ביולוגיים שעברו תיקוף ליישומים המשכיים כגון ספקטרומטריית מסה ואפיון microRNA.
- ערך תפעולי: אספקת פרוטוקולי בידוד סטנדרטיים וניתנים לשחזור (צנטריפוגציה ואלוציה) המתאימים להרחבת קנה המידה של הבדיקה.
- ערך מדעי: השגת תוצאות כמותיות של מטבוליטים המאפשרות זיהוי ביומרקרים המוכנים לסריקה עם כושר הבחנה (דיוק של 82.4% ב-OPLS-DA).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מבסס רציפות של מערכת רלוונטית למחלה על ידי תרגום ממצאים של מיץ לבלב אנושי למודלים של TIF בעכברים.
- ערך תפעולי: מסייע בתיקוף פרה-קליני באמצעות בידוד של TIF ממודלים של גידולים תת-עוריים המשקפים שינויים במיקרו-סביבה.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי קישור פרופילי סממנים ביולוגיים בנוזלים לפנוטיפ הגידול.
שילוב זרימה ותהליכי עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת אפיון של הסביבה המיקרובית המנחה מחקרים מכניסטיים ומסעי סריקה מונחי-סממנים ביולוגיים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים על ידי בידוד נוזלים המשקפים אינטראקציות בין הסטרומה לגידול ב-PDAC.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקות באמצעות בידוד סטנדרטי של TIF ומיץ לבלב, המניבים פלטים כמותיים של מטאבוליטים וחומצות גרעיניות.
- אנליטיקה: מספקת ביומרקרים מדידים (גלוקוז, לקטט, מטאבוליטים) לצורך ניתוח השוואתי של מצבים וסריקה פנוטיפית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שלב הגילוי לרצף פרה-קליני על ידי הדגמה של TIF המשקף את המצב הגליקוליטי של הגידול במודלים של עכברים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת הניתנת לשימוש חוזר לבידוד נוזלים פרוקסימליים במערכות אנושיות ובמערכות של עכברים, ובכך מפחית מחסומים בתרגום מודלים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי באמצעות זיהוי סמנים ביולוגיים של המיקרו-סביבה ותיקוף מטרות ב-PDAC.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות טכניקות פשוטות של סנטריפוגציה ואלוציה לבידוד TIF.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go על ידי קישור סמנים ביולוגיים בנוזלים לפנוטיפ של הגידול, ובכך הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המבוסס על פרופילי נוזלים המבחינים בין סמנים ביולוגיים (דיוק של 82.4% ב-PDAC לעומת non-PDAC).
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בנוזלים כירורגיים ובדיסקציה של גידולים לצורך בידוד נוזלים פרוקסימליים.
- נדרש ציוד לצנטריפוגה (400 G, 4°C) וטיפול סטרילי בנוזלים לצורך עיבוד מיץ לבלב ו-TIF.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית בין הצוותים הכירורגיים, הפתולוגיים והאנליטיים כדי לשמור על שלמות הדגימה.
- כולל שיקולי התאמה עבור בידוד TIF מעכברי באמצעות צנטריפוגה או אלucian, בהתאם לגודל הרקמה וליישום הבא בתהליך.
- כולל מגבלות מעשיות, כגון אתגר טכני באיסוף מיץ לבלב מעכברים, מה שמחייב שימוש ב-TIF כחומר חלופי.
