שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

ברוכים הבאים למכון לביולוגיה ופתולוגיה תאית, ניקולאי סימיונסקו מבוקרשט, רומניה. כאן במעבדת התמרה הנגיפית, אנו מראים חלק מייצור החלקיקים האדנו-ויראליים באמצעות מתודולוגיה ממוטבת המבוססת על מערכת AdEasy שפותחה על ידי פרופסור פוגלשטיין. השלבים העיקריים של הטכנולוגיה לייצור אדנווירוסים זה הם, אחד, שילוב מחדש של pAdTrack המכיל GFP עם pAdEasy-1 פלסמיד בחיידקים BJ5183.

שתיים, לארוז את החלקיקים האדנו-ויראליים. שלוש, הגברה של אדנווירוס בתאי AD293. ארבעה, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מתא ליזלת ותרבות בינונית.

חמש, טיטרציה ויראלית ובדיקות תפקודיות של אדנווירוס. כאן, נציג צעד חשוב של המתודולוגיה. טיהור החלקיקים האדנו-ויראליים מהליזאט של התא וממדיום התרבות.

הטיהור של אדנווירוס מתחיל עם קצירת התאים המייצרים וירוסים ואת המדיום. תאי AD293 הודבקו עם פלסמיד רקומביננטי וכפי אדנווירוס נארז. ואז אדנווירוס הוגבר על ידי תרבויות גדולות יותר רצופות.

כאן, השגנו 25 צלחות T175, והתחלנו את הטיהור של אדנווירוס מן lysate התא ואת המדיום התרבותי. ראשית, בדקנו את הפלואורסצנטיות הירוקה של GFP לידי ביטוי על ידי התאים transduced. אם התאים עדיין מחוברים, אנו ננתק אותם על ידי הקשה על צלחת התרבות או באמצעות מגרד ארוך.

התאים והמדיום נאספים. הבקבוקים נשטפים עם PBS, שנאסף גם בצינורות פלקון. התאים הם גלולות על ידי צנטריפוגה.

שמור את גלולת התא, כמו גם את המדיום לטיהור נוסף של אדנווירוס. בשלב זה, העזרה של עמית מוערך היטב כדי להאיץ את תהליך הקציר. גלולת התא ירוקה עקב ביטוי GFP.

גלולה הוא resuspended במאגר Tris היפרטוני, אשר יקל על ההפרעה של התאים. עבור תמוגה של תאים, אנו משתמשים בחנקן נוזלי והגז היבש התחמם עד 37 מעלות. אין לבצע יותר משלושה מחזורים מאז הנגיף ייפגע.

כדי להגביר את היעילות של הפרעה לתאים בזהירות לעבור את התא הומוגניזציה דרך מחט מזרק 23 מד. צנטריפוגה התא lysate ב 9, 600 x g במשך 12 דקות. להעביר את supernatant בצינורות חדשים להשליך את כדורי.

שמור את supernatant על הקרח לעיבוד נוסף על ידי ultracentrifuge. עכשיו, אנחנו מעבדים את מדיום התרבות כדי לבודד את אדנווירוס ששוחרר מהתאים. לכך, ראשית, אנו שוקלים את הכמות הדרושה של אמוניום גופרתי ומוסיפים אותו לבקבוק שבו נאסף מדיום התרבות.

הבקבוק רועד במרץ עד שהקריסטלים מומסים לחלוטין. התערובת דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים וחצי. ואז ההשעיה של המשקעים מחולקת לצינורות פלקון.

צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1, 600 x g. לאחר הצנטריפוגה, supernatant מושלך ואת גלולה הוא respended ב 10 חיץ Tris מילימולאר. אם אחד לא יכול להמשיך את הטיהור של אדנווירוס עם צעד ultracentrifugation, משקעים ניתן לשמור במשך כמה ימים בארבע מעלות, אבל רק לאחר דיאליזה כדי להסיר את אמוניום גופרתי.

כאן, הצגנו את שלב הדיאליזה. אנו משתמשים במזרק כדי להכניס את ההשעיה לקלטת רטובה בעבר. הדגימות מחויגות כנגד חיץ Tris 10 מילימולאר לילה בארבע מעלות.

השלב האחרון של הטיהור מיוצג על ידי צעד ultracentrifugation על שיפוע צסיום כלוריד רציפה. כדי ליצור את השיפוע, ראשית, אנחנו פיפט שלושה מיליליטר של פתרון צפיפות גבוהה של צסיום כלוריד. על גבי שכבה זו, בעדינות לשפוך שלושה מיליליטר של צסיום כלוריד בצפיפות נמוכה.

השעיית החלקיקים אדנו-ויראלי מן lysate התא או מדיום התרבות הוא מכוסה לאחר מכן על גבי השיפוע. הצינורות מלאים בשמן מינרלי ומוצגים בדליי SW41. לאחר שיווי המשקל, הצינורות נטענים באופן סימטרי לתוך הרוטור, אשר מוצג ultracentrifuge.

הצנטריפוגה פועלת 35, 000 סל"ד וארבע מעלות במשך 18 שעות ללא הפסקה. לאחר ultracentrifugation, הצינורות ממוקמים על דוכן עם נייר שחור מאחור על מנת לקצור את הרצועות. השלב העליון הברור ופסולת התא מושלכים במיכל פסולת עם פתרון הלבנה.

הרצועה הנמוכה ביותר המכילה את אדנווירוס השלם נקצרת עם קצה פיפטה ונאספת בצינור אפנדורף סטרילי. לאחר הדיאליזה, סוכרוז מתווסף להשעיה הנגיפית לריכוז סופי של 4%, ו aliquot ויראלי נשמרים קפואים במינוס 80 מעלות. בסעיף התוצאות, הראינו את הביטוי GFP בתאים transduced עם להשיג אדנווירוס.

48 שעות לאחר התמרה, GFP מתבטא על ידי התאים transduced כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. אחוז התאים המבטאים GFP נקבע על-ידי ציטומטריית זרימה. כ-50% מתאי האנדותל האנושיים והשיחים שעברו חילוף עם 25 יחידות התמרה לכל תא הם חיוביים של GFP.

אותה תשואת התמרה הושגה עבור hepatocytes מורין כאשר רק חמש יחידות התמרה לכל תא שימשו, אבל זה קשור לתמותה גבוהה יותר בשל רגישות התא. מופחת לביטוי GFP הושג על ידי התמרים של תאים סטרומה mesenchymal בשל הביטוי הנמוך של הקולטנים הספציפיים. סיכום הערות.

אנו מייעלים את הטכנולוגיה המפרכה כדי להפחית את הזמן, העלויות והמאמץ הדרוש להשגת החלקיקים האדנו-ויראליים. אדנווירוס מוכן הוא מסוגל להדביק סוגי תאים שונים כדי לגרום לביטוי של הגן של עניין.