ב Vivo CRISPR / Cas9 הקרנה בו זמנית להעריך תפקוד גנים בעור העכבר וחלל הפה
2 בנובמבר 2020
כאן אנו מתארים מתודולוגיית הקרנה מהירה וישירה vivo CRISPR /Cas9 באמצעות אולטרסאונד מונחה זריקות lentiviral עוברי הרחם כדי להעריך בו זמנית פונקציות של מספר גנים בעור וחלל הפה של עכברים immunocompetent.
פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחוקרים לחקור בו זמנית את הפונקציות המדכאות את הגידול של מאות גנים בסרטן הראש והצוואר בשבריר מהעלות של מודל עכבר נוקאאוט קונבנציונלי. טכניקה זו גמישה וניתן להתאים אותה לכיסוי ביטוי גנים כדי לחקור את תפקודם בעור. ניתן ליישם את פרוטוקול ספריית הקריספר הממוקד גם עבור סוגי סרטן אחרים.
הנח את הצד הגחוני של בעל החיים המורדם כלפי מעלה על שלב הניתוח המחומם והשתמש בסרט כירורגי כדי להחזיק את הכפות במקומן. יש למרוח את צינור ההרדמה של האף לאספקה קבועה של איזופלורן וחמצן עד לסיום הניתוח. כדי לאשר הריון E9.5, מרחי כמות קטנה של קרם להסרת שיער על הבטן ומרחי אותו על שטח של שלושה על שלושה סנטימטרים רבועים באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה.
לאחר שתיים-שלוש דקות, הסר בעדינות את הקרם עם גזה או טישו ונגב את האזור באמצעות PBS ואתנול 70%. בעזרת בדיקת האולטרסאונד והג'ל, בדוק את העכבר ההרה ליום E9.5 העוברי. ניתן לעשות זאת גם יום קודם ב-E8.5 כדי לחסוך זמן ביום הניתוח.
הסר את ג'ל האולטרסאונד ונגב את האזור באמצעות BPS ולאחר מכן 70% אתנול. להזריק הכי הרבה עם משכך כאבים תת עורי. לאחר מכן אתה מלקחיים ומספריים סטריליים כדי לבצע חתך אנכי בעור.
השתמש במלקחיים קהים כדי להפריד את העור סביב החתך מהצפק. לאחר מכן אתה מלקחיים ומספריים סטריליים כדי לחתוך את הצפק. בעזרת מלקחיים קהים, משוך בעדינות את קרן הרחם השמאלית והימנית וספור את העוברים.
הכנס מחדש את רוב קרני הרחם, אך השאר את הקצה הדיסטלי של קרן רחם אחת המכילה שלושה עוברים חשופים. בעזרת מלקחיים קהים, דחפו ומשכו בעדינות את הרחם עם שלושת העוברים, דרך הפתח בקרום הסיליקון של צלחת הפטרי ששונה. מייצבים את צלחת הפטרי באמצעות קוביות חימר דוגמנות.
ייצב את הרחם עם שלושת העוברים בתוך צלחת הפטרי, באמצעות תבנית סיליקון. לאחר מכן משטחים את פקק הסיליקון בצד העוברים בעזרת כלי קהה. מלאו את צלחת הפטרי ב-PBS סטרילי ושטפו את קרום הסיליקון בתחתית צלחת הפטרי, עם בטן הסכר ההרה, ובכך מונעים כל דליפה.
העבירו את ראש האולטרסאונד לצלחת הפטרי, כ-0.5 סנטימטרים מעל העובר העליון והתאימו את השלב כך שחלל מי השפיר ייראה בבירור בתצוגת האולטרסאונד. יישר את מחט המזרק, בזהירות לתוך צלחת הפטרי ששונה. בעזרת המיקרומניפולטור, הנח את קצה המחט בטווח של חמישה מילימטרים מהעובר העליון, ולאחר מכן סובב את המחט קדימה ואחורה כדי לנוע למישור שבו קצהו נראה הבהיר ביותר בתמונת האולטרסאונד.
בעזרת המיקרומניפולטור, דחף את המחט דרך דופן הרחם לתוך חלל מי השפיר. הזרקו 62 ננוליטר של ה-lentivirus עם ספריית sgRNA במהירות הזרקה איטית. לחץ על כפתור ההזרקה שמונה פעמים ובסך הכל 496 ננוליטר לעובר.
חזור על אותו הליך עבור שני העוברים האחרים. לאחר מכן הרם את ראש האולטרסאונד והסר את פקק הסיליקון. דחף בעדינות את שני העוברים הראשונים מתוך שלושת העוברים לתוך בטן העכבר באמצעות צמר גפן סטרילי.
משוך את שלושת העוברים הבאים ודחף פנימה את העובר השלישי שהוזרק קודם לכן. חזור על הליך ההזרקה עד להזרקת מספר העוברים הרצוי, והקפד לא לחרוג מ-30 דקות הרדמה. בסיום, הרם את ראש האולטרסאונד, הסר את המיקרומניפולטור בעזרת המחט, שאב את ה-PBS והסר את צלחת הפטרי.
בעזרת מגבונים סטריליים, ספגו את כל PBS שאולי הצטבר בחלל הבטן. סגור את חתך הצפק באמצעות תפרים נספגים. לאחר מכן השתמש בשני סיכות כדי לסגור את החתך בעור הבטן.
לאחר מכן, קריאות ריצוף דור של DNA מוגבר PCR מתאים מותמרים ספריית פלסמיד ולנטי-ויראלי אמורות להראות מתאם גבוה. אם קריאות ה-sgRNA מ-DNA פלסמיד אינן מציגות ייצוג שווה של sgRNAs, יש לחזור על הליך ההכנה והריכוז הנגיפי בזהירות. התוצאות של הזרקה מונחית אולטרסאונד של לנטי-וירוס הנושא Cre recombinase בגורי עכברי קונפטי E9.5 Lox-STOP-Lox ביום שלאחר הלידה P0, מוצגות כאן.
בעוד שטיטר גבוה של הנגיף יביא לכיסוי גדול יותר של עור העכבר, זה גם יביא להתמרה של מספר sgRNAs לאותו תא. תרשים זה מציג קריאות ריצוף מהדור הבא של DNA מוגבר PCR, מתאים מותמרים בספריית פלסמיד ולנטי-ויראלי, כמו גם קריאות מארבעה גידולים מייצגים. מדריכי sgRNA המכוונים למדכאי גידול ADAM10 ו-RIPK4 מועשרים בדגימות הגידול בהשוואה למאגר הפלסמיד או לתאים נגועים.
ביצוע הניתוח ב-E9.5 הוא קריטי. זכור לבדוק הריון באמצעות אולטרסאונד, תשעה ימים לאחר התקנת הצלב ולזהות את נקודת הזמן העוברית בכל נקבת עכבר. לאחר לידת הגורים, ניתן לבודד את התאים המומרים וליצור פרופיל נרחב באמצעות טכניקות פרופיל הגנים העדכניות ביותר כגון ריצוף RNA של תא בודד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיית סינון CRISPR/Cas9 מהירה וישירה in vivo באמצעות זריקות לנטיביות עוברייות מונחות אולטרסאונד. הוא מאפשר לחוקרים להעריך את הפונקציות של מספר גנים בעור ובחלל הפה של עכברים בעלי חסינות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- מחקר סרטן
רקע
- הטכניקה מאפשרת בדיקה של פונקציות מדכאות גידול של מאות גנים.
- היא חסכונית בהשוואה למודלי עכברים עם נוקאאוט קונבנציונליים.
- השיטה מתאימה לחקר ביטוי גנים בעור.
- ניתן ליישם אותה על סוגים שונים של סרטן.
מטרת המחקר
- לפתח מתודולוגיה להערכת פונקציות גנים בו-זמנית.
- לשפר את ההבנה של תפקידי הגנים בסרטן ראש וצוואר.
- לספק כלי גמיש למחקר סרטן.
שיטות ששימשו
- זריקות לנטיביות עוברייות מונחות אולטרסאונד.
- יישום של איזופלורן וחמצן להרדמה.
- אימות הריון באמצעות מריחת קרם להסרת שיער.
- שימוש בפרוטוקול ספריית CRISPR ממוקדת.
תוצאות עיקריות
- הערכה מוצלחת של פונקציות גנים in vivo.
- הוכחת חסכוניות השיטה.
- אימות התאמה לסוגי סרטן שונים.
- פוטנציאל ליישומים רחבים יותר בחקר פונקציות גנים.
מסקנות
- הפרוטוקול מציע גישה מהירה ויעילה לניתוח פונקציות גנים.
- הוא פותח דרכים חדשות למחקר סרטן וחקר גנים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב מעבר לסרטן ראש וצוואר.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
In vivo CRISPR/Cas9 screening enables rapid, multiplexed functional interrogation of gene roles in disease-relevant mouse tissues, accelerating target validation and mechanistic de-risking in oncology discovery. This approach reduces the time and cost barriers of traditional GEMMs, supporting earlier, data-driven portfolio triage and prioritization. Its adaptability across tissues and gene perturbation types positions it as a scalable platform for preclinical model innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables simultaneous functional assessment of hundreds of candidate tumor suppressor genes in vivo.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene roles in tissue-specific oncogenesis.
- Facilitates rapid hypothesis testing and target prioritization for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Generates validated, multiplexed knockout models for robust screening of gene function.
- Provides quantitative readouts via next-generation sequencing of sgRNA representation.
- Improves reproducibility and scalability compared to single-gene knockout workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease biology by enabling tissue- and context-specific gene perturbation.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling single-cell profiling of transduced cells.
- Reduces late-stage attrition risk by providing early, in vivo functional evidence for candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This in vivo CRISPR screening method bridges early discovery and preclinical model development, enabling direct functional genomics in relevant tissues before lead identification.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene function testing and pathway mapping in disease-relevant systems.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs for robust comparison of gene perturbations.
- Analytics: Leverages next-generation sequencing for precise measurement of sgRNA enrichment and depletion.
- Translational Research: Supports biomarker discovery and mechanistic alignment with clinical phenotypes.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol for diverse tissues, gene sets, and disease models across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines model generation, enhances reproducibility, and enables high-throughput functional genomics.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing early, multiplexed in vivo data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in utero surgery, CRISPR library design, and next-generation sequencing analytics.
- Demands access to ultrasound-guided injection systems and high-titer lentiviral production capabilities.
- Standardization of sgRNA library representation and viral delivery is critical for reproducibility.
- Protocol can be adapted to other organs or CRISPR modalities with appropriate optimization.
- Careful control of viral titer and injection parameters is necessary to avoid confounding effects from multiple sgRNA integration.
