Name: חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: חקור מנגנוני תנודות רשת היפוקמפוס בחתיכות מוח עכבר חריפות. הפרוטוקול כולל הכנת חתיכות אופקיות מהיפוקמפוס-קורטקס אנתורינלי, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ותנאי חמצון מבוקרים לשמירת פעילות ספונטנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר רוצה להודות לסטיב סיגלבאום על התמיכה. המימון ניתן על ידי 5R01NS106983-02, כמו גם 1 F31 NS13466-01.

למחבר אין מה לחשוף.

ישנם מספר צעדים בפרוטוקול חיתוך זה שנועד לקדם את בריאות הרקמות ולהעדיף את הופעתה של פעילות רשת נטורליסטית ספונטנית: העכבר חדור באופן טרנסקרדיאלי עם פתרון חיתוך סוכרוז מצונן; פרוסות קליפת המוח האופקית-סנטוריניאלית (HEC) נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני; פרוסות להתאושש בממשק של ACSF מחומם ואוויר לח, פחמימן עשיר; במהלך הקלטות פרוסות הם superfused עם ACSF מחומם ל 32 °C (60 °F) ונמסר בקצב זרימה מהיר עם superfusion משטח כפול בתא הקלטה שקוע.
בריאות פרוסה היא בעלת חשיבות עליו...

מדידה אלקטרופיזיולוגית מפרוסות היפוקמפוס חיות במבחנה היא גישה ניסיונית רבת עוצמה עם יתרונות רבים. הנסיין יכול להשתמש במיקרוסקופ, מיקרומניפולטורים ומערכת הקלטה כדי לדמיין ולאסוף מדידות ישירות מתאי עצב בודדים ברקמה. פרוסות רקמות נגישות מאוד גם לצילום או משלוח תרופות לניסויים אופטוגנטיים, כימוגנטיים או תרופתיים.
רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין סינכרונית מאוד ב vivo, גלוי כמו תנודות בפוטנציאל השדה המקומי חוץ תאי1,2,3,4,5. שיטות פרוסת המוח כבר ממונפות כדי לקבל תובנה לתוך מנגנוני הסלולר והמעגלים שבבסיס תנודות רשת עצביות אלה. עבודת יסוד של מאייר ואח 'הוכיחה כי מתחמי גלים חדים (SWRs) יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני6,7. מחקרים מאוחרים יותר של חוקרים מרובים הבהירו בהדרגה היבטים רבים של SWRs, כולל תפקידם של נוירומודולטורים בוויסות מצב הרשת של ההיפוקמפוס8,9,10 והמנגנונים הסינפטיים המניעים את ההפעלה מחדש במבחנה של הרכבים עצביים שהיו פעילים בעבר במהלך התנהגות ב vivo11. ניסויים בפרוסות מוח סיפקו גם תובנה על תנודות טווח הגמא (30-100 הרץ), מצב רשת היפוקמפוס מובהק האמין לתמוך קידוד זיכרון להיזכר12,13. לבסוף, הכרה בתפקיד המרכזי של ההיפוקמפוס ומבנים הקשורים בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה של האונה הרקתית14,15, חוקרים השתמשו בהכנות פרוסת היפוקמפוס כדי לחקור את הדור ואת התפשטות פעילות אפילפטיפורם. Carter et al. הוכיחו כי פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-entorhinal בשילוב שהוכנו מבעלי חיים אפילפטיים כרוניים יכול ליצור באופן ספונטני הפרשות אפילפטיפורם במבחנה16. לאחר מכן, Karlócai et al. חקר את המנגנונים שבבסיס הפרשות אפילפטיפורם בפרוסות היפוקמפוס באמצעות נוזל שדרתי מלאכותי שונה (ACSF) עם ריכוזי יון שונה (מופחת Mg2+ או גבוה K+) או תרופות נוספות (4AP או gabazine)17.
חוקרים פיתחו גישות רבות של פרוסות היפוקמפוס השונות בדרכים מרכזיות: (1) אזור ההיפוקמפוס הכלול בפרוסה (גב, ביניים או גחון); (2) נוכחות או היעדר רקמות חוץ-פימפו-קמפליות כגון קליפת המוח האנטורינלית; (3) הכיוון המשמש לחיתוך פרוסות (קורנל, קשת, אופקי או אלכסוני); ו-(4) התנאים שבהם נשמרת הרקמה לאחר ההחתמה (שקועה במלואה ב- ACSF או מוחזקת בממשק של ACSF ואוויר לח ועשיר קרבוגן).
הבחירה באיזו גישה חותכת להשתמש צריכה להיקבע על ידי המטרה הניסיונית. לדוגמה, פרוסות רוחביות או קורנליות של ההיפוקמפוס הגבי המתוחזק בתנאים שקועים שימשו ביעילות רבה לחקירת מעגלים תוך-פיוקמפוסים ופלסטיות סינפטית18,19,20. עם זאת, הכנות כאלה אינן יוצרות באופן ספונטני תנודות ברשת בקלות כמו פרוסות מההיפוקמפוס הגחוני21,22,23. למרות מצב של פעילות SWR מתמשכת ניתן לגרום על ידי גירוי tetanic בפרוסות רוחביות מן ההיפוקמפוס הגבי הגחוני24, SWRs ספונטניים נצפו בקלות רבה יותר פרוסות הגחון7,25.
הבחנה פיזיולוגית ואנטומית אינהרנטית בין ההיפוקמפוס הגבי לבין ההיפוקמפוס הגחוני נתמכת על ידי מחקרים המבוצעים הן ב- vivo והן במבחנה26. הקלטות בחולדות חשפו מקצבי תטא עקביים מאוד לאורך ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, אך קוהרנטיות לקויה בין אזור הגחון לשאר ההיפוקמפוס27. SWRs ב vivo מפיצים בקלות בין ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, ואילו SWRs שמקורם בהיפוקמפוס הגחוני נשארים לעתיםקרובות מקומיים 28. התחזיות האסוציאטיביות שמקורן בנוירונים פירמידליים CA3 המתגוררים בפרויקט ההיפוקמפוס הגבי והבינוני למרחקים ארוכים לאורך הציר האורך של ההיפוקמפוס. תחזיות CA3 שמקורן באזורים גחוני להישאר מקומיים יחסית, ולכן נוטים פחות להיות מנותק במהלך תהליך ההחתכה29,30. לפיכך, פרוסות גחון עשויות לשמר טוב יותר את הרשת החוזרת הנחוצה ליצירת סנכרון אוכלוסין. הנטייה של פרוסות גחון כדי ליצור פעילויות רשת ספונטניות במבחנה עשויה גם לשקף רגישות פנימית גבוהה יותר של נוירונים פירמידליים או עיכוב GABAergic חלש יותר בהיפוקמפוס הגחוני בהשוואה לאזורים הגביים יותר31. ואכן, פרוסות היפוקמפוס הגחוני רגישים יותר לפעילות אפילפטיפורם32,33. לפיכך, מחקרים רבים של תנודות רשת ספונטניות8,9,11,24 או פתולוגי16,34,35,36 תנודות רשת השתמשו באופן מסורתי בגישה חתוכה אופקית, לפעמים עם זווית קלה בכיוון הקדמי-עורפי, אשר מניב פרוסות רקמה במקביל למישור הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני.
קישוריות הרשת מושפעת באופן בלתי נמנע מהליך ההחתכה, שכן תאים רבים בפרוסה ינותק. הזווית ועובי הפרוסה והרקמה שנשמרו בהכנה יש לשקול לייעל את הקישוריות במעגלי העניין. מחקרים רבים השתמשו בפרוסות קליפת המוח האופקית המשולבת של ההיפוקמפוס -entorhinal (HEC) כדי לחקור אינטראקציות בין שני המבנים בהקשר של תנודות רשת פיזיולוגיות או פתולוגיות. Roth et al. ביצע הקלטות כפולות משדה המשנה CA1 של ההיפוקמפוס ושכבה V של קליפת המוח האנטורינאלית המדיאלית כדי להדגים התפשטות של פעילות SWR באמצעות פרוסת HEC37. מחקרים רבים על פעילות אפילפטיפורם השתמשו בהכנת פרוסת HEC כדי לחקור כיצד הפרשות אפילפטיפורם מתפשטות דרך רשת קורטיקוהיפוקאמפל16,35,36,38. חשוב לציין כי שימור הלולאה קורטיקוהיפוקאמפל שלם אינו תנאי מוקדם עבור SWRs ספונטניים, הפרשות אפילפטיפורם, או תנודות גמא; תנודות רשת יכולות להיווצר בפרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי או הגחוני ללא רקמות פרהיפוקמפוס מחוברות21,22,23, 25,39,40,41. גורם חשוב יותר עבור הדור הספונטני של תנודות רשת בפרוסות היפוקמפוס עשוי להיות עובי של כל פרוסה, כמו פרוסה עבה יותר (400-550 מיקרומטר) ישמור קישוריות יותר ברשת CA2/CA3 חוזרת21,22,25.
למרות פרוסות HEC אופקי זוויתי (לחתוך עם זווית של כ 12 ° בכיוון הקדמי-עורפי) שימשו כדי ללמוד את הקישוריות הפונקציונלית של לולאת corticohippocampal11,16,34,35,42, הכנות זוויתיות כאלה אינם נדרשים לפעילות רשת ספונטנית43,44,45. עם זאת, השימוש במישור חתך זוויתי מאפשר לחוקר להכין באופן סלקטיבי פרוסות המשמרות בצורה הטובה ביותר את הלאמלה בעלת הכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני או הבינוני, תלוי אם מוחלת זווית כלפי מטה או כלפי מעלה (איור 1). גישה זו דומה מבחינה מושגית לזו המשמשת את Papatheodoropoulos et al., 2002, אשר ניתח כל היפוקמפוס חינם ולאחר מכן השתמש במסוק רקמות כדי ליצור פרוסות רוחביות לאורך כל ציר הגב הגחוני21. לאור ההבחנה התפקודית הנ"ל בין ההיפוקמפוס הגחוני והידוכי הגבי, החוקרים צריכים לשקול את המקור האנטומי של פרוסות בעת תכנון ניסויים או פרשנות תוצאות. שימוש ברמפת אגר במהלך הליך ההחתכה הוא דרך פשוטה לייצר פרוסות מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני.
פרוסות היפוקמפוס יכולות להישמר בתא שקוע (עם הרקמה שקועה לחלוטין ב- ACSF), או בתא בסגנון ממשק (למשל, אוסלו או תא האס, עם פרוסות מכוסות רק על ידי סרט דק של מדיה זורמת). תחזוקת ממשק משפר חמצון של הרקמה, אשר מקדם הישרדות עצבית ומאפשר רמות גבוהות מתמשכת של פעילות interneuronal. באופן מסורתי, תנאי הקלטה שקועים משתמשים בקצב זרימה ACSF איטי יותר שאינו מספק חמצון רקמות נאות לביטוי יציב של תנודות ברמת הרשת. בפרוסות היפוקמפוס שקועות תנודות גמא הנגרמות על ידי קרבאכול נצפו רק באופן ארעי46,47, בעוד שהם יכולים להישמר ביציבות בתאי הקלטה ממשק10,48,49. ככזה, מחקרים רבים של פעילות ספונטנית מורכבת במבחנה הסתמכו על חדרי הקלטה ממשק לחקור מתחמי גל חדאדווה 6,7,8,9,10,25,37, תנודות גמא10,13, ופעילות אפילפטיפורם16,38,45,47.
בתא הקלטה בסגנון שקוע, ניתן להשתמש במטרה של מיקרוסקופ טבילה כדי לדמיין תאים בודדים ולמקד באופן סלקטיבי תאים בעלי מראה בריא להקלטות. ההכנה שקועה גם מאפשר שליטה עדינה על milieu הסלולר, כמו טבילה מקלה על פיזור מהיר של תרופות או תרכובות אחרות לרקמה. לפיכך, מתודולוגיה שונה שבה תנודות רשת יציבות נשמרות בתנאים שקועים מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה. גישה זו באה לידי ביטוי על ידי העבודה של Hájos et al., שבו פרוסות ההיפוקמפוס להתאושש בתא החזקה בסגנון ממשק פשוט במשך כמה שעות לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע שונה עם קצב זרימה גבוה של ACSF (~ 6 mL / min) כדי לשפר את אספקת החמצן לרקמה12,48,49. בתנאים אלה, ניתן לשמור על רמות גבוהות של פעילות interneuron ותנודת רשת ספונטנית יציבה בתא הקלטה שקוע. גישה זו שונה מאפשרת לחוקרים לבצע הקלטות תיקון תא שלם מונחה חזותית ולאפיין את תרומתם של סוגי תאים שזוהו מורפולוגית לתנודות גמא הנגרמות על ידי carbachol12. SWRs יכול להתרחש גם באופן ספונטני פרוסות היפוקמפוס שקוע עם קצב זרימה מהיר של ACSF11,48,49. מאייר ואח ' הדגימו כי פרוסות היפוקמפוס שהתאוששו בתא ממשק לפני המעבר לתא הקלטה שקוע הציגו באופן אמין SWRs ספונטניים, ואילו פרוסות שהתאוששו שקועות בכומתה לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע הראו תגובות שדה קטנות יותר, רמות נמוכות יותר של זרמים סינפטיים ספונטניים, ורק לעתים רחוקות מאוד הציגו SWRsספונטניים 43. Schlingloff et al. השתמשו במתודולוגיה משופרת זו כדי להדגים את תפקידם של תאי סל מבטאים parvalbumin בדור של SWRs ספונטני44.
הפרוטוקול הבא מציג שיטת חתך שבאמצעותה ניתן לשחזר נוירונים פעילים באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס אופקיות בתנאי ממשק ולאחר מכן להישמר בתא הקלטה שקוע המתאים למניפולציות תרופתיות או אופטוגנטיות והקלטות מונחות ויזואלית.

<table><tbody><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>Lulzbot</td><td>LulzBot TAZ 6</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק דגירה של פרוסות מוח חריפות</td><td>NIH חילופי הדפסת תלת מימד NIH</td><td>3DPX-001623</td><td>עוצב על ידי ChiaMing Lee, זמין בכתובת</td></tr><tr><td>https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 Adenosine 5&prime;-triphosphate מלח מגנזיום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9187-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Ag-Cl כדורי קרקע</td><td>Warner</td><td>64-1309, (E205)</td><td></td></tr><tr><td>אגר</td><td>בקטון, דיקינסון</td><td>214530-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>אלפא אסאר</td><td>36237</td><td></td></tr><tr><td>(250 מ"ל)</td><td>קימקס</td><td>14000-250</td><td></td></tr><tr><td>(400 מ"ל)</td><td>בלנדר קימקס</td><td>14000-400</td><td></td></tr><tr><td>ביוציטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>אוסטר</td><td></td><td>BRLY07-B00-NP0</td><td></td></tr><tr><td>מספריים בון, בקטון קטן</td><td>, Dickinson</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה (OD 1.5 מ"מ, תעודת זהות 0.86 מ"מ, אורך 10 ס"מ)</td><td>עדיפים Sutter Instruments</td><td>BF150-86-10HP</td><td>נימים מלוטשים באש.</td></tr><tr><td>תמיסת סידן כלוריד (1 M)</td>מצלמת <td>G-Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>OLY-150</td><td></td></tr><tr><td>גז קרבוגן דחוס (95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני)</td><td>איירגז</td><td>X02OX95C2003102</td><td></td></tr><tr><td>חמצן דחוס</td><td>Airgas</td><td>OX 200</td><td></td></tr><tr><td>ממריץ מבודד במתח קבוע</td><td>Digitimer Ltd.</td><td>DS2A-Mk.II</td><td></td></tr><tr><td>כיסויים (22x50 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>16004-314</td><td></td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>Krazy Glue</td><td>KG925</td><td>השתמש באופן אידיאלי בטופס המברשת</td></tr><tr><td>לתוכנת רכישת נתונים</td> מדויקת <td>Axograph</td><td>N/A</td><td>כל תוכנה מקבילה (למשל pClamp) תעבוד.</td></tr><tr><td>מחשב שולחני של תחנת עבודה Dell Precision T1500 בתצורת Tower</td><td></td> המספר הקטלוגי <td>של Dell N/A</td><td>תלוי במחשב הספציפי - כל מחשב יפעל כל עוד הוא יכול להפעיל תוכנה לרכישת אלקטרופיזיולוגיה.</td></tr><tr><td>Digidata 1440A</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>1-2950-0367</td><td></td></tr><tr><td>טיימר דיגיטלי</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td>4 ערוצים טיימר הניתן למעקב</td></tr><tr><td>רפידות ספיגה חד פעמיות</td><td>VWR</td><td>56616-018</td><td></td></tr><tr><td>מספריים דיסקטור</td><td>Fine Science Tools</td><td>14082-09</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח כפולים Personna</td><td></td><td>BP9020</td><td></td></tr><tr><td>כפול אוטומטי בקר טמפרטורה</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>תא הקלטה מותאם למשטח כפול או זרימה למינרית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>החדר המוצג בפרוטוקול זה מיוצר בהתאמה אישית. מקבילה מסחרית תהיה ה-RC-27L של וורנר אינסטרומנטס.</td></tr><tr><td>מתלה ציוד</td><td>אוטומציה מדעית</td><td>FR-EQ70 "</td><td>מתלה אינו הכרחי אך שימושי לארגון אלקטרופיזיולוגיה</td></tr><tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתית'יאתר)- N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>324626-25GM</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Whatman</td><td>1004 070</td><td></td></tr><tr><td>בקנה מידה עדין</td><td>מטלר טולדו</td><td>XS204DR</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה בוער/חום</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי זכוכית (100 x 15 מ"מ)</td><td>קורנינג</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט נתרן מלח הידרט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G8877-250MG</td><td></td></tr><tr><td>דליי קרח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>BAM168072002-1EA</td><td></td></tr><tr><td>וופורייזר isoflurane</td><td>שירותי הרדמה כללית</td><td>Tec 3</td><td></td></tr><tr><td>קלטת מעבדה</td> נייר עדשה <td>Fisher Scientific</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>11-996</td><td></td></tr><tr><td>מקור אור</td><td>Olympus</td><td>TH4-100</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מגנזיום כלוריד (1 מ')</td> <td>איכות ביולוגית</td><td>351-033-721EA מגנטית</td><td></td></tr><tr><td> מוטות ערבוב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-513-56</td><td>מספר הקטלוג יהיה תלוי בגודל מוט הערבוב.</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td><td>לואיגס & Neumann</td><td>SM-5</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור (ידני)</td> <td>Scientifica</td><td>LBM-2000-00</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומרית</td><td>Fine Science Tools</td><td>10089-11</td><td></td></tr><tr><td>צג</td><td>Dell</td><td>2007FPb</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B מגבר מיקרואלקטרודה</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>MULTICLAMP 700B</td><td>ה-MultiClamp 700B צריך לכלול במות ראש, מחזיקי פיפטות ותא דגם.</td></tr><tr><td>N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N&prime;-(2-חומצה אתנסולפונית), (HEPES)</td><td>מחט סיגמא אולדריץ'</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>(20 מד, אורך 1.5</td>)<td>בקטון, דיקינסון</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>נימה ניילון</td><td>YLI Wonder Invisible Thread</td><td>212-15-004</td><td>גודל 0.004. החתול הזה. # הוא מרשת</td></tr><tr><td>ניילון</td> Amazon.com <td>תאגיד וורנר אינסטרומנטס 64-0198</td><td></td><td></td></tr><tr><td>משאבה פרסטלטית</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>פוספוקריאטין די (טריס) מלח</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P1937-1G</td><td></td></tr><tr><td>מחזיקי פיפטות</td><td>מכשירים מולקולריים</td> חוט פלטינה <td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>דיוק</td><td>עולמי</td><td>PT0203</td><td></td></tr><tr><td>נימה של חומצה פולילקטית (PLA)</td><td>Ultimaker</td><td>RAL 9010</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911-500G</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן גלוקונאט</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1550001-200MG</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>Sigma Aldrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>מהדק רולר</td><td>העולם Precision Instruments</td><td>14041</td><td></td></tr><tr><td>קנה מידה</td><td>מטלר טולדו</td><td>PM2000</td><td></td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>פרוסת נבל</td><td>וורנר</td><td>SHD-26GH/2</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>פישר כימיקל</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9888-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי נטול מים</td><td>פישר כימי</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>פישר כימי</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>מרית</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>מרית/כף, גדול</td><td>VWR</td><td>470149-442</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל סטריליים</td><td>נוצה</td><td>72044-10</td><td></td></tr><tr><td>בוחש / פלטה חמה</td><td>קורנינג</td><td>6795-220</td><td></td></tr><tr><td>שסתומי תא עצירה, חד כיווני</td><td>World Precision Instruments</td><td>14054</td><td></td></tr><tr><td>שסתומי עצירה, 3 כיוונים</td><td>World Precision Instruments</td><td>14036</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Acros Organics</td><td>AC177142500</td><td></td></tr><tr><td>תמיכה עבור מהדקים מסתובבים</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-679Q</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים, כלים מדעיים עדינים חדים / קהים</td><td></td><td>מזרק 14001-12</td><td></td></tr><tr><td>(1 מ"ל)</td><td></td>מזרק 309659 <td></td><td>בקטון, דיקינסון</td></tr><tr><td>(60 מ"ל עם קצה Luer-Lok)</td><td>בקטון, דיקינסון 309653</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מהדק תלת שיניים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-769-8Q</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לרקמות,</td><td>כלי מדע עדינים</td> גדולים <td>11021-15</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לרקמות,</td><td>כלי מדע עדינים</td> קטנים <td>11023-10</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות העברה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>ID 1/16 אינץ', OD 3/16 אינץ'</td></tr><tr><td>צינורות</td><td>Tygon</td><td>R-3603</td><td>ID 1/8 אינץ', OD 1/4 אינץ'</td></tr><tr><td>גריז ואקום</td><td>Dow Corning</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>רוטט להב מיקרוטום</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td></td></tr><tr><td>שולחן שיכוך רעידות עם כלוב פאראדיי</td><td>מיקרו-G / TMC-ametek</td><td>2536-516-4-30PE</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק נפחי (1 ליטר)</td>בקבוק נפח <td>Kimax</td><td>KIM-28014-1000</td><td></td></tr><tr><td>(2 ליטר)</td><td>PYREX</td><td>65640-2000</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים חמים</td><td>VWR</td><td>1209 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

חריף קוסמים במוח מציע גישה ניסיונית ניתנת להפעלה כדי לקבל תובנות על הארגון והתפקוד של מעגלים עצביים עם רזולוציה של תא יחיד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, מיקרוסקופיה ופרמקולוגיה. עם זאת, שיקול מרכזי בתכנון ניסויים במבחנה הוא המידה שבה תכשירי פרוסות שונים מסכמים מחדש דפוסים נטורליסטיים של פעילות עצבית כפי שנצפו ב- vivo. במוח שלם, רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין מסונכרנת מאוד המשקפת את המצב ההתנהגותי של החיה, כפי שבא לידי ביטוי בתסביכי הגלים החדים (SWRs) המתרחשים במהלך מצבי ההתעוררות או השינה שאינה REM. SWRs וצורות אחרות של פעילות רשת יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס מבודדות בתנאים מתאימים. על מנת ליישם את ערכת הכלים החזקה של פרוסת המוח על חקירת פעילות רשת ההיפוקמפוס, יש צורך להשתמש בגישה המייעלת את בריאות הרקמות ושמירה על קישוריות תפקודית בתוך רשת ההיפוקמפוס. עכברים נוטרים באופן טרנס-קרדיאלי נוזל שדרתי מלאכותי קר המבוסס על סוכרוז. פרוסות אופקיות המכילות את ההיפוקמפוס נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר כדי לשמר קישוריות סינפטית. פרוסות מתאוששות בתא בסגנון ממשק ומועברות לתא שקוע להקלטות. תא ההקלטה מיועד לתדלוק כפול של נוזל שדרתי מלאכותי בקצב זרימה גבוה כדי לשפר את החמצון של הפרוסה. פרוטוקול זה מניב רקמה בריאה המתאימה לחקירת פעילות רשת מורכבת וספונטנית במבחנה.

מוצגות להלן הקלטות מייצגות מפרוסות HEC שהוכנו כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר התאוששות בתא מעצר ממשק (איור 1C), פרוסות מועברות בנפרד לתא הקלטה שקוע (איור 2B). תא ההקלטה מסופק עם ACSF רווי קרבוגן באמצעות משאבה פריסטלית(איור 2A). המשאבה שואבת תחילה ACSF מן הכף מחזיק לתוך מאגר מחומם. קווי קרבוגן ממוקמים הן לתוך ההחזקה והן למאגר המחומם כדי לספק חמצון מתמשך של התקשורת. עמעום פועם, המורכב מסדרה של מזרקים מלאים באוויר, ממוקם בין המשאבה peristalt...

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לחקור את המנגנונים העומדים בבסיס תנודות רשת ההיפוקמפוס בתכשירים חריפים של פרוסות מוח של עכבר. בתכשיר זה, ההקלטות מבוצעות בתנאים שקועים בפרוסות היוצרות תנודות רשת ספונטניות, המאפשרות לבצע טכניקות פרמקולוגיות ואופטוגנטיות, ולהמחיש הקלטות של תא בודד. לזלוף דרך הלב, מיד לפני הוצאת העכבר מתא האיזופלורן, מלאו מכסה צלחת פטרי בשלושה עד חמישה מילימטרים של תמיסת סוכרוז צוננת, ומלאו את תחתית צלחת הפטרי בכסנטימטר אחד של תמיסת סוכרוז צוננת.העבירו במהירות את העכבר המורדם לכרית הסופגת השמאלית, והשתמשו בשלוש פיסות סרט כדי לאבטח את הגפיים הקדמיות והזנב. בעזרת מלקחיים גדולים של רקמות ומספריים כירורגיים, אוהל את העור ובצע חתך לאורך מתחתית עצם החזה לחלק העליון של החזה. השתמש במלקחיים כדי למשוך את עצם החזה והשתמש במספריים כדי לחתוך את הסרעפת.השתמש במספריים כדי לחתוך את כלוב הצלעות מכל צד בתנועה אחת גדולה לכיוון הנקודה שבה הגפה הקדמית פוגשת את הגוף, והשתמש במלקחיים כדי למקם את החלק הקדמי של כלוב הצלעות לכיוון הראש. השתמש במספריים כדי לבצע חתך אופקי כדי להסיר לחלוטין את הצלעות, והשתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלב במקומו תוך החדרת מחט זלוף בגודל 20 לחדר השמאלי. כאשר המחט במקומה, השתמש במספריים קטנים לדיסקציה כדי לבצע חתך בפרוזדור הימני, ולאפשר לדם להישטף ממערכת הדם.כדי לחל

acute-mouse-brain-slicing-to-investigate-spontaneous-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר פרוצדורות להכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים סינפטיים הקשורים להזדקנות המוח הקשורים לגיל מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר.

הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

סרטון זה מדגים פרוטוקול מפורט להכנת פרוסות מוח אופקיות בהיפוקמפוס מעכברים, תוך התמקדות בשמירה על שלמות מסלולי סיבי ההיפוקמפוס. התהליך כולל חיתוך ואבטחה קפדניים של המוח, שימוש בויברטומה לחיתוך, ושמירה על תנאי רקמה אופטימליים עם נוזל קרבוגני, וכתוצאה מכך פרוסות מוח בהיפוקמפוס מוכנות לניסויים נוספים.

השגת פרוסות מוח אופקיות של עכבר היפוקמפוס

הסרטון מדגים הליך לרישום פוטנציאל השדה המקומי (LFP) בפרוסות קליפת המוח של ההיפוקמפוס-אנטורינלי של עכבר. גירוי חשמלי מסופק ברדיאטום שכבה CA3 של ההיפוקמפוס, אשר גורם לשינויים בפוטנציאל הפוסט-סינפטי בפירמידלה של שכבת CA1. השינוי המשולב בפוטנציאל הממברנה של נוירוני CA1, המכונה פוטנציאל השדה המקומי, נרשם.

רישום פוטנציאל שדה מקומי בפרוסות קליפת המוח של ההיפוקמפוס-אנטורינלי של עכבר

פיתחנו היפוקמפוס פרש במבחנה השומר מערך CA1-CA3 של נוירונים. בשילוב עם מערך מיקרו-אלקטרודה החודרת, פעילות עצבית יכולה להיות במעקב בשתי אוריינטציות אורכי ורוחביות. שיטה זו מספקת יתרונות על פני הכנות פרוסה בהיפוקמפוס כמו ההתפשטות בכל היפוקמפוס ניתן להקליט בו זמנית.

עצבי פעילות הרבייה בהיפוקמפוס הכנה פרש בחודר מיקרו-אלקטרודה Array

נוהל לאיתור ואבחון מדויק סינפסות בהיפוקמפוס פרוסות באמצעות immunofluorescence הוא המתוארים במאמר זה.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

אנו מדגימים כיצד לבצע הקלטה וחשמליים מודולציה של פעילות אפילפטית 4-aminopyridine-induced פרוסות המוח מכרסמים באמצעות מערכי microelectrode. חדר הקלטה מותאמת אישית שומר על רקמות הכדאיות ברחבי מישיבות ניסיוני. חיים מיפוי אלקטרודה, מבחר זוגות מגרה מבוצעות על ידי ממשק משתמש גרפי מותאם אישית.

הקלטה של אפנון של הפעילות פרוסות המוח מכרסמים מצמידים מערכים Microelectrode

השתמשנו והקליט אלקטרודות של היפוקמאל פרוסות המוח האורך ו longitudinally הקלטה ואלקטרודות גירוי ההיפוקמפוס הראש ב vivo לעורר את הפוטנציאל המיטיות בפוטנציאלים והפגינו הפלסטיות הסינפטית ארוכת הטווח לאורך CA1 האורך האורכי.

חקירת הפלסטיות הסינפטית לטווח ארוך בהיפוקמפוס הCA1 על ידי אלקטרופיזיולוגיה הקלטת שדה

זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול שיטתי כדי להשיג פרוסות מוח היפוקמפוס אופקי בעכברים. מטרת מתודולוגיה זו היא לשמר את השלמות של מסלולי סיבים בהיפוקמפוס, כגון הנתיב המחורר ודרכי הסיבים הטחובים להערכת תהליכים נוירולוגיים הקשורים לgyrus.

פרוסות היפוקמפוס אופקיות של מוח העכבר

אנו מציגים פרוטוקול להכנת פרוסות חריפות מההיפוקמפוס הגבי-ביניים של עכברים. אנו משווים הכנה רוחבית זו עם חתך קורנל במונחים של איכות הקלטות ושמירה על תכונות מורפולוגיות של נוירונים מוקלטים.

הכנת פרוסות חריפות מהיפוקמפוס הגבי להקלטה של תא שלם ושחזור עצבי בGyrus דנטאטה של עכברים בוגרים

חקור מנגנוני תנודות רשת היפוקמפוס בחתיכות מוח עכבר חריפות. הפרוטוקול כולל הכנת חתיכות אופקיות מהיפוקמפוס-קורטקס אנתורינלי, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ותנאי חמצון מבוקרים לשמירת פעילות ספונטנית.

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

גלה סרטונים נוספים