שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים
25 ביוני 2021
פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.
פרוטוקול זה משלב RNAscope פלואורסצנטי בהכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה באמצעות תכשירים טריים מוקפאים או קבועים במוח. טכניקה זו מאפשרת גמישות על ידי הדגמת שילוב של הכלאה רגישה מאוד באתרו ושיטות אימונוהיסטוכימיה להדמיה מרחבית של מטרות RNA וחלבון באותה דגימת רקמה. שיטה זו ישימה לתיוג מולטיפלקס בחתך רקמת המוח, ומסייעת לחקור ארגון מרחבי ומשמעות תפקודית של mRNA וחלבונים בתוך אוכלוסיות נוירונים הטרוגניות במדעי המוח.
פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בשלבי עיבוד עבור רקמה קפואה טרייה ורקמה קבועה פרפורמלדהיד. כדי להתחיל לחתוך את רקמת המוח הטרייה-קפואה, הצמידו אותה לצ'אק הקריוסטט המצונן מראש וחתכו קטעי קורונל בעובי 14 מיקרומטר. הרכיבו את הקטע על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית טעונה.
העבר את השקופית הטעונה לתוך תיבת שקופיות. לאחר מכן מעבירים את הקופסה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש. עבור קיבוע רקמות, לסנן את הפתרון paraformaldehyde מוכן.
מצננים ל-4 מעלות. הביאו את המגלשה המותקנת מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש ומיד טבלו אותה בתמיסת הפרפורמלדהיד המצוננת מראש למשך 15 דקות, בצעו התייבשות של רקמה טרייה-קפואה כדי להבטיח שמגלשת הזכוכית יבשה לחלוטין. לאחר הסרת המוח מתושבת קבועה של שפע טרנסקרדילי, באמצעות מיקרוטום רוטט, חתכו קטעי רקמה בעובי 30 מיקרומטר.
אחסן את החלקים החתוכים בתמיסת הגנה קריופרוטקטיבית. ביום בדיקת FISH, העבירו את החלק הצף החופשי לצלחת תרבית תאים בת 12 בארות המכילה PBS טוחנת 0.1 ועוררו אותה במהירות 90 עד 100 סל"ד על שייקר פלטפורמה מסתובב כדי לשטוף את ההגנה הקריואקטיבית. לאחר מכן, באמצעות מברשת צבע, הרכיבו את החלק שטוח על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית כדי למנוע ניתוק במהלך הכביסה, וייבשו באוויר למשך שעתיים לפחות.
באמצעות עט מחסום הידרופובי, צייר מחסום הידרופובי סביב החלק כדי להכיל את ריאגנטים FISH. לאחר עיבוד מקדים, הרקמה מודגרת בתמיסת פרוטאז ועוברת הכלאה עם בדיקות RNAscope למשך שעתיים בהתאם להנחיות היצרן. לאחר מכן, שלבי הגברה רציפים ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מבוצעים.
התחילו בהכנת תא מוגן אור לח לדגירת שקופיות. באמבט מים, יש לחמם את חיץ הכביסה 50X ולבדוק ל-40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, הכינו ליטר אחד של חיץ כביסה 1X מריכוז המלאי של 50X.
הכינו את תערובת הגשושית כמתואר בכתב היד של הטקסט. לטיפול בפרוטאינאז, יש להוסיף פרוטאינאז 3 לאזור הרקמה ולדגור עליו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כדי לשטוף את הפרוטאינאז, טבלו בעדינות את המגלשה ב-PBS טוחנת 0.1 בטמפרטורת החדר, והימנעו מניתוק חלקים.
עבור הכלאה, להוסיף את תערובת הבדיקה על החלק הרקמתי. הניחו אותו בתא לח שחומם מראש. ואז לדגור אותו במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.
שטפו את מקטע הרקמה עם חיץ השטיפה פעמיים במשך שתי דקות. להגברת אותות, באמצעות בקבוק טפטפת, הוסף תמיסת הגברה לכיסוי קטע הרקמה והדגירה כמתואר בטקסט. הוסיפו את התמיסה החוסמת לאזור הרקמה ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
החלק את השקופית כדי להסיר את מאגר החסימה העודף לאחר הדגירה. עכשיו, לדגור את החלק עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את המגלשה שלוש פעמים עם 1X TBS.
מוסיפים את הנוגדן המשני ודגרים על המקטעים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בחן את השקופית תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה. רכוש תמונות מייצגות בהגדלה של פי 20 ושמור אותן כקבצי TIF.
במחקר הנוכחי, איכות הרקמה, שלמותה והיעדר זיהום חיידקי אושרו על ידי היעדר תיוג DAPI. תיוג מבדיקות בקרה חיוביות המכוונות ליוביקוויטין C, פפטידילפרוליל איזומראז B ו-RNA פולימראז IIA mRNA אישר את שלמות ה-RNA. בתכשירים טריים מוקפאים כדי להבחין בין נוירונים חיוביים ל-GalR1 mRNA בתוך ה-NTS, נעשה שימוש בסמנים נוירוכימיים נוספים.
הטרנספורטר השלפוחית הקשור לקרום היה מסומן בבירור. לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים כגון טירוזין הידרוקסילאז ו-GFP המבוטאים תחת הבקרה של מקדם PHOX2B נצפו באופן קלוש ותוארו כפלוקולנטים מכיוון שהם חסרים מתאר ברור. תיוג בדיקת GalR1 FISH של mRNA ציטופלזמי GalR1 היה מנוקב ונצפה בבירור.
כדי לאשר שאיכות האימונוהיסטוכימיה תלויה בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים, חלבונים גרעיניים וציטופלזמיים שונים סומנו במקביל ל-FISH באותם חלקי רקמה. הציטופלזמי PHOX2B GFP היה בעל מראה פלוקולנטי. בעוד שהאות הגרעיני של חלבון PHOX2B היה ברור, מה שאישר תיוג חיסוני באיכות גבוהה יותר בשילוב עם FISH.
כאשר בוצע על מקטעים קפואים קבועים בשילוב עם FISH, אימונוהיסטוכימיה הייתה אמינה ללא קשר ללוקליזציה תת-תאית. תאי עצב חיוביים ל-GlyT2 mRNA היו ממוקמים בגחון ל-NTS ולא בתוך ה-NTS. נוירונים מסוג GlyT2 mRNA חיובי ו-PHOX2B mRNA חיובי לא עברו לוקליזציה.
תת-אוכלוסייה של נוירוני NTS חיוביים ל-PHOX2B mRNA הייתה טירוזין הידרוקסילאז אימונוריאקטיבי, ואף אחד מהם לא הכיל GlyT2 mRNA. RNAscope מאפשר הדמיה וניתוח של התפלגות RNA ברזולוציה של מולקולה בודדת בתאים וברקמות. הוא מעצים מחקר במינים חדשים של רנ"א, מנגנוני מחלות, דפוסי ביטוי גנים, מגוון נוירונים ואינטראקציות תאיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לשילוב של היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) בחתכים של מוח עכבר קפואים טריים וקיבועים. טכניקה זו מאפשרת ויזואליזציה מרחבית של מטרות RNA וחלבון בו-זמנית, ובכך מסייעת בחקירת אוכלוסיות נוירונליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- אימונוהיסטוכימיה
רקע
- המחקר בוחן את הארגון המרחבי של mRNA וחלבונים באוכלוסיות נוירונליות הטרוגניות.
- שילוב של FISH ו-IHC מאפשר סימון מרובה (multiplex labeling) בחתכים של רקמת מוח.
- הוא נועד לשפר את ההבנה של ביטוי גנים ומיקום חלבונים בתוך המוח.
- הפרוטוקול ישים הן לרקמות קפואות-טריות והן לרקמות מקובעות בפראלדהיד.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה אמינה וגמישה לגילוי סימולטני של RNA וחלבון.
- לשפר את חקר ההפצה של mRNA והמיקום של חלבונים בתאים עצביים.
- לאמת את איכות הסימון האימונוהיסטוכימי בשילוב עם FISH.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נעשה שימוש בחתכי מוח קפואים בטריות ובחתכים מקובעים בפראלדהיד כפלטפורמה המרכזית.
- המודל הביולוגי כלל רקמת מוח של עכבר, תוך התמקדות באותות של RNA וחלבונים בנוירונים.
- השיטה כוללת שלבים קריטיים כגון חיתוך, קיבוע, היברידיזציה והגברת אות.
- פרוטוקולי דגירה ושטיפה מפורטים בוצעו כדי להבטיח תוצאות ברורות.
תוצאות עיקריות
- גששים של ביקורת חיובית אישרו את שלמות ה-RNA, בעוד שדרגות שונות של בהירות אות נצפו בחלבונים.
- המחקר הדגים את היכולת להבחין בין אותים ציטופלזמיים לאותים גרעיניים בנוירונים.
- דווח על אינדיקציות לאוכלוסיות נוירונליות מובחנות ולהבעות ה-RNA/חלבון שלהן.
- השילוב של FISH ו-IHC הוכח כ đáng-אמין להדמיה של מטרות מרובות בתוך אותם חתכים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר חקירה מתקדמת של גיוון נוירוני ואינטראקציות בתוך רקמת המוח.
- מחקר זה מספק מסגרת למחקרי המשך בנוגע למנגנונים נוירונליים ולמודלים פוטנציאליים של מחלות.
- השיטה מעשירה את הבנתנו לגבי דינמיקה מולקולרית ותאית במדעי המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שילוב של multiplex FISH עם IHC פלואורסצנטי מאפשר למחקר ופיתוח בביופארמה לפתור את סוגיית הביטוי המקומית המשותף (spatial co-expression) של מטרות RNA וחלבון בתוך אוכלוסיות נוירונליות הטרוגניות, ובכך לתמוך בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות למדעי העצבים. גישה זו מגבירה את הביטחון החיזוי על ידי קישור חתימות מולקולריות לפנוטיפים תאיים, ובכך מסייעת בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בשלבי הגילוי המוקדמים. התאימות של השיטה לרקמות קפואות-טריות ורקמות מקובעות מספקת גמישות בזרימת העבודה עבור בחינת מטרות במודלים פרה-קליניים שונים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של mRNA בריכוז נמוך (למשל, galanin receptor 1) ותסננים (transcripts) בריכוז גבוה בתוך גרעיני מוח שהוגדרו באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות סימון סימולטני של RNA וחלבון, ובכך מבהיר את המעורבות של המטרה (target engagement) ואת ויסות המסלולים במעגלים עצביים.
- ערך ניבוי: מסייע בתיעדוף תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין תת-אוכלוסיות של נוירונים על בסיס חתימות נוירוכימיות, ובכך מפחית את העמימות בבחירת המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות עוברות תיקוף לסריקות המשך על ידי אישור שלם ה-RNA באמצעות גשים של ביקורת חיובית (ubiquitin C, peptidylprolyl isomerase B, RNA polymerase IIA).
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות תנאי אינקובציה של פרוטאז והibridiזציה אופטימליים, מה שמשפר את ההדירות בין דגימות רקמה קפואות ודגימות רקמה מקובעות.
- ערך של יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה לזיהוי רב-משתני (multiplex) של RNA-חלבון, ובכך מסייע להערכה מהימנה של תרכובות במסגרת קמפיינים של סריקה פנוטיפית.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: משפר את ההלימה של ביומארקרים תרגומיים על ידי ויזואליזציה של הארגון המרחבי של ביטוי mRNA וחלבונים בגרעיני גזית המוח הרלוונטיים למחלה (למשל, NTS).
- ערך תפעולי: מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי שמירה על איכות ה-IHC לאחר ביצוע FISH, במיוחד עבור מטרות קשורות לממברנה.
- קידום מותאם סיכונים: מסייע בקבלת החלטות על ידי חשיפת היעדר קולוקליזציה בין נוירונים חיוביים ל-GlyT2 mRNA לבין נוירונים חיוביים ל-PHOX2B mRNA, ובכך מזקק מודלים מכניסטיים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף התגליות, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומאפשרת תיקוף מרחבי של מטרות מולקולריות באוכלוסיות נוירונליות לפני ביצוע סריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי זיהוי התפלגות ה-RNA בתוך נוירונים שזוהו בשיטת אימונוהיסטוכימיה, ובכך מפחיתה עמימות מכניסטית.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות זרימות עבודה סטנדרטיות של FISH-IHC, ומבטיחה קריאות מרחביות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תגובה לתרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים מרחביים כמותיים באמצעות זיהוי אות פלואורסצנציה, מה שמאפשר השוואה של רמות ביטוי של RNA וחלבון בתנאים ניסויים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי תיקוף ביטוי של מטרות בדגימות רקמה מקובעות, ובכך תומך במידול מחלות המותאם לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת פרופיל מרחבי רב-פעמית עבור תוכניות גילוי במדעי המוח, ובכך ממקסמת את ההשקעה בתשתית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי באמצעות ויזואליזציה ישירה של ביטוי משותף של RNA-חלבון, ובכך מפחית את מספר התוצאות החיוביות השגויות באימות יעדים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות שלבי פרוטאז והibrדיזציה מותאמים, הממזערים את השונות בסימון מולטיפלקס.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות ההונית על ידי מתן אפשרות להסגת סיכונים מוקדמת של יעדים באמצעות רזולוציה סוב-סלולרית, ובכך מפחית נשירה בשלבים מאוחרים עקב חוסר התאמה ביולוגית.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון באמצעות זיהוי תתי-אוכלוסיות נוירונליות בעלות פרופילי RNA-חלבון מובחנים, ומספק מידע לבחירת האינדיקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית, טיפול בגששי RNA ואופטימיזציה של נוגדנים לצורך ניהול ספציפיות האות.
- תלוי בסביבות נטולות RNase, בכלי חיתוך של קריוסטט או מיקרוטום, ובמערכות דימות פלואורסצנטי עם סטים מתאימים של מסננים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של זמני דגירה של פרוטאז ופרוטוקולים לאישור נוגדנים כדי להבטיח איכות IHC עקבית לאחר FISH.
- דורש התאמה בהתאם ללוקליזציה התת-תאית של החלבון, שכן מטרות ציטופלזמיות עשויות לדרוש פתרון בעיות נרחב בעוד שחלבונים קשורי ממברנה מראים ספציפיות שנשמרה.
- מוגבל על ידי אתגרי טיפול ברקמות בהכנות קפואות-מקובעות, אם כי איכות ה-IHC היא גבוהה יותר כאשר היא מותאמת עם RNAscope.
