Name: שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: למדו שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית בחלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים. שיטה זו מאפשרת הדמיית RNA וחלבונים יחד לחקירת אוכלוסיות נוירונליות במוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט דיסקברי של מועצת המחקר האוסטרלית DP180101890 ומענק פרויקט קרן המחקר הרפואי רבקה ל. קופר PG2018110

<ol><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Annese, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+dual+ISH-IHC+technology+to+study+angiogenesis+in+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas.</a> Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).</li>
<li>Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+in+vivo+gene+expression+during+collective+cell+migration+using+an+integrated+RNAscope%2C+immunohistochemistry+and+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method.</a> Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, 55(2014).</li>
<li>Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+and+cell-specific+confirmation+of+RNA+and+protein+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).</li>
<li>Kersigo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RNAscope+whole+mount+approach+that+can+be+combined+with+immunofluorescence+to+quantify+differential+distribution+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PLoS One. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+and+immunofluorescence+imaging+for+detection+of+cytokine+expression+in+microglia%2Fmacrophage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li>
<li>Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+respiratory-related+brain+regions+to+long-term+hypercapnia%3A+focus+on+neuropeptides+in+the+RTN%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1343(2019).</li>
<li>Lazarenko, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensitivity+and+ultrastructure+of+the+retrotrapezoid+nucleus+in+Phox2b-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Records%22%5BJournal%5D)">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).</li>
<li>Kerr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+knock-in+mice+expressing+fluorescently+tagged+galanin+receptors+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).</li>
<li>Kachidian, P., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+tyrosine+hydroxylase+in+neuronal+targets+and+efferents+of+the+area+postrema+in+the+nucleus+tractus+solitarii+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).</li>
<li>Stornetta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Phox2b+by+brainstem+neurons+involved+in+chemosensory+integration+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat.</a> Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).</li>
<li>Gilmor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+putative+vesicular+acetylcholine+transporter+in+rat+brain+and+localization+in+cholinergic+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).</li>
<li>Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+neuropeptides+derived+from+a+common+precursor+are+differentially+packaged+and+transported%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported.</a> Cell. 54 (6), 813-822 (1988).</li>
<li>Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tyrosine-hydroxylase+immunocytochemistry+in+paraffin+sections+using+pretreatment+with+proteolytic-enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).</li>
<li>Biancardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+excitatory%2C+inhibitory%2C+and+modulatory+afferent+projections+to+the+anatomically+defined+active+expiratory+oscillator+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).</li>
<li>Matthews, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+in+the+brainstem%3A+an+excitatory+disynaptic+pathway+for+control+of+whisking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+methods+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).</li>
<li>Yamashita, S., Katsumata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+in+immunohistochemistry%3A+mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).</li>
<li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval%3A+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+mechanisms+and+application+to+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li>
</ol>

במדעי המוח, FISH ו-IHC משמשים באופן שגרתי לחקר הארגון המרחבי והמשמעות התפקודית של mRNA או חלבונים בתוך תת-אוכלוסיות עצביות. הפרוטוקול המתואר במחקר זה משפר את היכולת לזיהוי סימולטני של mRNA וחלבונים במקטעי מוח. בדיקת FISH-IHC המשולבת שלנו אפשרה זיהוי פנוטיפי של תת-אוכלוסיות עצביות מובחנות ב-NTS הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירים קבועים במוח. FISH-IHC בתכשירי רקמות קפואות קבועות הניבו תוצאות IHC אמינות. לדוגמה, מולטיפלקס FISH עבור mRNA בשפע נמוך וגבוה (GalR1 ו-GlyT2 בהתאמה) ו-IHC (המכוון לטירוזין הידרוקסילאז) גילו כי Ga...

חלבונים ו-mRNA המגדירים באופן נוירוכימי תת-אוכלוסיות של תאי עצב מזוהים בדרך כלל עם שילוב של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו/או הכלאה באתרו (ISH), בהתאמה. שילוב ISH עם טכניקות IHC מאפשר אפיון של דפוסי קולוקליזציה ייחודיים לנוירונים פונקציונליים (קידוד נוירוכימי) על ידי מקסום יכולת התיוג המרובה.
שיטות ISH פלואורסצנטיות (FISH), כולל RNAscope, הן בעלות רגישות וספציפיות גבוהות יותר בהשוואה לשיטות גילוי RNA מוקדמות יותר כגון ISH רדיואקטיבי ו- ISH כרומוגני לא רדיואקטיבי. FISH מאפשר הדמיה של תעתיקי mRNA בודדים ככתמים מוכתמים מנוקבים1. יתר על כן, בדיקת RNAscope מאפשרת לסמן מספר גדל יותר של מטרות RNA בכל פעם, באמצעות תגי פלואורופור שונים. למרות יתרונות אלה, מגבלות טכניות עשויות להשפיע על מספר הפלואורופורים/כרומוגנים שניתן להשתמש בהם בניסוי יחיד. אלה כוללים זמינות של ערכות מסנני מיקרוסקופ; שיקולים אלה מתעצמים כאשר זיהוי נוירוכימי משתמש בשילוב FISH ו-IHC, בהשוואה לשימוש בכל טכניקה בנפרד, שכן צעדים אינהרנטיים אופטימליים לשיטה אחת עלולים להזיק לאחרת.
יישום קודם של FISH בשילוב עם IHC הדגים ביטוי של מטרות תאיות ספציפיות בלימפומות של תאי B אנושיים2, עוברי אפרוחים3, עוברי דגי זברה4, רשתית עכבר5 ותאי אוזן פנימיתשל עכבר 6. במחקרים אלה, הכנת רקמות הייתה או פרפין קבוע פורמלין משובץ (FFPE) 2,3,5 או הר שלם טרי 4,6. מחקרים אחרים יישמו רנ"א כרומוגני על תכשירי מוח קבועיםשל עכברים וחולדות 7,8,9. בפרט, Baleriola et al.8 תיאר שתי תכשירי רקמות שונים עבור ISH-IHC משולב; קטעי מוח קבועים של עכבר ומקטעי מוח אנושיים מסוג FFPE. בפרסום שפורסם לאחרונה, שילבנו FISH ו-IHC פלואורסצנטי על מקטעים קפואים טריים, כדי להמחיש בו זמנית mRNA בשפע נמוך (קולטן גלנין 1, GalR1), mRNA בשפע גבוה (גליצין טרנספורטר 2, GlyT2) וחלבון טרנספורטר אצטילכולין שלפוחית (vAChT)10 במבנה הרשתית של גזע המוח.
גרעין מערכת הבידוד (באנגלית: Nucleus of the Solitary tract או NTS) הוא אזור מרכזי במוח המעורב בתפקוד אוטונומי. אוכלוסייה הטרוגנית זו של תאי עצב, הממוקמת במוח האחורי, מקבלת ומשלבת מספר עצום של אותות אוטונומיים, כולל אלה המווסתים את הנשימה. ה-NTS מכיל מספר אוכלוסיות נוירונים, אשר עשויות להיות מאופיינות פנוטיפית על ידי דפוס הביטוי של מטרות mRNA כולל GalR1 ו-GlyT2 וסמנים חלבוניים עבור האנזים טירוזין הידרוקסילאז (TH) וגורם השעתוק Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
הבעלים של RNAscope ממליץ על תכשירים טריים של רקמות קפואות, אך רקמות שהוכנו על ידי קיבוע זילוח טרנסקרדיאלי של בעלי חיים שלמים, יחד עם הגנה קריוגנת לטווח ארוך (אחסון ב -20 מעלות צלזיוס) של חלקי רקמות קפואות קבועות, נפוצים במעבדות רבות. לפיכך, ביקשנו לקבוע פרוטוקולים עבור FISH בשילוב עם IHC באמצעות תכשירי רקמות קפואות טריות וקבועות. כאן, אנו מספקים חלקי מוח קפואים וקבועים טריים: (1) פרוטוקול לשילוב של FISH ו- IHC פלואורסצנטי (2) תיאור של איכות mRNA ותיוג חלבונים המיוצרים, בעת שימוש בכל תכשיר (3) תיאור של ביטוי GalR1 ו- GlyT2 ב- NTS.
המחקר שלנו גילה כי בשילוב עם מתודולוגיית RNAscope, הצלחת IHC השתנתה בתכשירים טריים קפואים וקבועים מוקפאים, והייתה תלויה בלוקליזציה של חלבוני המטרה בתוך התא. בידינו, תיוג חלבונים הקשורים לממברנה היה תמיד מוצלח. לעומת זאת, IHC עבור חלבון ציטופלזמי דרש פתרון בעיות גם במקרים שבהם החלבון הציטופלזמי בא לידי ביטוי יתר בחיה טרנסגנית (Phox2b-GFP)11. לבסוף, בעוד GalR1 מבוטא בנוירונים שאינם קטכולמינרגיים ב-NTS, ביטוי GlyT2 נעדר ב-NTS.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 עכבר</td><td>Australian BioResources, Moss Vale</td><td>MGI: 2159769</td><td></td></tr><tr><td>Phox2b-eGFP</td><td>Australian BioResources, Moss Vale</td><td>MGI: 5776545</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>הפרין-נתרן</td><td>קליפורד האלאם 1070760</td><td></td><td>התייעץ עם ספק וטרינרי מקומי או בית מרקחת.</td></tr><tr><td>Lethabarb (נתרן פנטברביטול) הזרקת המתת חסד</td><td>Virbac (אוסטרליה) Pty Ltd</td><td>N/A</td><td>התייעץ עם וטרינר לגבי תקנות התרופות המקומיות לגבי נתרן פנטברביטול</td></tr><tr><td>אבקת אגרוז בדרגה מולקולרית</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5077</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound, 118mL</td><td>Scigen Ltd</td><td>4586</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, פריל, 95%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון, משקל מול ממוצע 40,000&nbsp; (PVP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>עם או בלי DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit (עד יכולת 3-plex)</td> <td>Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)</td><td>ADV320850</td><td>כולל 50x מאגר כביסה ופרוטאז III</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>Tris (הידרוקסימתיל)aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, לביולוגיה מולקולרית</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop incubator</td><td>Thermoline Scientific Micro Incubator</td><td>דגם: TEI-13G</td><td></td></tr><tr><td>Brain Matrix, עכבר, 30 גרם מבוגר, Coronal, 1mm</td><td>Ted Pella</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>מחט ציור (מד 23 אינץ')</td><td>BD</td><td>0288U07</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות וקטור</td><td>עט מחסום הידרופובי</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes מגבוני משימות עדינים</td><td>קימברלי קלארק מקצועי</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>אולימפוס BX51</td><td>אולימפוס</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>משאבה</td> <td>פריסטלטיתסדרת Coleparmer Masterflex</td><td>L/S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה דיגיטלית Retiga 2000R</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-CLR</td><td>מצלמה צבעונית</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus זכוכית שקופיות (לבן)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום רוטט (Vibratome)</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Whatman נייר סינון איכותי, דרגה 1, קוטר 110 מ"מ</td><td>Merck</td><td>WHA1001110</td><td></td></tr><tr><td><חזק> תוכנות</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW&nbsp;</td><td>Corel Corporation</td><td>גרסה 7</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (הפצת ImageJ)</td><td>קוד פתוח/רישיון ציבורי כללי של GNU (GPL)</td><td>N/A</td><td>ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; שינדלין, ג'יי & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ לדור הבא של נתוני תמונה מדעיים", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z&nbsp; &nbsp; ופיג'י: שינדלין, ג'יי; ארגנדה-קאררס, א. & Frise, E. et al. (2012), "פיג'י: פלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונות ביולוגיות", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019&nbsp;</td></tr><tr><td><נוגדנים חזקים>ראשוניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-טירוזין הידרוקסילאז</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB1542</td><td>פוליקלונל כבשים (דילול 1:1000), RRID: נוגדן</td></tr><tr><td>AB_90755 אנטי-טירוזין הידרוקסילאז, שיבוט LNC1</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB318</td><td>חד-שבטי עכבר (דילול 1:1000), RRID: נוגדן</td></tr><tr><td>AB_2201528 אנטי-שלפוחית אצטילכולין טרנספורטר (VAchT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABN100</td><td>Goat polyclonal (דילול 1:1000), RRID: AB_2630394</td></tr><tr><td>GFP נוגדן</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308</td><td>ארנב פוליקלונלי (דילול 1:1000), RRID: נוגדן AB_10003058</td></tr><tr><td>Phox2b (B-11)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376997</td><td>חד-שבטי עכבר (דילול 1:1000), RRID:</td></tr> <tr><td>AB_2813765<נוגדנים משניים>משניים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td>חמור נגד ארנב (דילול 1:400), RRID: AB_2313584</td></tr><tr><td>AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-155-147</td><td>חמור נגד כבשים (דילול 1:400), RRID: AB_AB_2340725</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td>חמור נגד עזים (דילול 1:400), RRID: AB_2340415</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td>חמור נגד עכבר (דילול 1:400), RRID: AB_2619678</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-175-147</td><td>Donkey anti-Sheep (דילול 1:400), RRID: AB_2340730</td></tr><tr><td><בדיקות רנסקופ חזקות></חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קולטן גלנין 1 בדיקת אוליגונוקלאוטיד</td><td>ACDBio</td><td>448821-C1</td><td>מכוונת bp 482 - 1669 (Genebank ref: NM_008082.2)</td></tr><tr><td>Glycine transporter 2 בדיקת אוליגונוקלאוטידים</td><td>ACDBio</td><td>409741-C3</td><td>מכוון bp 925 - 2153 (Genebank ref: NM_148931.3)</td></tr> <tr><td>בדיקת Phox2b oligonucleotide</td><td>ACDBio</td><td>407861-C2</td><td>מכוונת bp 1617 - 2790 (Genebank ref: NM_008888.3)</td></tr></tbody></table>

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

הכלאה פלואורסצנטית באתרו (באנגלית: Fluorescent in situ hybridization, בקיצור FISH) היא טכניקה מולקולרית המזהה נוכחות והתפלגות מרחבית של תעתיקי רנ"א ספציפיים בתוך תאים. פנוטיפ נוירוכימי של נוירונים המזוהים פונקציונלית דורש בדרך כלל תיוג מקביל עם נוגדנים מרובים (חלבון מטרה) באמצעות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ואופטימיזציה של הכלאה באתרו (RNA ממוקד), במקביל. ניתן להשיג "חתימה נוירוכימית" כדי לאפיין נוירונים מסוימים, אולם גורמים מסובכים כוללים את הצורך לאמת מטרות FISH ו-IHC לפני שילוב השיטות, והמספר המוגבל של רנ"א וחלבונים שניתן לכוון בו זמנית באותו מקטע רקמה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול, המשתמש הן בתכשירים טריים קפואים והן בתכשירי מוח קבועים של עכברים, אשר מזהה מספר mRNA וחלבונים באותו אזור במוח באמצעות RNAscope FISH ואחריו פלואורסצנטיות immunostaining, בהתאמה. אנו משתמשים בשיטה המשולבת כדי לתאר את דפוס הביטוי של mRNA בשפע נמוך (למשל, קולטן גלנין 1) ו-mRNA בשפע גבוה (למשל, טרנספורטר גליצין 2), בגרעיני גזע המוח המזוהים אימונוהיסטוכימית.
שיקולים מרכזיים לסימון חלבונים במורד הזרם של בדיקת FISH מתרחבים מעבר להכנת רקמות ואופטימיזציה של תיוג בדיקת FISH. לדוגמה, מצאנו כי קשירת נוגדנים וספציפיות התיוג יכולים להיות מושפעים לרעה על ידי שלב פרוטאז בתוך בדיקת FISH. פרוטאזות מזרזות פיצול הידרוליטי של קשרים פפטידיים, ומקלות על כניסת גשושיות FISH לתאים, אולם הן עשויות גם לעכל את החלבון הממוקד על ידי בדיקת IHC שלאחר מכן, ולייצר קשירת מטרה. המיקום התת-תאי של חלבון המטרה הוא גורם נוסף התורם להצלחת IHC לאחר בדיקת FISH. ראינו שספציפיות IHC נשמרת כאשר חלבון המטרה קשור לממברנה, בעוד שהתמקדות IHC בחלבון ציטופלזמי דרשה פתרון בעיות נרחב. לבסוף, מצאנו שהטיפול ברקמה קפואה קבועה המותקנת במגלשה מאתגר יותר מרקמה קפואה טרייה, אולם איכות IHC הייתה בסך הכל טובה יותר עם רקמה קפואה קבועה, בשילוב עם RNAscope.

כאן, אנו מתארים שיטה לשילוב FISH מרובה עם IHC פלואורסצנטי כדי למקם ביטוי mRNA עבור GalR1 ו- GlyT2 באמצעות רקמות קבועות קפואות טריות ופרפורמלדהיד בהתאמה ב- NTS של העכבר. צנרת של תהליכי עיבוד הרקמות, FISH ו-IHC המתוארים בשיטות מוצגת באיור 1 ובאיור 2. טבלה 1 מספקת סיכום של בדיקת FISH ושילובי נוגדנים המשמשים בכל איור.
בדיקות בקרה נבדקות באופן שגרתי במקביל לבדיקת המטרה, כדי להבטיח את שלמות זרימת העבודה ולאשר את איכות הדגימ...

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

פרוטוקול זה משלב RNAscope פלואורסצנטי בהכלאה באתרו ואימונוהיסטוכימיה באמצעות תכשירים טריים מוקפאים או קבועים במוח. טכניקה זו מאפשרת גמישות על ידי הדגמת שילוב של הכלאה רגישה מאוד באתרו ושיטות אימונוהיסטוכימיה להדמיה מרחבית של מטרות RNA וחלבון באותה דגימת רקמה. שיטה זו ישימה לתיוג מולטיפלקס בחתך רקמת המוח, ומסייעת לחקור ארגון מרחבי ומשמעות תפקודית של mRNA וחלבונים בתוך אוכלוסיות נוירונים הטרוגניות במדעי המוח.פרוטוקול זה מתמקד בעיקר בשלבי עיבוד עבור רקמה קפואה טרייה ורקמה קבועה פרפורמלדהיד. כדי להתחיל לחתוך את רקמת המוח הטרייה-קפואה, הצמידו אותה לצ'אק הקריוסטט המצונן מראש וחתכו קטעי קורונל בעובי 14 מיקרומטר. הרכיבו את הקטע על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית טעונה.העבר את השקופית הטעונה לתוך תיבת שקופיות. לאחר מכן מעבירים את הקופסה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש. עבור קיבוע רקמות, לסנן את הפתרון paraformaldehyde מוכן.מצננים ל-4 מעלות. הביאו את המגלשה המותקנת מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח יבש ומיד טבלו אותה בתמיסת הפרפורמלדהיד המצוננת מראש למשך 15 דקות, בצעו התייבשות של רקמה טרייה-קפואה כדי להבטיח שמגלשת הזכוכית יבשה לחלוטין. לאחר הסרת המוח מתושבת קבועה של שפע טרנסקרדילי, באמצעות מיקרוטום רוטט, חתכו קטעי רקמה בעובי 30 מיקרומטר.אחסן את החלקים החתוכים בתמיסת הגנה קריופרוטקטיבית. ביום בדיקת FISH, העבירו את החלק הצף החופשי לצלחת תרבית תאים בת 12 בארות המכילה PBS טוחנת 0.1 ועוררו אותה במהירות 90 עד 100 סל"ד על שייקר פלטפורמה מסתובב כדי לשטוף את ההגנה הקריואקטיבית. לאחר מכן, באמצעות מברשת צבע, הרכיבו את החלק שטוח על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית כדי למנוע ניתוק במהלך הכביסה, וייבשו באוויר למשך שעתיים לפחות.באמצעות עט מחסום הידרופובי, צייר מחסום הידרופובי סביב החלק כדי להכיל את ריאגנטים FISH. לאחר עיבוד מקדים, הרקמה מודגרת בתמיסת פרוטאז ועוברת הכלאה עם בדיקות RNAscope למשך שעתיים בהתאם להנחיות היצרן. לאחר מכן, שלבי הגברה רציפים ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית מבוצעים.התחילו בהכנת תא מוגן אור לח לדגירת שקופיות. באמבט מים, יש לחמם את חיץ הכביסה 50X ולבדוק ל-40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, הכינו ליטר אחד של חיץ כביסה 1X מריכוז המלאי של 50X.הכינו את תערובת הגשושית כמתואר בכתב היד של הטקסט. לטיפול בפרוטאינאז, יש להוסיף פרוטאינאז 3 לאזור הרקמה ולדגור עליו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. כדי לשטוף את הפרוטאינאז, טבלו בעדינות את המגלשה ב-PBS טוחנת 0.1 בטמפרטורת החדר, והימנעו מניתוק חלקים.עבור הכלאה, להוסיף את תערובת הבדיקה על החלק הרקמתי. הניחו אותו בתא לח שחומם מראש. ואז לדגור אותו במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.שטפו את מקטע הרקמה עם חיץ השטיפה פעמיים במשך שתי דקות. להגברת אותות, באמצעות בקבוק טפטפת, הוסף תמיסת הגברה לכיסוי קטע הרקמה והדגירה כמתואר בטקסט. הוסיפו את התמיסה החוסמת לאזור הרקמה ודגרו במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית.החלק את השקופית כדי להסיר את מאגר החסימה העודף לאחר הדגירה. עכשיו, לדגור את החלק עם נוגדנים ראשוניים לילה ב 4 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את המגלשה שלוש פעמים עם 1X TBS.מוסיפים את הנוגדן המשני ודגרים על המקטעים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. בחן את השקופית תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמה. רכוש תמונות מייצגות בהגדלה של פי 20 ושמור אותן כקבצי TIF.במחקר הנוכחי, איכות הרקמה, שלמותה והיעדר זיהום חיידקי אושרו על ידי היעדר תיוג DAPI. תיוג מבדיקות בקרה חיוביות המכוונות ליוביקוויטין C, פפטידילפרוליל איזומראז B ו-RNA פולימראז IIA mRNA אישר את שלמות ה-RNA. בתכשירים טריים מוקפאים כדי להבחין בין נוירונים חיוביים ל-GalR1 mRNA בתוך ה-NTS, נעשה שימוש בסמנים נוירוכימיים נוספים.הטרנספורטר השלפוחית הקשור לקרום היה מסומן בבירור. לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים כגון טירוזין הידרוקסילאז ו-GFP המבוטאים תחת הבקרה של מקדם PHOX2B נצפו באופן קלוש ותוארו כפלוקולנטים מכיוון שהם חסרים מתאר ברור. תיוג בדיקת GalR1 FISH של mRNA ציטופלזמי GalR1 היה מנוקב ונצפה בבירור.כדי לאשר שאיכות האימונוהיסטוכימיה תלויה בלוקליזציה תת-תאית של חלבונים, חלבונים גרעיניים וציטופלזמיים שונים סומנו במקביל ל-FISH באותם חלקי רקמה. הציטופלזמי PHOX2B GFP היה בעל מראה פלוקולנטי. בעוד שהאות הגרעיני של חלבון PHOX2B היה ברור, מה שאישר תיוג חיסוני באיכות גבוהה יותר בשילוב עם FISH.כאשר בוצע על מקטעים קפואים קבועים בשילוב עם FISH, אימונוהיסטוכימיה הייתה אמינה ללא קשר ללוקליזציה תת-תאית. תאי עצב חיוביים ל-GlyT2 mRNA היו ממוקמים בגחון ל-NTS ולא בתוך ה-NTS. נוירונים מסוג GlyT2 mRNA חיובי ו-PHOX2B mRNA חיובי לא עברו לוקליזציה.תת-אוכלוסייה של נוירוני NTS חיוביים ל-PHOX2B mRNA הייתה טירוזין הידרוקסילאז אימונוריאקטיבי, ואף אחד מהם לא הכיל GlyT2 mRNA. RNAscope מאפשר הדמיה וניתוח של התפלגות RNA ברזולוציה של מולקולה בודדת בתאים וברקמות. הוא מעצים מחקר במינים חדשים של רנ"א, מנגנוני מחלות, דפוסי ביטוי גנים, מגוון נוירונים ואינטראקציות תאיות.

combining-multiplex-fluorescence-situ-hybridization-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

פעמיים פלואורסצנטי באתרו הכלאה בסעיפים המוח טריים

שילוב של טכניקות שונות על מנת למקסם את איסוף הנתונים מרקמות העכבר מוצג.

שילוב של צבע lipophilic, באתרו</emהכלאה>, אימונוהיסטוכימיה ו היסטולוגיה

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

מקור: Baleriola, J., et. al., זיהוי mRNAs מקומיים אקסונליים בחלקי מוח באמצעות הכלאה ברזולוציה גבוהה באתר.  J. Vis. Exp. (2015)סרטון זה מדגים את זיהוי ה-mRNA בתוך אקסונים כולינרגיים בפרוסות היפוקמפוס קבועות של עכבר באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרה וצביעת נוגדנים. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חושפת את הלוקליזציה המרחבית של mRNAs מתויגים בבדיקה וכולין אצטילטרנספראז בנוירונים כולינרגיים.

צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

פרוטוקול זה מתאר את תהליך העבודה צעד אחר צעד עבור אימונוofluoroocoooooooiood של IBA1 ו TMEM119, בנוסף ניתוח של צפיפות microglial, הפצה, מורפולוגיה, כמו גם חדירת תאים מיאלואידית היקפית ברקמת המוח העכבר.

Immunofluorescence צביעת באמצעות IBA1 ו TMEM119 עבור צפיפות Microglial, מורפולוגיה וניתוח הסתננות מיאלואידית תא היקפית במוח העכבר

אנו מתארים שיטת הצביעה מהירה לביצוע הדמיה רב ספקטראלית על רקמות קפואות.

שיטה מהירה לדימות מרובה ספקטרלי של רקמות קפואות

טכניקת הציפה החופשית מאפשרת לחוקרים לבצע צביעות היסטולוגיות, כולל אימונוהיסטוכימיה על חלקי רקמות קבועים כדי להמחיש מבנים ביולוגיים, סוג התא וביטוי ולוקליזציה של חלבונים. זוהי טכניקה היסטוכימית יעילה ואמינה שיכולה להיות שימושית לחקר מספר רב של רקמות, כגון מוח, לב וכבד.

כתמים היסטולוגיים באמצעות קטעי רקמה צפים חופשיים

פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.

חיסון חופשי של מוחות עכבר

למדו שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית בחלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים. שיטה זו מאפשרת הדמיית RNA וחלבונים יחד לחקירת אוכלוסיות נוירונליות במוח.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

גלה סרטונים נוספים