Name: טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: למד טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA לזיהוי רשתות רגולטוריות תלויות sRNA בחיידקים גראם חיוביים. שיטה זו מאפשרת הבנת גורמי וירולנטיות ושרידות בחיידקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי "סוכנות לאומית דה לה Recherche" (ANR, גרנט ANR-16-CE11-0007-01, ריבוסטף, ו ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, ליחסי ציבור). הוא פורסם גם במסגרת labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 ושל ANR-17-EURE-0023 (ליחסי ציבור), כמימון מהמדינה המנוהלת על ידי ANR כחלק מההשקעות בתוכנית העתידית. DL נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מס' 753137-SaRNAReg. העבודה במעבדת E. Massé נתמכה על ידי מענקי הפעלה של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), והמכונים הלאומיים לבריאות NIH צוות גרנט R01 GM092830-06A1.

<ol><li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs%3A+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li>
<li>Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li>
<li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li>
<li>Adams, P. P., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+small+base-pairing+RNAs+derived+from+diverse+genomic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524(2020).</li>
<li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+bacterial+small+RNA+target+prediction+programs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of bacterial small RNA target prediction programs.</a> RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).</li>
<li>Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigation+through+the+twists+and+turns+of+RNA+sequencing+technologies%3A+Application+to+bacterial+regulatory+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Gene+Regulatory+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506(2020).</li>
<li>Wright, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CopraRNA+and+IntaRNA%3A+predicting+small+RNA+targets%2C+networks+and+interaction+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains.</a> Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).</li>
<li>Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+new+RNA+classes+and+global+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins.</a> Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).</li>
<li>Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+RNA-seq+approaches+for+the+study+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens.</a> Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).</li>
<li>Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li>
<li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li>
<li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li>
<li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li>
<li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li>
<li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10(2007).</li>
<li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone%2C+Hfq%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li>
<li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProQ%2FFinO-domain+proteins%3A+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3%27+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li>
<li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li>
<li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li>
<li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+%28MAPS%29+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Data%22%5BJournal%5D)">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li>
<li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA%3A+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li>
<li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li>
<li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li>
<li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li>
<li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li>
<li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li>
<li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li>
<li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li>
<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Reseaerch%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li>
<li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li>
<li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IntaRNA+2.0%3A+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li>
<li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+cooperation%3A+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול שונה עבור חיידקים גראם חיובי הפרוטוקול הראשוני של MAPS פותח כדי לחקור אינטראקציה sRNA באורגניזם המודל E. coli20,30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה אשר מתאים לאפיון של רשתות רגולטוריות תלויות sRNA בפתוגן האנושי האופורטוניסטי S. aureus והוא בהחלט משתנה לחיידקים גראם חיוביים אחרים, פתוגניים או לא.
תשומת לב מיוחדת הוקדשה לשלב התמוגה של התא. העיתונות הצרפתית הוחלפה בכלי תמוגה מכני לתאים. שיטה זו...

מאות, אולי אפילו אלפי RNAs רגולטוריים קטנים (sRNAs) זוהו ברוב הגנומים החיידקיים, אך הפונקציות של רובם המכריע נותרו לא אופייניות. בסך הכל, sRNAs הם מולקולות קצרות ללא קידוד, ממלא תפקידים מרכזיים בפיזיולוגיה חיידקית והסתגלות לסביבותמשתנות 1,2,3. אכן, מקרומולקולות אלה נמצאות במרכזן של רשתות רגולטוריות מורכבות רבות, המשפיעות על מסלולים מטבוליים, תגובות מתח אך גם ארסיות ועמידות לאנטיביוטיקה. מבחינה הגיונית, הסינתזה שלהם מופעלת על ידי גירויים סביבתיים ספציפיים (למשל, רעב לחומרים מזינים, לחצים חמצוניים או קרום). רוב sRNAs לווסת mRNAs יעד מרובים ברמה שלאחר שעתוק באמצעות זיווג בסיס קצר ולא רציף. הם בדרך כלל למנוע ייזום תרגום על ידי מתחרה עם ריבוזומים עבור אזורי ייזום תרגום4. היווצרות של sRNA:mRNA דופלקסים גם לעתים קרובות תוצאות השפלה פעילה של mRNA היעד על ידי גיוס של RNases ספציפיים.
האפיון של יעד sRNA (כלומר, כל הסט של RNAs היעד שלה) מאפשר זיהוי של המסלולים המטבוליים שבהם הוא מתערב ואת האות הפוטנציאלי שהוא עונה. כתוצאה מכך, הפונקציות של sRNA מסוים בדרך כלל ניתן להסיק מן היעד שלה. לשםכךפותחו מספר כלי חיזוי סיליקו כגון IntaRNA ו- CopraRNA 5,6,7. הם מסתמכים בעיקר על השלמות רצף, זיווג אנרגיה ונגישות של אתר האינטראקציה הפוטנציאלי כדי לקבוע שותפי sRNA putative. עם זאת, אלגוריתמי חיזוי אינם משלבים את כל הגורמים המשפיעים על זיווג בסיס ב vivo כגון מעורבות של מלווים RNA8 לטובת אינטראקציות תת אופטימליות או ביטוי משותף של שני בני הזוג. בשל המגבלות הטבועות בהם, שיעור החיזוי החיובי הכוזב נותר גבוה. רוב הגישות הניסיוניות בקנה מידה גדול מבוססות על טיהור משותף של זוגות sRNA:mRNA אינטראקציה עם חלבון מחייב RNA מתויג (RBP)6,9. לדוגמה, שיטת האינטראקציה RNA על ידי קשירה ורצף (RIL-seq) זיהתה דופלקסים RNA מטוהרים במשותף עם מלווים RNA כגון Hfq ו ProQ ב Escherichia coli10,11. טכנולוגיה דומה הנקראת UV-Crosslinking, קשירה ורצף של כלאיים (CLASH) הוחלה על RNase E- ו- Hfq הקשורים sRNAs ב E. coli12,13. למרות התפקידים המתוארים היטב של Hfq ו- ProQ ברגולציה בתיווך sRNA בחיידקים מרובים8,14,15, רגולציה מבוססת sRNA נראה RNA מלווה עצמאי בכמה אורגניזמים כמו S. aureus16,17,18. גם אם הטיהור של דופלקסים RNA בשיתוף עם RNases הוא ריאלי כפי שהוכח על ידי ווטרס ועמיתים לעבודה13, זה נשאר מסובך כמו RNases לעורר השפלה מהירה שלהם. לפיכך, טיהור MS2-Affinity בשילוב עם רצף RNA (MAPS)גישה 19,20 מהווה חלופה מוצקה אורגניזמים כאלה.
שלא כמו שיטות שהוזכרו לעיל, MAPS משתמש sRNA ספציפי כפיתיון כדי ללכוד את כל RNAs אינטראקציה ולכן אינו מסתמך על מעורבות של RBP. התהליך כולו מתואר באיור 1. בקצרה, sRNA מתויג ב 5 'עם MS2 RNA aptamer כי הוא מוכר במיוחד על ידי חלבון מעיל MS2. חלבון זה הוא התמזגו עם חלבון מחייב מלטוז (MBP) להיות משותק על שף amylose. לכן, MS2-sRNA ושותפיו RNA נשמרים בעמודה כרומטוגרפיה זיקה. לאחר התרוממות רוח עם RNAs מלטוזיים ומטוהרים מזוהים באמצעות רצף RNA בעל תפוקה גבוהה ואחריו ניתוח ביואינפורמטי (איור 2). טכנולוגיית MAPS מציירת בסופו של דבר מפה של כל האינטראקציות הפוטנציאליות המתרחשות ב- vivo.
טכנולוגיית MAPS יושמה במקור בחיידק הגרם-שלילי הלא פתוגניים E. coli21. למרבה הפלא, MAPS סייעה לזהות שבר שמקורו ב-tRNA במיוחד באינטראקציה עם RyhB ו-RybB sRNAs ולמנוע רעש שעתוק של sRNA כדי לווסת מטרות mRNA בתנאים שאינם מעוררים. לאחר מכן, MAPS הוחל בהצלחה על SRNAs אחרים E. coli כמו DsrA22, RprA23, CyaR23 ו GcvB24 (טבלה 1). בנוסף לאישור מטרות ידועות בעבר, MAPS הרחיבה את היעד של sRNAs ידועים אלה. לאחרונה, MAPS בוצע סלמונלה Typhimurium וחשף כי SRNA SraL נקשר rho mRNA, קידוד עבור גורם סיום שעתוק25. באמצעות זיווג זה, SraL מגן rho mRNA מפני סיום שעתוק מוקדם מופעלות על ידי רו עצמה. מעניין, טכנולוגיה זו אינה מוגבלת sRNAs והוא יכול להיות מיושם על כל סוג של RNAs הסלולר כפי שהודגם על ידי שימוש שבר נגזר tRNA26 ואזור 5'-untranslated של mRNA22 (טבלה 1).
שיטת MAPS הותאמה גם לחיידק גרם חיובי פתוגניים S. aureus19. באופן ספציפי, פרוטוקול התמוגה שונה באופן נרחב כדי לשבור תאים ביעילות עקב דופן תאים עבה יותר מאשר חיידקים גראם שליליים ולשמור על שלמות RNA. פרוטוקול מותאם זה כבר חשף את האינטראקציה של RsaA27, RsaI28 ו RsaC29. גישה זו נתנה תובנות על התפקיד המכריע של sRNAs אלה במנגנונים רגולטוריים של תכונות פני התא, ספיגת גלוקוז, ותגובות מתח חמצוני.
הפרוטוקול שפותח ומיושם ב- E. coli בשנת 2015 תואר לאחרונה בפירוט רב30. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול MAPS שונה, אשר מתאים במיוחד לחקר רשתות רגולטוריות sRNA בחיידקים גראם חיובי (קיר תא עבה) אם לא פתוגניים או פתוגניים (אמצעי זהירות).

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה</td><td>Starstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>2100 מכשיר ביואנלייזר</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>RNA כמות ואיכות</td></tr><tr><td>בקבוק תרבית 250 מ"ל</td><td>דומיניק דוטשר</td><td>2515074</td><td>חיידקי תרביות</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>פלקון</td><td>352051</td><td>צנטריפוגה תרבית</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>VWR כימיקלים</td><td>20821.321</td><td>מיצוי וטיהור RNA</td></tr><tr><td>אלגרה X-12R צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td>גלולה חיידקית</td></tr><tr><td>אמפיצילין (אמפר)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A9518-5G</td><td>מדיום גידול</td></tr><tr><td>שרף עמילוז</td><td>חדש אנגליה BioLabs</td><td>E8021S</td><td>MS2-affinity טיהור</td></tr><tr><td>אנטי דיוקסיגנין AP שבר Fab</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11093274910</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>קלטת אוטוררדיוגרפיה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50-212-726</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0051</td><td>מרק</td></tr> <tr><td></td><td>בניית פלסמיד BHI (עירוי לב מוח)סיגמא-אולדריץ'</td><td>53286</td><td>מדיום גידול</td></tr><tr><td>מגיב חוסם</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>11096176001</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>CDP-Star</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11759051001</td><td>מבחני כתם צפוני (מצע)</td></tr> <tr><td>צנטריפוגה 5415 R</td><td>מיצוי וטיהור RNA</td><td>של אפנדורף</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>דומיניק דוטשר</td><td>508320-CER</td><td>מיצוי RNA ו טיהור</td></tr><tr><td>DIG-RNA תערובת תיוג</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11277073910</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>טיפול DNase</td></tr><tr><td>אריתרומיצין (ery)</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>פלוקה 45673</td><td>מדיום גידול</td></tr><tr><td>מכשיר FastPrep MP</td><td>ביומדיקל</td><td>116004500</td><td>ליזה מכנית</td></tr><tr><td>גואנידיום תיוציאנט</td><td>מבחני כתם צפוני Sigma-Aldrich</td><td>G9277-250G</td><td></td></tr><tr><td>היברידיזציה Hoven Hybrigene</td><td>Techne</td><td>FHB4DD</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>צינורות הכלאה</td><td>Techne</td><td>FHB16</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>אלכוהול איזואמיל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A/6960/08</td><td>מיצוי וטיהור RNA</td></tr><tr><td>LB (מרק ליזוגני)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L3022</td><td>מדיום גידול</td></tr><tr><td>Lysing Matrix B בתפזורת</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540-428</td><td>ליזה מכנית</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporator</td><td>BioRad</td><td>1652100</td><td>בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>מכשיר מים Milli-Q</td><td>Millipore</td><td>Z00QSV0WW</td> מים <td>טהורים</td></tr><tr><td>במיוחד ספקטרופוטומטר</td><td>NanoDrop ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>RNA/DNA כמות ואיכות</td></tr><tr><td>קרום ניטרוצלולוז</td><td>דומיניק דוטשר</td><td>10600002</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>Phembact Neutre</td><td>PHEM Technologies</td><td>BAC03-5-11205</td><td>ניקוי וטיהור</td></tr><tr><td>פנול</td><td>קארל רוט</td><td>38.2</td><td>מיצוי וטיהור RNA</td></tr><tr><td>Phusion DNA פולימראז בנאמנות גבוהה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0530</td><td>בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>pMBP-MS2</td><td>Addgene</td><td>65104</td><td>MS2-MBP ייצור</td></tr><tr><td>פולי-פרפ כרומטוגרפיה עמודה</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>MS2-affinity purification</td></tr><tr><td>PstI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ER0615</td><td>בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>Qubit 3 פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>15387293</td><td>כמות RNA</td></tr><tr><td>RNAPro Solution</td><td>MP Biomedicals</td><td>6055050</td><td>ליזה מכנית</td></tr><tr><td>ScriptSeq ערכה מלאה</td><td>Illumina</td><td>BB1224</td><td>הכנת ספריות cDNA</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Genesys 20</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11972278</td><td>תרביות חיידקים</td></tr><tr><td>SpeedVac Savant מכשיר ואקום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>DNA120</td><td>מיצוי וטיהור RNA</td></tr><tr><td>Stratalinker UV Crosslinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400672</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0014</td><td>בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>TBE (Tris-Borate-EDTA)</td> <td>Euromedex</td><td>ET020-C</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>ThermalCycler T100</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>בניית פלסמיד</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-100ML</td><td>בדיקות כתם צפוני</td></tr><tr><td>מעבד סרט רנטגן</td><td>hu.q</td><td>HQ-350XT</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr><tr><td>סרטי רנטגן Super RX-N</td><td>FujiFilm</td><td>4741019318</td><td>מבחני כתם צפוני</td></tr></tbody></table>

טיהור ms2-זיקה בשילוב עם רצף rna בחיידקים גראם חיוביים

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

למרות RNAs רגולטוריים קטנים (sRNAs) נפוצים בקרב התחום החיידקי של החיים, הפונקציות של רבים מהם נשארים מאופיינים בצורה גרועה בעיקר בשל הקושי לזהות את מטרות mRNA שלהם. כאן, תיארנו פרוטוקול שונה של טיהור MS2-Affinity יחד עם טכנולוגיית רצף RNA (MAPS), במטרה לחשוף את כל שותפי ה- RNA של sRNA ספציפי ב- vivo. באופן כללי, APTAMER MS2 הוא התמזגו הקיצוניות 5 'של sRNA של עניין. מבנה זה בא לידי ביטוי לאחר מכן vivo, המאפשר MS2-sRNA לקיים אינטראקציה עם השותפים הסלולריים שלה. לאחר קצירת חיידקים, התאים הם lysed מכנית. התמצית הגולמית נטענת לתוך עמוד כרומטוגרפיה המבוסס על אמילוס, שהיה מצופה בעבר בחלבון MS2 המותך לחלבון הכריכה המלטוזי. פעולה זו מאפשרת לכידה ספציפית של MS2-sRNA ו- RNAs אינטראקציה. לאחר התרוממות רוח, RNAs מטוהרים מזוהים על ידי רצף RNA בעל תפוקה גבוהה וניתוח ביואינפורמטי עוקב. הפרוטוקול הבא יושם בפתוגן האנושי גראם חיובי סטפילוקוקוס aureus והוא, באופן עקרוני, transposable לכל חיידקים גראם חיובי. לסיכום, טכנולוגיית MAPS מהווה שיטה יעילה לחקור לעומק את הרשת הרגולטורית של sRNA מסוים, ומציעה תמונת מצב של כל היעד שלה. עם זאת, חשוב לזכור כי מטרות putative שזוהו על ידי MAPS עדיין צריך להיות מאומת על ידי גישות ניסיוניות משלימות.

התוצאות הייצוגיות מקורן במחקר של יעד RsaC ב S. aureus29. RsaC הוא SRNA לא קונבנציונלי באורך 1,116 nt. הקצה של 5' מכיל מספר אזורים חוזרים ונשנים בעוד הקצה 3 ' שלה (544 nt) הוא עצמאי מבחינה מבנית ומכיל את כל אתרי האינטראקציה החזויים עם מטרות mRNA שלה. הביטוי של sRNA זה הוא המושרה כאשר מנגן (Mn) הוא נדיר, אשר נתקל לעתים קרובות בהקשר של התגובה החיסונית המארחת. באמצעות טכנולוגיית MAPS, זיהינו מספר mRNAs אינטראקציה ישירה עם RsaC, חושף את תפקידה המכריע בלחץ חמצוני (sodA, ldh1 ו...

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

MS2-זיקה טיהור בשילוב עם רצף RNA או MAPS פותחה כדי לזהות את היעד כולו של כל RNA של עניין בחיידקים. טכנולוגיה זו מאפשרת לזהות כל סוג של שותפי sRNA ללא תלות במנגנון הרגולציה. האפיון של רשתות רגולטוריות תלויות sRNA יעזור להבין גורמי ארסיות טובים יותר ייצור, היווצרות ביופילם, והישרדות של החיידקים בתוך התאים המארחים, ובסופו של דבר להילחם נגד זיהומים staphylococcal.פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל חיידקים פתוגניים או לא פתוגניים גרם חיובי. מי שתדגים את ההליך תהיה נעמי מרסייה, דוקטורנטית מהמעבדה של ד"ר פסקל רומבי. כדי להתחיל, לגדל מושבה אחת של זנים הנושאים גם pCN51 P3 MS2 sRNA או pCN51 P3 MS2 פלסמידים בשלושה מיליליטר של בינוני BHI בתוספת 10 מיקרוגרם לכל אריתרומיצין מיקרוליטר בכפילויות.לדלל כל תרבות לילה ב 50 מיליליטר של בינוני BHI טרי בתוספת אריתרומיצין להגיע OD 600 של 0.05. לגדל את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 180 סל"ד במשך שש שעות. להעביר כל תרבות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר וצנטריפוגה הצינורות ב 2, 900 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז להשליך את supernatant, להקפיא ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס או לשמור את כדורי על הקרח ישירות לבצע תמוגה תא מכני.כדי לבצע תמוגה תא מכני, resuspend כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ A ולהעביר את התאים לשימוש חוזר ל 15 מיליליטר צנטריפוגות צינורות עם 3.5 גרם של חרוזי סיליקה. הכנס את הצינורות למכשיר תמוגה תא מכני ולהפעיל מחזור של 40 שניות בארבעה מטרים לשנייה. צנטריפוגה הצינורות ב 2, 900 פעמים G במשך 15 דקות, ואז לשחזר את supernatant ולשמור אותו על הקרח.ודא כי supernatant ברור, חוזר על הצנטריפוגה אם זה לא. הסר את קצה העמודה ולאחר מכן הצב עמודת כרומטוגרפיה בארון תקשורת של עמודים ושטוף את העמוד במים דקים במיוחד. הוסף 300 מיקרוליטרים של שרף amylose ולשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של מאגר A.Dilute 1, 200 picamoles של חלבון MBP-MS2 בשישה מיליליטר של חיץ A ולטעון אותו לתוך העמודה.לשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של חיץ A.Next, לבצע טיהור MS2-זיקה. לטעון את התא lysate לתוך העמודה ולאסוף את השבר זרימה דרך בצינור אוסף נקי. לשטוף את הטור שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חוצץ A ולאסוף את שבר לשטוף, ואז elute את העמודה עם מיליליטר אחד של חיץ E ולאסוף את שבר elution ב microtube שני מיליליטר.שמור את כל השברים שנאספו על קרח עד מיצוי RNA. השתמש מיליליטר אחד של כל שבר עבור מיצוי RNA. מוסיפים נפח אחד של פנול ל- RNA ומערבבים במרץ, ואז צנטריפוגה התערובת ב 16, 000 פעמים G במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.העבר את השלב העליון למיקרו-צינור נקי של שני מיליליטר. הוסף נפח אחד של אלכוהול איזואמיל כלורופורם ולחזור על הצנטריפוגה, ולאחר מכן להעביר את השלב העליון לצינור חדש. הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול קר ונפח 0.1 של שלושה נתרן אצטט טוחן ב- pH 5.2 ומזרז לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס.למחרת, צנטריפוגה הצינורות במשך 15 דקות ב 16, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאט להסיר את האתנול עם פיפטה, מקפיד לא להפריע גלולה. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של 80% אתנול קר וצנטריפוגה לחמש דקות.להשליך את האתנול על ידי pipetting אותו לאט, ואז לייבש את גלולה באמצעות רכז ואקום במשך חמש דקות במצב ריצה. Resuspend גלולה בנפח המתאים של מים אולטרה-דקים. פרוטוקול זה שימש כדי ללמוד את היעד RsaC בS.aureus.מספר mRNAs אינטראקציה ישירה עם RsaC זוהו באמצעות טכנולוגיית MAPS, חושף את תפקידה המכריע מתח חמצוני ותגובות הקשורות מתכת. כדי לאשר את מבנה ה-MS2 sRNA ולהמחיש את דפוס הביטוי שלהם, תאים נקצרו לאחר שעתיים, ארבע ושש שעות של צמיחה במדיום BHI. RNA חולץ וניתוח כתם צפון בוצע באמצעות בדיקה DIG ספציפי RsaC.רמת RsaC אנדוגני גדל באופן משמעותי לאחר שש שעות של צמיחה. חשוב לציין, רמת MS2-RsaC 544 ו MS2-RsaC 1, 116 היו דומים RsaC אנדוגני בשש שעות. טיהור זיקה בוצע RNAs חולצו מן התמצית הגולמית, זרימה דרך, שברי elution בזן סוג פראי המבטא את תג MS2 לבד ואת זן RsaC מוטציה המבטא את MS2-RsaC 544 לבנות.1, 116 nucleotide ארוך endogenous RsaC הועשר בשבר elution, אבל אינטראקציה לא במיוחד עם עמודת הזיקה בשל אורכו ומבנה משני מורכב. MS2-RsaC 544 היה מועשר מאוד בשבר elution המוכיח כי הוא נשמר בהצלחה על ידי חלבון היתוך MS2-MBP. ניתוח ביואינפורמטי חשף מטרות mRNA putative על פי שינוי הקיפול בין MS2 sRNA ו MS2 שליטה, המציין כי SODA היה היעד putative הראשון.ניתוח כתם צפוני ביצע בדיקה DIG ספציפית לסודה לאחר טיהור MS2-זיקה מראה כי SODA היה מועשר ביעילות עם MS2-RsaC 544 בהשוואה לבקרת MS2. בעת ניסיון לפרוטוקול זה, זכור שהתוספת של תג MS2 יכולה להשפיע על אישור, יציבות או פונקציה של sRNA. זה צריך להיות במעקב קפדני.MAPS מספק תמונת מצב של זיווג מטרות sRNA-RNA. אימות ניסיוני נוסף יחשוף את תפקידם. טכניקה זו מייצגת כלי רב עוצמה לבניית רשתות רגולטוריות sRNA בכל חיידק.

ms2-affinity-purification-coupled-with-rna-sequencing-gram-positive

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

זמן ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה של טיסה (MALDI-TOF MS) וטכניקות מולקולריות (ריצוף גנים 16S rRNA) מאפשרות זיהוי של פתוגנים חיידקיים נדירים באבחון שגרתי. מטרת פרוטוקול זה טמונה בשילוב של שתי הטכניקות מה שמוביל לנתונים מדויקים ואמינים יותר.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

ALIBi (ALIBi) היא שיטה חדשה שמופעלת אופטוגנטית שפותחה לתיוג וטיהור אוכלוסיות תת-תאיות של ריבוזומים לצורך ריצוף וניתוח פרוטאומי במורד הזרם וניתוח פרוטאומי.

בידוד תת-אוכלוסיות ריבוזום תת-תאיות בהתבסס על ביוטינילציה מוגברת במיקום ספציפי לתג פפטיד רקומביננטי - תאורה מוגבלת -

למד טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA לזיהוי רשתות רגולטוריות תלויות sRNA בחיידקים גראם חיוביים. שיטה זו מאפשרת הבנת גורמי וירולנטיות ושרידות בחיידקים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

גלה סרטונים נוספים