יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Microenvironment לאפשר מורכב מאוד דינמי כולל ציטוקינים המשתנים ללא הרף, ריכוז רצועות והרכב. כדי ליצור סביבת תרבות דומה חיונית למחקרים במבחנה על מכונות חיים מורכבות כגון בידול תאי גזע, תגובות חיסוניות ופיתוח איברים בפלטפורמות שבבים. אבל כדי ליצור ולספק אותות כימיים של נפח nanoliter ודיוק אלפיות שנייה קשה באמצעות גישות ביו-רפואיות קונבנציונליות כמו pipetting.

כדי לעמוד באתגרים, פלטפורמת תרבות המסוגלת ליצור יצירת תמונה חלופית של תשומות איתות קומבינטוריות ורציף דינמיות היא לפי דרישה גבוהה. בפרוטוקול זה מוצג הליך התכנון וההמצאה של מכשיר מיקרופלואידי. השבב המיקרופלואידי המוצע מורכב מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר.

אנו מראים כי הפלטפורמה מתאימה למחקרים על תאים בודדים אוכלוסיות תאים דו מימדיות וספירות עצביות תלת מימדיות. לתנאים הסביבתיים המורכבים והדינמיים על השבב יש השפעות רבות על בידול תאי גזע עצביים ועל ההתחדשות העצמית. הפרטים של הליכי עיצוב והפיה הם כדלקמן.

תכנון השבב בוצע באמצעות תוכנת AutoCAD. כדי להתאים לגודל של מחזיק הצלחת במיקרוסקופ, השבב המיקרופלואידי הוא בערך שבעה על חמישה סנטימטרים בגודל והוא מורכב 1, 500 תאי תרבות. אחת התכונות החשובות היא שיש לו משאבה פריסטלית המורכבת משמונה ערוצי זרימה ו-200 ערוצי בקרה רחבים מיקרומטר.

הגידול באזור החופף בין שליטה לערוץ הזרימה גדל פי 16 בהשוואה למשאבה פריסטלית, שהוצעה על ידי סטיבן רעידת אדמה בשנת 2002, לכ -15 ננו-ליטרים נוזליים לכל מחזור שאיבה ולהספיק לצרכים לשמור על 1, 500 תנאי סביבה עצמאיים במקביל על שבב. חלק חשוב נוסף של המכשיר הוא תא תרבות דו שכבתי, אשר יכול לשמור על סביבת תרבות ללא גזירה. מתח הגזירה הלא רצוי נמנע על ידי הפנייתו במהירות דרך השכבה העליונה.

התאים, הרקמות והבינון המותנה החיוני נשארים ללא שינוי בשכבה התחתונה. סימולציה מספרית מצביעה על כך שכאשר הנוזלים מופנים דרך תאי תרבות, משמאל לימין. ניתן למנוע ביעילות את כוחות הגזירה.

אפילו בקצב זרימת קלט של 10 מילימטר לתא שני או לרקמה בגודל מיקרומטר נשארים ללא הפרעה בתחתית יחידת התרבות. אנחנו מפוברק דפוס העתק או רקיק סיליקון באמצעות ליתוגרפיה UV. הערוצים הנוזליים של 25 מיקרומטר בגובה ו-100 מיקרומטרים במשקל מיוצרים באמצעות פוטורסיסט שלילי SU-8 3025.

תאי התרבות של 75 מיקרומטר ו-150 מיקרומטרים בגובה היו מפוברקים באמצעות צילום SU-8 3075. AZ50X פוטורסיסט חיובי משמש עבור תכונות באר בצורת עגול אשר חופפים עם ערוצי הבקרה כדי להבטיח חיבור טוב. כדי לייצר את השבב microfludic, רקיקים סיליקון בדוגמת ריק טופלו תחילה עם TMCS.

כמויות שונות של PDMS 10 עד 1 של יחס מונומר כדי זרז היה מעורב ביסודיות debubbled במשך שנה עד שעתיים בתא ואקום במינוס 0.85 מגה פסקל. שכבת הבקרה הושגה על ידי ספין ציפוי PDMS ב 2, 200 סל"ד. לאחר מכן הועברו ופלים הסיליקון לאינקובטור והדגירה במשך 60 דקות ב 80 centigrade.

שכבות שונות היו מיושרות ומלוכדות יחד באמצעות מכשיר אופטי מותאם אישית ומכונת תחריט פלזמה. חורי הכניסה היו אז אגרוף לאחר עוד שעתיים מליטה תרמית ב 80 צלזיוס. השבב היה מחובר לתלוש כיסוי מצופה PDMS, שהוא באותו גודל של צלחת 96-באר ונרפא לפחות 12 שעות ב 80 centrigrade לפני השימוש.

לצורך הפעולה, ערוצי בקרה היו מחוברים שסתומים סולנואידים פנאומטיים זעירים באמצעות צינורות פלסטיק. הפיכת כל בארות פנומטי נשלטו על ידי תוכנית MATLAB מותאמת אישית באמצעות ממשק המשתמש הגרפי. לחצי סגירה אופטימליים של שסתומי קרום PDMS שכיבות סמיכה נקבעו בנפרד עבור כל שבב, אשר בדרך כלל נע בין 25 ל 30 PSI.

על ידי הפיכת כל הסדרות של בארות באופן דינמי קומבינטורית ותשומות רציפות ניתן ליצור על שבב. תאים נקצרו ב 80%confluency ו resuspended עם DMEM בינוני תרבות בצפיפות על 10 כוח שש למיליליטר, אשר לאחר מכן נטענו לתוך השבב על ידי לחיצה על התא המכיל פתרון. הן עבור חסידים והן עבור תרבות ההשעיה של תאי גזע נוירו, תאים נאספו והספירות הועמסו ישירות לתוך השבב.

לרכישת תמונה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך עם שלב תרגום אוטומטי ומצלמת מוליכים למחצה משלימה דיגיטלית של תחמוצת מתכת. הבמה ורכישת התמונה נשלטו באמצעות התוכנה מראה את הפינה השמאלית העליונה ואת התאים בפינה הימנית התחתונה כנקודות בחירה ולהעביר את השלב התרגום לנקודות מסודר כדי לקבל את ההדמיה הראשונית עם עדשה אובייקטיבית 4x. שנה את העדשה האובייקטיבית 4x עם 20x אחד ולהתאים פרמטרים הדמיה כולל עוצמת האור, לחשוף את הזמן, וכולי.

לאחר מכן לאתר את נקודות הבחירה כך המיקום של כל תא עוזב 13 על ידי 15 מטריצה קאמרית או להיות מוגדר על ידי התוכנית באופן אוטומטי. עם קביעת הקואורדינטות של התאים, שלב התרגום עובר לכל תא שבו X, Y, מישור מוקד Z יכול להיות מכוון היטב. הגדר את מרווח הזמן ואת משך מחזור ההדמיה.

שמור את הנתיב ולאחר מכן התחל דימות. מערכת זו זמינה למעקב דינמי אחר מטרות שונות, כגון התמיינות תאי גזע עצביים בבהירות ושדה הפלואורסצנטיות של תהליך היווצרות כדוריות תאי גזע עצביים. ניתוח נתונים.

שנה את התבנית ב- nd2 ל- Tif באמצעות תוכנית MATLAB המותאמת אישית. ולחלק את הנתונים לפי נקודות. בחר אובייקט שיש לנתח הוא תא או רקמה.

הזן את הסף, גודל האובייקט, גודל הרעש לניתוח. לחלופין, באפשרותך לבחור ניתוח שלב אחר שלב לפרמטרים אופטימליים. ואז לנתח את כל הנתונים.

לאחר שמירת התוצאה בתבנית MAT, השתמש בתווית כדי לצייר את התוצאות או המעקבים. במאמר זה תיארנו את הפרוטוקול והתרבות של מערכת שבבים מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה המבוססת על טכנולוגיית הפוטוליטוגרפיה לשליטה דינמית במיקרו-וירוס התא החי. תיארנו גם כמה פרמטרים שיש לשלוט בהם בקפידה כגון לחץ הסגירה של שסתומי קרום PDMS ובקרת הספין של הנוזל במקביל לתא.

בתרבות התאים המסורתית במבחנה הטיפול בסביבת תרבות התא מבוצע ידנית, שהיא זמן רב ומילוי מייגע ונוזלים אינו קל לשליטה סטנדרטית. במיוחד דקות של פתרון. ישנן כמה בעיות כגון יצירת תשומות, ריכוז תרופות חיסוניות וצריכה גדולה.

עם זאת, באמצעות המערכת המיקרופלואידית שלנו, ניתן לחזור על זה כממריץ במינון קבוע כמות שווה של ריכוז אחיד, להשוות תרבויות שונות בתאי תרבות שונים באותו זמן. שונה עם כמה גירויים אחוריים ברזולוציה זמנית מיניאטורית ועם תת-רזולוציה על ידי ויסות הנוזל. בנוסף, המערכת שלנו יכולה להשיג מספר רב של תוצאות ניסיוניות השוואתיות על ידי פעולות פשוטות.

המערכת שלנו מבוססת על עקרון הדיפוזיה, יוצרת הפרעה מכנית מינימלית למיקרו-וירוס התאי. עבור שבבי microenvironment הסלולר יציב יותר אתה יכול להגדיל את הרשימה של שכבת החיץ כעומק של שכבת התרבות או להפחית את נוזל הקלט של חילופי בינוני, כלומר להפחית את הלחץ, אשר יהיה כאן למחקר על התנהגות התא. יש לשים לב כי מחקר זה בחן רק את התרבות של 3T3 ותאי המל"ל.

עבור תאים אחרים או קווי תאים אחרים, תנאי התרבות דומים לפרמטרים שלנו כדי להתאים אותו.