מיקרוסקופיה 4D: חשיפת קאנורהבדיטיס אלגנס התפתחות עוברית באמצעות מיקרוסקופיה של נומרסקי
8 באוקטובר 2020
כאן אנו מציגים פרוטוקול להכנה והרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans , רישום התפתחות תחת מיקרוסקופ 4D ואיתור שושלת תאים.
מיקרוסקופיה 4D היא כלי רב ערך לשחזור שושלת התאים השלמה של עובר C.elegans או כל דגימה אחרת ברמת התא הבודד. ניתן להשתמש באופטיקה של נומרסקי כדי להדגיש שינויים בצורת התא במהלך ההתפתחות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי ואור מועבר ללא צורך בבעלי חיים טרנסגניים או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מיקרוסקופ 4D מאפשר לחקור את מחזור התאים, התרבות, התמיינות ואפופטוזיס ב-C.elegans ובמערכות אחרות כגון יונקים או תרבית תאי רקמה.
מעקב אחר שושלת תאים בתמונות DIC מתבצע באופן ידני. זה גוזל זמן ודורש תרגול מסוים כדי לבצע ניתוח עובר מלא. תדגים את ההליך בגונה אזקורה, טכנאית במעבדה שלנו.
לפני הכנת העוברים, התאם את טמפרטורת ההקלטה של המיקרוסקופ ה-4D ל-15, 20 או 25 מעלות צלזיוס והגדר את המיקרוסקופ להקליט 1, 500, 30 ערימות z במישור המוקד במרחק של מיקרון אחד זה מזה עם מרווחים של 30 שניות בין תחילת כל ערימה. לאחר מכן, הכניסו 500 עד 1000 מיקרוליטר של נוזל 4.5% אגר לתוך צינורות זכוכית של שלושה מילימטר ואטמו בזהירות את הצינורות בסרט שעווה כדי למנוע התייבשות. להכנת כרית אגר הומוגנית דקה להקלטה, מחממים בזהירות ומניחים אגר על מבער אלכוהול עד שהאגר נמס ומניחים את הצינור בגוש חום של 80 מעלות צלזיוס.
הנח שקופית מיקרוסקופ זכוכית על פיסת פלסטיק והשתמש בפיפטה מרעה ביד אחת כדי להניח טיפה קטנה של אגר מומס במרכז המגלשה, ולאחר מכן השתמש מיד ביד השנייה כדי להניח שקופית שנייה על טיפת האגר ליצירת כרית אגר דקה מאוד. כדי להרכיב את העוברים, ראשית, השתמש בקוטף כדי להעביר 5 עד 10 הרמפרודיטים לתוך שען מלאה במים תחת מיקרוסקופ סטריאו. השתמש באזמל כדי לחתוך את הנמטודות ההרמפרודיטות ולחלץ ביצית אחת עד ארבע ביציות מוקדמות מהרחם.
החלק בעדינות את המגלשה העליונה מכרית האגר והשתמש בצינור נימי כדי להניח ביצה מוקדמת במרכז הכרית. השתמש בריסים המודבקים לקצה קיסם כדי להתאים את מיקום הביצה לפי הצורך, והשתמש בפיפטה הנימים כדי להסיר עודפי מים. השתמש באזמל כדי לעטוף לאט ובאלכסון את החלקת הכיסוי מעל התכשיר לפני השימוש במיקרופיפט כדי למלא 3/4 מהחלל המקיף את כרית האגר במים.
לאחר מכן אטום את החלקת הכיסוי עם ג'לי נפט כדי למנוע התייבשות במהלך תקופות רישום ארוכות. לאחר האיטום, הנח את השקופית על שלב המיקרוסקופ 4D והשתמש במטרה בהגדלה נמוכה כדי להביא את העובר למיקוד. בחר את מטרת הטבילה פי 100 ומקד את הקבל.
פתח לחלוטין את הצמצם של המעבה וסגור את דיאפרגמת השדה כדי לספק צמצם מספרי גבוה יותר ורזולוציה גדולה יותר. סובב את מנסרת וולסטון כדי לקבל תמונה תלת מימדית של העובר מואר בצד אחד, ואז סובב את המנסרה לכיוון השני כדי לקבל את האפקט של הארת העובר בצד השני והתחל בהקלטה 4D. לשחזור שושלת תאים של עובר מוקלט בסרט 4D, פתח את תוכנת מעקב השושלת ובחר קובץ ופרויקט חדש.
בחר את תבנית שושלת התאים המתאימה בהתאם לטמפרטורת ההקלטה והגדר את ספירת הסריקות ל-1500. הזמן בין סריקות ל-30 שניות, ספירת הרמות ל-30 והמרחק בין רמות למיקרון אחד. בחר את קובץ התמונה, התבנית והספרייה שבהם נשמרו התמונות.
בחר אם התמונות נשמרו כתמונות בודדות או כאוספי z מרובי תמונות והגדר את שמות הקובץ ואת תבניות התמונה. לאחר מכן לחצו על 'עיבוד ערוץ' מופעל כדי לזהות ולהגדיר את ערוצי האור המתאימים בסרט 4D. למעקב אחר שושלת תאים, הפעל את תוכנת מעקב שושלת התאים.
יופיע חלון וידאו וחלון שושלת תאים. בחלון השושלת, בחר את ענף השושלת ולחץ על גרעין התא המתאים לתא זה בחלון הווידאו. הפעל את הסרט 4D קדימה, אחורה או למעלה או למטה רמה כדי לעקוב אחר התא המעניין מרחבית לאורך זמן.
לחץ מעת לעת על גרעין התא כדי ליצור נקודה בענף השושלת ולרשום את הקואורדינטות המרחביות של התא בזמן מסוים. כתוצאה מכך, התקדמות שושלת תאים ושחזורים תלת מימדיים של העובר אפשריים. לאחר מכן לחץ על מקש החזרה כדי לסמן מיטוזה ובחר אחד מתאי הבת כדי לעקוב אחר התקדמות התא כפי שהודגם זה עתה.
חזור על הניתוח עבור שאר התאים העובריים כדי להתחקות אחר שושלת התאים השלמה או לעקוב אחר תאים ספציפיים מעניינים, כגון אלה שעוברים אפופטוזיס. כדי לאפשר השוואה של שושלות מוטנטיות מעניינות עם שושלת תאי C.elegans מסוג בר סטריאוטיפית. צלחות תולעים מודגרות בתוך קופסאות קרטון כדי למנוע עיבוי.
לאחר השלמת ההקלטה, ניתן לשחזר את שושלת התאים באמצעות תוכנת מעקב אחר שושלת כפי שהודגם. לדוגמה, בניתוח מייצג זה, שושלת תאי העובר המוטנטיים gsr-1 שאותרה הושוותה לשושלת מסוג הבר C.elegans. ונחשף הגילוי של עיכוב מתקדם במחזור התא במהלך ההתפתחות העוברית.
כתוצאה מכך, עוברים מוטנטיים נעצרו בשלבי ביניים ואילו עוברים מסוג בר התקדמו ולבסוף בקעו כזחלים. בנוסף, ניתן לדמיין באופן דינמי מאפיינים חשובים אחרים של התפתחות עוברית, כגון אפופטוזיס באמצעות מיקרוסקופיה 4D. יש לעבד באופן ידני את מעקב השושלת של תמונות ה-DIC.
עיבוד תוכנה של תאים לא מסומנים באור נראה בשלבים מוקדמים של התפתחות אינו מדויק לניתוח עוברים. יישום מערכת זיהוי תמונה בתחום מיקרוסקופ האור הנראה יביא להתקדמות רבה בתחום הביולוגיה ההתפתחותית.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנה ולהרכבה של עוברי Caenorhabditis elegans, תוך שימוש במיקרוסקופיה בתלת-ממד וזמן (4D) כדי להקליט את ההתפתחות ולעקוב אחר השושלת התאית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- מיקרוסקופיה בתלת-ממד וזמן (4D) מאפשרת שחזור של שושלות תאים ברמת התא הבודד.
- אופטיקת נומארסקי (Nomarski) יכולה להמחיש שינויים במבנה התא במהלך ההתפתחות.
- שיטה זו אינה דורשת בעלי חיים טרנסגניים או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מעקב אחר שושלות תאים מבוצע באופן ידני, דבר העשוי להיות גוזל זמן.
מטרת המחקר
- להדגמת פרוטוקול להכנת עוברים ולהקלטת מיקרוסקופיה בתלת-ממד וזמן (4D).
- לניתוח מחזור תאים, שגשוג,התמיינות ואפופטוזה ב-C.elegans.
- להשוואת שושלות של מוטנטים לשושלת התאים של C.elegans מסוג הפרא.
שיטות שנבצעו
- הכנת פדי אגר לקיבוע עוברים.
- תיעוד התפתחות העוברים באמצעות מיקרוסקופ 4D.
- מעקב ידני אחר שושלת תאים באמצעות תוכנה ייעודית.
- השוואת שושלת התאים בין עוברים מוטנטים לעוברים מסוג בר (wild-type).
תוצאות עיקריות
- שחזור של שושלת התאים חשף עיכובים במחזור התא של עוברי מוטציה.
- עוברי פרא (Wild-type) התפתחו באופן נורמלי ובקעו כזחלים.
- הושגה ויזואליזציה דינמית של אפופטוזה במהלך ההתפתחות העוברית.
- עיבוד ידני של מעקב השושלות היה נחוץ לצורך ניתוח מדויק.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מפורט של התפתחות עוברית של C.elegans.
- מיקרוסקופיה ב-4D היא כלי רב עוצמה לחקר שורות תאים ותהליכי התפתחות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול זיהוי תמונה אוטומטי לשיפור הניתוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה ב-4D מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה וללא סימון של התפתחות עוברית ברזולוציית תא בודד, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך תיקוף מטרות (target validation) על ידי חשיפת תהליכים תאיים דינמיים כגון שגשוג, דיפרנציאציה ואפופטוזיס. גישה זו מספקת ביטחון חזוי בסינון פנוטיפי על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על פנוטיפים התפתחותיים במערכת מודל ניתנת לבינוי גנטי, דבר המקל על זיהוי מוקדם של תרכובות או הפרעות גנטיות המשבשות מסלולי התפתחות מרכזיים. התאימות של השיטה למיקרוסקופיה סטנדרטית והעובדה שאינה דורשת שימוש בטרנסגנים מורידות את חסמי האימוץ בזרימות עבודה של גילוי המתמקדות ברעילות התפתחותית או בחקירה מכניסטית של מסלולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור הפרעות גנטיות או פרמקולוגיות לפגמים ספציפיים בהתקדמות מחזור התא, בנדידה או בהגדרת גורל התא.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית כמותית וישירה על פנוטיפים עובריים ללא הסתמכות על רporters פלואורסצנטיים או מניפולציה גנטית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר מערכי נתונים כמותיים ובעלי רזולוציה זמנית על שורת תאים ודינמיקת חלוקה, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולהערכת הדירות (reproducibility).
- ערך תפעולי: מקל על הכנת דגימות עובריות סטנדרטיות לצורך דימוי עקבי לאורך מסעות סריקה, ובכך משפר את היכולת להשוות בין הנתונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לחקר מנגנוני התפתחות שמורים, ומאפשר אקסטרפולציה למערכות יונקים באמצעות ניתוח שוואתי של שושלות תאים.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי זיהוי פגמים עובריים המתואמים עם רעילות התפתחותית או שיבוש של מסלולים ביולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ובמיוחד בתיקוף מטרות (target validation) ובסריקה פנוטיפית, שבהן תצפית ישירה על דינמיקה תאית מספקת הבנה מכניסטית ותסייע בתעדוף תרכובות לפני זיהוי מובילים (lead identification).
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על ידי ויזואליזציה של האופן שבו השתקה של גנים ספציפיים או טיפולים בתרכובות משפיעים על התקדמות שושלת התאים העוברית ועל מורפוגנזה של רקמות.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות וניתנות לשחזור לגבי תזמון מחזור התא, תדירות אפופטוזיס ודיוק מיטוטי, ובכך תומכת בחוסן של בדיקות בסריקות פנוטיפיות.
- אנליטיקה: מייצרת מערכי נתונים מרחביים-זמניים המאפשרים השוואה בין שושלות של מוטנטים לבין שושלות של טיפוס בר (wild-type), ובכך מאפשרת הערכה סטטיסטית של עיכובים או הפרעות התפתחותיות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים ב-C. elegans לנתיבים התפתחותיים שמורים, ותומכת בהשלכה על איקריוטים גבוהים יותר כאשר התוצאות הפנוטיפיות ניתנות לפירוש מכניסטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר לצורך פנוטיפינג התפתחותי במגוון פרויקטים, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת העמימות במנגנון הפעולה באמצעות תצפית פנוטיפית ישירה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע עוברים והדמיה, ובכך מצמצם את השונות במחקרי אורך.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) על ידי אספקת סמנים ביולוגיים (biomarkers) מוקדמים ונצפים של שיבוש התפתחותי, ובכך מפחית השקעה במקרים של חיוביים שגויים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות או תרכובות מבוסס סיכון, על ידי כימות פנוטיפים התפתחותיים ברזולוציה של תא בודד.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהגדרת מיקרוסקופ, כולל יישור הקונדנסור ומניפולציה של פריזמה של Wollaston להשגת ניגודיות DIC אופטימלית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופ בעל יכולות 4D הכולל פונקציות של z-stacking ו-time-lapse, יחד עם בקרת סביבתית להקלטות הרגישות לטמפרטורה.
- מחייב נהלי עבודה סטנדרטיים להוצאת עוברים, קיבוע ואיטום, כדי להבטיח עקביות בין משתמשים וניסויים.
- כולל מעקב ידני אחר שושלות תאים (lineage tracing), הדורש הכשרה ותרגול כדי לשמור על דיוק ואמינות בין משתמשים שונים.
- מוגבל בשל האופי העתיר עבודה של הניתוח הידני, אם כי הדבר מומתן על ידי שימוש בתוכנה ייעודית לארגון וויזואליזציה של נתונים.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:11
4D Microscope and Slide Preparation
2:28
Embryo Mounting
3:36
4D Microscope 3D Image Acquisition
4:25
4D Movie Analysis
5:28
Cell Lineage Tracing
6:55
Results: Representative C. Elegans Cell Lineage Tracing and Embryonic Development Evaluation
7:58
Conclusion
