הדמיה של פפטיד אימונואקטיבי הקשורות לגן קלציטונין של דורה מאטר גולגולת החולדה עם אימונופלואורסצנטיות ומעקב עצבי

פרוטוקול זה עשוי לספק התייחסות מתודולוגית משתנה להבנת המבנה המוחי המורכב של דורה דורה גולגולתית על המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי. ניצול של הר דורה מאטר שקוף, המתאם מרחבי של סיבי עצב אימונואקטיביים CGRP dural וכלי דם ניתן להדגים בתצוגה 3D. לאחר המתת חסד חולדה, טרנסקרדיאלית perfused אותה עם 100 מיליליטר של 0.9% מלוחים נורמלי ואחריו 250 כדי 300 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב 0.1 חוצץ פוספט טוחן.

בסיום, להסיר את העור בראש ולפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את הדורה מאטר ואת הצד הגבי של המוח. לנתח את דורה דורה גולגולתי מאטר לאורך גזע המוח אל נורת הריח בתבנית הר שלם. יש לשטוף את הדורה מאטר הגולגולתי ב-0.1 חוצץ פוספט טוחן למשך כדקה ולהדגיר אותו בתמיסת חסימה.

העבר את דורה מאטר לתוך נוגדן נגד CGRP העכבר לילה. למחרת, לשטוף את הדורה מאטר שלוש פעמים 0.1 חוצץ פוספט טוחן. דגירה דורה מאטר בתמיסה מעורבת של חמור נגד העכבר אלקסה פלואור 488 נוגדן משני ו phalloidin 568 ב 0.1.

חיץ פוספט טוחנת המכיל 1% סרום חמור רגיל ו 0.5% טריטון X-100 במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הדורה מאטר שלוש פעמים במאגר פוספט טוחן 0.1, חתכו את הקצוות והרכיבו אותו על מגלשות מיקרוסקופ. שים על תלושי כיסוי עם 50% גליצרין לפני התצפית.

דמיין את כל הר דורה מאטר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואז לצלם את סיבי העצב האימונואקטיביים CGRP וכלי דם עם תווית פאלואידין בדורה מאטר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לגלח את ראשו של החולדה עם סכין גילוח חשמלי, ואז לשים מוטות אוזניים קהים לחולדה ומניחים אותו על המכשיר סטראוטקסי. מקם את מחזיק הפה ולהחיל משחה עיניים על העיניים.

לנקות את הצד הכירורגי של העור הראש באמצעות 75% אתנול ולעשות חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת. הסר בבוטות את periosteum ורקמות שריר מן הגולגולת באמצעות אפליקטורים כותנה סטרילית הטה. לקדוח חור קטן באמצעות מקדחה בר עם קצה עגול קצת על עצמות הקודקוד השמאלי זמן מעל עורק קרום הכלי האמצעי.

לבנות בנק סביב החור עם מלט סיליקט שיניים ולהוסיף שני microliters של fluorogold לתוך החור סביב עורק קרום הקרום האמצעי עם 10 מיקרוליטר microsyringe. מכסים את החור עם חתיכה קטנה של ספוג hemostatic. שים חתיכת סרט פרפין על החור ולאטום את הקצוות עם שעווה בעצמות.

לתפור את הפצע עם חוט סטרילי. שמור את החולדות באזור חם עד שהם התאוששו לחלוטין. ואז להחזיר את החולדות בחזרה לכלובים שלהם.

לאחר שבעה ימי הישרדות, לחלחל חולדות אלה עם 0.9% מלוחים נורמלי ואחריו 4% paraformaldehyde ב 0.1 חוצץ פוספט טוחנת. לנתח את TG וצוואר הרחם אחד עד ארבעה DRGs, ואז לחתוך אותם בעובי של 30 מיקרומטרים על מערכת microtome cryostat בכיוון sagittal. ולהרכיב את החלקים על מגלשות זכוכית מצופות סילאן.

מקיפים את החלקים בעט היסטוכימי ומדגרים אותם במשך 30 דקות בחסימת פתרון. להעביר את הדגימות לתוך הפתרון של ארנב אנטי פלואורוגולד ועכבר נגד CGRP נוגדן דגירה בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לשטוף את החלקים שלוש פעמים 0.1 חוצץ פוספט טוחן.

דגירה את החלקים שטף בתמיסה מעורבת של חמור נגד ארנב אלקסה פלואור 594 וחמור נגד העכבר אלקסה פלואור 488 נוגדן משני. ואז לשטוף אותם שלוש פעמים 0.1 חוצץ פוספט טוחן ולהחיל תלושי כיסוי עם 50% גליצרין להשגחה. צלם תמונות של נוירונים שכותרתו פלואורוגולד TG ו DRGs תחת תאורת UV באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

לאחר מכן, ללכוד תמונות של fluorogold ו CGRP שכותרתו נוירונים TG ו DRGs. לאחר כתמים היסטוכימיים אימונופלואורסצנטיים ופלואורסצנטיים עם CGRP ופאלואידין, סיבי עצב אימונואקטיביים של CGRP ופאלואידין שכותרתו עורקים דוראליים ורקמות חיבור הוצגו בבירור לאורך כל ההר גולגולתי דורה מאטר בתבנית 3D. סיבי עצב חיסוניים עבים ודקים של CGRP פועלים במקביל לעורקי הדור סביב דופן כלי הדם או בין כלי הדם.

שבעה ימים לאחר יישום fluorogold על האזור של עורק קרום המוח האמצעי ואת החולדה גולגולת דורה מאטר, נוירונים שכותרתו fluorogold זוהו TG ו DRGs צוואר הרחם בצד ipsilateral של יישום tracer, אשר נצפתה ישירות תחת תאורת UV של מיקרוסקופ פלורסנט. נוירונים שכותרתו Fluorogold נמצאו בכל שלושת הענפים של TG, עם ריכוזים גבוהים יותר על חטיבות עיניים ו maxillary ועם ריכוזים נמוכים יותר על חלוקת הלסת התחתונה. חלק מהנוירונים שכותרתו fluorogold נצפו גם בצוואר הרחם שניים עד שלושה DRGs.

אלה immunofluorescences כפול תצלומים מייצגים להראות נוירונים חושיים TG ו DRG. הנוירונים שכותרתו עם FG, CGRP, וגם FG ו CGRP היו דמיינו על ידי חיסוניות כפולה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לנתח לחלוטין את דורת הדורה הגולגולתית ולהדביק אותה על שקופית בתבנית הרכבה שלמה.