ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

פרוטוקול זה יכול לעזור לנו לאפיין את התגובה החיסונית של המאכסן כנגד ביו-חומרים שונים, אשר לאחר מכן יכולים לסייע בתכנון שתלים רפואיים עתידיים טובים יותר. ציטומטריית זרימה מספקת לנו מידע על תאי מערכת החיסון החודרים לחומר ביולוגי, מה שעוזר לנו לקבוע מנגנונים של האופן שבו תאים מגיבים לפציעה ולהשתלת חומרים, כמו גם מטרות לשיפור הטיפולים. ניתן לשנות את אותו פרוטוקול כדי לאפיין תגובה חיסונית בסביבות שונות.

נתחו את השריר המרובע של עכברים שקיבלו שתל ECM לפני שבוע ונאספו בצינור של 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של מדיה נטולת סרום. לבסוף חתכו את הרקמה בעזרת מספריים. לאחר מכן, הוסף חמישה מיליליטר של מדיה אנזימי העיכול לצינור.

הניחו את הצינורית המכילה חומר עיכול ורקמות חתוכות לקוביות באינקובטור רעד למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד. בסוף מסנן הדגירה מסננים את תרחיף הרקמה המעוכלת דרך מסננת 70 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר בודד. השתמש בראש מזרק חמישה מיליליטר כדי לרסק כל גוש מוצק של רקמות ולשטוף את המסננת עם PBS בטמפרטורת החדר.

יש להשליך את השאריות שנותרו במסננת ולהתאים את נפח הצינור ל-50 מיליליטר עם PBS בטמפרטורת החדר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולהשהות מחדש את הכדוריות ב 10 מיליליטר של תמיסת EDTA חמישה מילימולרית קרה ב- PBS. אם תאי הדם נמצאים בדגימה, להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ ליזה RBC, לדגור במשך 10 דקות, ולאחר מכן להוסיף תשעה מיליליטר של EDTA.

השאירו את המתלה על קרח למשך 10 דקות. לאחר מכן התאם את עוצמת הקול ל -50 מיליליטר עם PBS קר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה להשעות מחדש את הכדורים ו 100 מיקרוליטר של PBS קר.

מעבירים 10 מיקרוליטר של התרחיף לצינורות מיקרו צנטריפוגות בודדות ומערבבים עם 10 מיקרוליטר טריפ וכחול לספירה. מוציאים את נפח התאים הנותר לכל באר של צלחת באר V תחתונה 96. הסר 20 מיקרוליטר של תאים מהבאר והוסף אותם לבאר חדשה לשימוש כבקרה לא מוכתמת.

לאחר מכן השתמש PBS כדי להביא את נפח הסופי בכל באר ל 200 מיקרוליטר. לאסוף את התאים בתחתית בארות הצלחת על ידי צנטריפוגה ולהשהות מחדש את התאים ב 100 מיקרוליטר של ריכוז אחד עד 1000 של צבע קיימא לכל באר. בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם 100 מיקרוליטר של PBS טרי להשעות את הכדורים ב 200 מיקרוליטר של חיץ מכתים לכל באר.

לאחר הצנטריפוגה השנייה, להשעות מחדש את התאים ב 50 מיקרוליטר של דילול אחד עד 100 של חוסם מונוציטים. לדגור על תרחיף התא במשך חמש דקות על קרח ולאחר מכן להוסיף 50 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים. יש לדגור במשך 30 דקות על קרח המוגן מפני אור.

לאחר מכן לשטוף את הבארות עם 100 מיקרוליטר של חיץ מכתים לכל באר. צנטריפוגות את התאים שוב ולשטוף עם 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה. חזור על התהליך פעמיים נוספות ולאחר מכן השהה מחדש את התאים ב 400 מיקרוליטר של חיץ צביעה.

לפני ניתוח הדגימה, הפעל דגימה לא מוכתמת כדי לאפשר התאמה של אוכלוסיית התא על פיזור צדדי לעומת תרשים פיזור קדמי. לאחר מכן, הפעל את הדגימה המוכתמת. חלץ את החתימה האוטופלואורסצנטית.

לאחר מכן ייבא את קבצי FCS כדי להשתמש בהם כפקד לביטול ערבוב. לחץ על סמל unmixing כדי לפתוח את אשף unmixing ולבצע unmixing באמצעות כל פקדי צבע יחיד על ידי gating האוכלוסיות החיוביות והשליליות. לאחר מכן, לחץ על סעיף QC ולהסתכל על מדד המורכבות.

מדד הסיבוכיות הוא מדד למידת ההבחנה בין אוסף של חתימות ספקטרליות כאשר החתימות הספקטרליות אינן מעורבבות זו בזו. לבסוף, בטל את ערבוב הדגימה על-ידי לחיצה על בטל ערבוב חי. כאן, התוצאות של 14 עובדות צבע על רקמת עכבר הבקרה ניתן לראות.

בניתוח זה ניתן היה להבחין במספר אוכלוסיות לוביסטיות, כגון נויטרופילים חיוביים ly6g ומחלקות מונוציטים בעלי ביטוי בינוני וגבוה ly6c. CD11c MHC גבוה שני תאים דנדריטיים חיוביים נראו בקלות כאשר גודרו כנגד CD11b כדי לשלול מקרופאגים ותאי שושלת מיאלואידים אחרים כגון נויטרופילים ומונוציטים. ניתן לזהות תת-קבוצה של תאים דנדריטיים חיוביים CD86 חיוביים CD206 על ידי התמקדות באוכלוסייה חיובית זו של CD11c, הכוללת הן CD86 גבוה M1 כמו תאים דנדריטיים ו- CD206 גבוה M2 כמו אוכלוסיות תאים דנדריטיים.

F4/80 הדגים שיפוע של ביטוי כפי שנצפה בדרך כלל באוכלוסיות מקרופאגים שונות. Siglec-F היה נוכח הן באוכלוסיות F4-80 חיוביות והן באוכלוסיות שליליות, שככל הנראה התאימו לתת-קבוצה של מקרופאגים ואאוזינופילים, בהתאמה. למרות שצביעה בסמנים של פני התא מאפשרת לבצע את הכינויים הללו של סוגי תאים, חשוב לציין כי יש לראות תאים המבטאים סמנים שונים באופן פונקציונלי ולא סיווג בינארי יותר.

בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי הבנת החתימה האוטופלואורסצנטית של הדגימות המוכתמות שלך לפני תכנון הפאנל שלך היא המפתח להשגת ערבוב טוב יותר. מלבד ניתוח תאים, ניתן למיין את התאים המבודדים לאוכלוסיות ספציפיות לצורך הערכות במורד הזרם עם בדיקות תאיות, במבחנה, אנליזה טרנסקריפטומית, או לניתוח מיקרוסקופי להערכת מורפולוגיה תאית. המורכבות הגוברת של ניתוחי ציטומטריית זרימה של ביו-חומרים מסייעת לגשר על הפער בין לימודי אימונולוגיה בסיסיים לבין הנדסה של טיפולים חדשים.