מודל תלת מימדי של ספרואידים לחקר תאי גזע סרטניים המעי הגס
22 בינואר 2021
פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.
שיטה חדשה זו של תרבויות ספרואיד יכול לשמש כדי ללמוד את tumorigenicity לנתח את נוכחותם של אוכלוסיות שונות של תאי גזע סרטניים וגם ניתן ליישם יפה דרך מסך לשים גבוה עבור תרופות חדשות. זוהי מערכת תרבותית חזקה וחוזרת על עצמו ליצירת מספר רב של ספרואידים בגודל הומוגני. יתר על כן, כדוריות אלה ניתן להשתמש כדי ללמוד תאי גזע סרטניים.
שיטה זו מוגדרת ללמוד ביולוגיה סרטן כרונית אבל זה יכול להיות מוגדר בקלות ללמוד סרטן אחרים על ידי שינוי התנאים תרבות 3D. הקפד לצפות בועות במדיום, לא להזיז את הצלחת יותר מדי במהלך היווצרות spheroids כדי להיות זהיר בעת קצירת spheroids לתוך מסננת. התחל על ידי טיפול מראש בארות של צלחת 24 גם עם 500 ליטרים של פתרון נגד דבקות שטיפה לכל באר.
לאחר מספר שניות צנטריפוגה את הצלחת רוטור דלי מתנדנד ולשטוף כל באר עם 2 מיליליטר של מדיום בזל חם. שימו לב לצלחת שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהבועות הוסרו לחלוטין מבארות המיקרו. אם אין בועות נצפו, לשטוף את הבארות שוב לפני הוספת מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף DMEM חם בינוני לכל באר.
כדי לגרום להיווצרות ספרואידית, ראה את הריכוז הרצוי של תאי קאקו-2 בשכבת מונו דו-ממדית בצלחת של 10 ס"מ ב- DMEM בתוספת 10%FBS ו- 1%אנטיביוטיקה. לתרבות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באטמוספירה לחה. כאשר מגיעים ל-80%, שטפו את התאים בחמישה מיליליטרים של PBS לפני הטיפול בתרבות בשני מיליליטרים של טריפסין-אדטה במשך שתיים עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני.
כאשר התאים התנתקו לנטרל את טריפסין עם ארבעה מיליליטר של DMEM מלא. לאחר הספירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend את הצבעים בנפח המתאים של מדיום מטריצת קרום מרתף DMEM כדי להשיג את הריכוז הרצוי של תאים במיליליטר אחד של מדיום לכל באר. הוסף מיליליטר אחד של תאים לכל באר של צלחת 24 באר מראש, ואחריו תוספת של מיליליטר אחד של מטריצת קרום מרתף DMEM מדיום לכל באר.
לאחר הזריעה, מיד צנטריפוגה הצלחת ולהשתמש מיקרוסקופ אור כדי לוודא כי התאים הופצו באופן שווה על פני בארות מיקרו. לאחר מכן מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 48 שעות מבלי להפריע לתאים. כדי לקצור את הספארוידים, בסוף הדגירה, השתמשו בפיפטה סרולוגית וחצי מהספרואידים בכל באר כדי לעקור בעדינות את הספרוידים מבארות המיקרו שלהם.
כאשר כל הספארוידים נותקו, השתמש בפיפט כדי להעביר בזהירות את תרביות ה-3D מכל באר למסננת הפיכה של 37 מיקרון על גבי צינור חרוט של 15 מיליליטר. לשטוף כל באר שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של בינוני בזל מראש לכל לשטוף כדי לאסוף את כל spheroids הנותרים ולהוסיף אלה spheroids נוספים מסננת. לאחר הכביסה האחרונה לבדוק את הצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר כי כל spheroids הוסרו מן בארות מיקרו.
ואז להפוך את מסננת מעל צינור חדש 15 מיליליטר ולשטוף את החלק התחתון של מסננת עם טרי DMEM מרתף מטריצת מדיום כדי לאסוף את spheroids לתוך הצינור. ספרואידים עולים מ 500 תאים להדגים את הגידול ההומוגניים ביותר בגודל לאורך זמן. עם 500 ו 600 תאים לכל ספרואיד לקבוע להיות המספר האופטימלי של תאים שתחתיו צמיחה טובה שונות נמוכה ניתן להשיג.
התוספת של מטריצת קרום מרתף משפרת את הצמיחה ספרואידית והומוגניות. בתרבות ארוכת טווח, התאים מופיעים כמו שכבות מרובות צפופות ביום השלישי. בעוד תאים שטוחים מסודרים בשכבות מונו גלויים בבירור ביום 10.
באופן מעניין, לומן מופיע בתוך הכדורואידים מהיום החמישי ואילך. בנוסף, עלייה ברורה בתאים המתרבים תאים גרעיניים אנטיגן חיובי נצפתה בימים חמש ושבע כי יורד ביום 10. באופן מפתיע, Caspace מופעל 3 נצפתה בתאים מעטים מאוד בימים שלוש וחמש בלבד.
בעוד רמות גבוהות של ביטוי בטא קטנין נצפים בכל נקודת זמן. הפוטנציאל של spheroids להבדיל לתוך Anterosites מעיד על ידי שלהם אלקליין Phosphatase ואת משפחת המוביל מסיס 2A5 ביטוי mRNA. בנוסף, ספירואידים זה מבטאים סמני תאי גזע סרטניים טיפוסיים ומגיבים לטיפולי כימותרפיה משולבים הניתנים באופן שגרתי לחולי סרטן המעי הגס.
אז ספרואידים מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות. לאחר מכן הם יכולים לשמש יפה כדי לנתח תגובות ספציפיות לתאים לגירויים כגון עקשנים ובסופו של דבר לתגובות סמים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מציג מערכת תרבית חסונה ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס מסוג Caco2. שיטה זו מאפשרת לחקור את הביולוגיה של תאי גזע סרטניים ואת תגובתם לכימותרפיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- הבנת תאי גזע סרטניים היא חיונית לפיתוח טיפולים יעילים.
- תרביות ספרואידים בתלת-ממד מדמות סביבות גידול in vivo.
- ניתן להתאים שיטה זו לסוגי סרטן שונים.
- חוסן ויכולת שחזור הן חיוניות לתוקף ניסויי.
מטרת המחקר
- לבסס שיטה מהימנה לתרבית ספרואידים מתאי Caco2.
- לחקור את הפוטנציאל התווריגני ואת אוכלוסיות תאי הגזע הסרטניים.
- להקל על ביצוע סריקה בסינון רב-גורמי (high-throughput screening) לתרופות חדשות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טיפול מקדים של הבארים באמצעות תמיסת שטיפה אנטי-היצמדות (Anti-Adherence Rinsing Solution).
- טיפול זהיר למניעת היווצרות בועות במהלך יצירת הספרואידים.
- איסוף הספרואידים באמצעות מסנן.
- ניטור תנאי התרבית לצמיחה אופטימלית.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של ספרואידים בגודל הומוגני.
- הוכחת התאמה למחקר של תאי גזע סרטניים.
- פוטנציאל ליישומים של סריקת תרופות.
- יכולת התאמה לסוגי סרטן אחרים על ידי שינוי תנאי התרבית.
מסקנות
- שיטה זו מספקת כלי חדש למחקר הסרטן.
- היא משפרת את ההבנה של הדינמיקה של תאי גזע סרטניים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל מערכת זו לפיתוח טיפולי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל ספרואיד תלת-ממדי זה נותן מענה לצורך הקריטי במערכות פרה-קליניות המשחזרות את ההטרוגניות של הגידול ואת הפנוטיפים של תאי גזע סרטניים (CSC), ובכך מאפשר הערכה חיזויית יותר של מטרות טיפוליות ותגובות לתרופות במחקר של סרטן המעי הגס. על ידי אספקת פלטפורמה הניתנת לשחזור להעשרה ארוכת טווח של CSC ולהערכת התגובה לכימותרפיה, השיטה תומכת במאמצי תיקוף מטרות וזיהוי מובילים בשלבים מוקדמים, עם ביטחון תרגומי משופר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטי
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ההטרוגניות של תאי גזע סרטניים (CSC) ושל הפוטנציאל התווריגני שלהם, באמצעות דפוסי שגשוג דיפרנציאליים ומבנים דמויי לומן בתוך ספרואידים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי העשרה של CSCs המבטאים סמנים מוכרים, ובכך מסייע בהורדת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר ספרואידים בגדלים הומוגניים מקלט תאים מוגדר, ובכך יוצר מערכת סטנדרטית לניתוח כמותי של תגובה לתרופות.
- ערך תפעולי: תואם לזרימות עבודה של סריקה בסביקת תפוקה גבוהה (high-throughput screening) הודות לרובסטיות, הדירות וקלות באיסוף הספרואידים באמצעות שיטות מבוססות סינון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים ביטוי של סממני CSC ותגובה לשילובים של כימותרפיה בעלי רלוונטיות קלינית, מה שמאפשר מידול פרה-קליני של עמידות ורגישות לטיפול.
- ערך תפעולי: שומר על פנוטיפים של CSC לאורך תרבית ארוכה, ובכך תומך במחקרים אורך של יעילות תרופות ומכניזמים של חזרת הגידול.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לאישור פרה-קליני, ובמיוחד עבור תוכניות אונקולוגיות המתמקדות בטיפולים המכוונים לתאי גזע לסרטן (CSC) ובמנגנוני עמידות.
- ביולוגיה של גילוי: מסייע בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול נישות של CSC ותגובות תרופתיות דיפרנציאליות בהקשר תלת-ממדי.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות יצירת ספרואידים הומוגניים בגודלם, ובכך תומך בסריקה מהימנה של תרכובות כנגד אוכלוסיות עשירות ב-CSC.
- אנליטיקה: מספק קריאות כמותיות באמצעות ביטוי של סממני CSC, סממני פרוליפרציה (PCNA) וסממני אפופטוזיס (Caspase-3 פעיל) להשוואה בין תנאי טיפול.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מידול תגובה לכימותרפיה במערכת רלוונטית למחלה המשקפת את ההטרוגניות של אדנוקרצינומה של המעי הגס והחלחול.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לסוגי סרטן אחרים על ידי שינוי תנאי התרבית התלת-ממדית, מה שממצב אותו כפלטפורמה רב-שימושית בתוכניות גילוי אונקולוגיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי לכידה של הטרוגניות גידולים המונעת על ידי CSC ותכונות של stemness תפקודי, הנעדרים במודלים דו-ממדיים (2D).
- ערך תפעולי: מספק הדירות ויכולת הרחבה באמצעות זריעה סטנדרטית, טיפול מקדים למניעת היצמדות וקציר מבוסס מסנן, ובכך מפחית שונות ביצירת ספרואידים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך פיתוח (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של תרכובות המכוונות ל-CSC ומנגנוני עמידות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מובילים (leads) בהתבסס על נתוני מודולציה של CSC ותגובה לכימותרפיה ממודל רלוונטי פיזיולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות תרבית תאים בתלת-ממד, כולל טיפול במשטחים אנטי-אדהזיביים וטיפול זהיר למניעת היווצרות בועות במהלך ייזום הספרואידים.
- תלוי בגישה למטריקס של ממבס (למשל Matrigel) ובציוד סטנדרטי לתרבית תאים, הכולל סנטריפוגות, מסננים (37 micron) ומיקרוסקופים הפוכים לצורך ניטור.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של צפיפות הזריעה (500–600 cells/spheroid) ותזמון האינקובציה כדי להבטיח הומוגניות והשחזוריות של הניסויים.
- התאמה לסוגי סרטן אחרים מחייבת אופטימיזציה של ריכוז הממבס ומשך התרבית, בהתבסס על קינטיקת ההצמדות והיווצרות הספרואידים הספציפית לשורת התאים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בטיפול עדין במהלך הקציר כדי למנוע פירוק של הספרואידים ושונות פוטנציאלית בתזמון היווצרות הלומן בין סדרות שונות.
