Name: זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למדו לזהות מעכבי EGFR ו-RAS באמצעות Caenorhabditis elegans לגילוי תרופות נגד סרטן. שיטה זו מאפשרת הדמיה פשוטה וחסכונית של השפעות תרפויות על מסלולי מעבר אותות תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לד"ר סוואטי ארור (MD אנדרסון מרכז הסרטן) על מתן let-60(n1046). אנו מודים גם לד"ר דיוויד ריינר (המכון למדעי הבריאות בטקסס A&M ביו-מדע וטכנולוגיה ביוסטון) על זן הלין-1. לבסוף, אנו מודים לד"ר דניאל גארסין ולמעבדה שלה (אוניברסיטת טקסס, בית הספר לרפואה מקגוורן) על שסיפקו חלק מהריגנטים. כמה זני תולעת סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). מחקר זה נתמך על ידי המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (CPRIT) מענק RP200047 JF הנקוק.

1. הכנת צלחת בינונית לצמיחה נמטודה (NGM)
<ol><li>הוסף 2.5 גרם של פפטון ו 3 גרם של NaCl ל 970 מ"ל של מים deionized הכלולים בקבוק 2 L ארלנמייר. מערבבים את התכולה באמצעות מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, להוסיף 20 גרם של אגר לבקבוקון. יש לקלף אוטומטית את תכולת הבקבוקון ב-121 °C (70 °F) ולחץ של 15ליברות/ב-2 למשך 30 דקות. לאחר עיקור, מניחים את הבקבוקון על צלחת ערבוב ומאפשרים למדיום להתקרר עד שהטמפרטורה מגיעה ל -50 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>כדי להכין את לוחות NGM להוסיף את ריאגנטים הבאים למדיום מקורר: 25 מ"ל של 1 M אשלגן פוספט חוצץ (pH = 6.0), 1 מ"ל של 1 M MgSO4, 1 מ"ל של 1 M CaCl2, 1 מ"ל של (5 מ"ג / מ"ל ב 95% אתנול) כולסטרול, 1 מ"ל של (10% v / w באתנול) nystatin, ו 1 mL של 25 מ"ג / מ"ל סטרפטומיצין.</li>
	<li>תחת זרימה למינארית, יוצקים את המדיום מקורר לתוך 60 מ"מ x 15 מ"מ סטרילי פטרי. תן את הצלחות להתמצזק במשך 2 שעות. צלחות אלה ניתן לשמור במשך חודש אחד ב 4 °C (5 °F).</li>
</ol>2. הפצת ג. אלגנס
<ol><li>ספוט 100 μL של לילה גדל E. coli OP50 על המרכז של כל צלחת NGM ולאפשר הצלחות להתייבש במשך 24 שעות במכסה המנוע למינאר. לאחר מכן, הלוחות ניתן לאחסן במיכל פוליסטירן. הערה: תרבות E. coli OP50 גדלה בתקשורת לוריא-ברטאני (LB) במדיה 37 °C לפני זריעת הצלחות. התרבות יכולה להיות מאוחסנת ב 4 °C (55 °F) במשך 1-2 חודשים ומשמשת זריעת צלחות תקופתית.</li>
	<li>באמצעות בחירת תולעים סטרילית, לאסוף 10-12 תולעים בוגרות gravid מצלחת שגדלה בעבר תחת מיקרוסקופ מנתח. העבר תולעים אלה ללוח NGM טרי זרעים עם E. coli OP50 ודגרת הצלחת במשך 24 שעות ב 20 °C (70 °F).</li>
	<li>לאחר השעה 24 שעות, באמצעות פיק תולעים סטרילי להסיר תולעים בוגרות מהצלחות. לדגור על הצלחות ב 20 °C (50 °F) במשך ~ 3 ימים. עוברים יתפתחו לתולעים בוגרות.</li>
</ol>3. הכנת תרבות סי אלגנס סינכרונית
<ol><li>לאסוף תולעים מבוגרות gravid לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי שטיפת 2-4 צלחות עם M9W.<ol>
<li>הכנת M9W: להמיס 5 גרם של NaCl, 6 גרם של Na2HPO4, ו 3 גרם של KH2PO4 במים deionized לנפח סופי של 1 L. Autoclave הפתרון ב 121 °C בלחץ של 15 lb / ב2 במשך 30 דקות. יש להוסיף 1 מ"ל של 1 M MgSO4 לפתרון מקורר.</li>
	</ol>
</li>
	<li>גלולה התולעים על ידי centrifuging הצינור ב 450 x g במשך 1 דקות. דק את supernatant מבלי להפריע לכדור התולעת.</li>
	<li>הכן תמיסת תולעת על ידי שילוב של 400 μL של 8.25% נתרן hypochlorite (אקונומיקה ביתית) ו 100 μL של 5 N NaOH. הוסף פתרון זה לכדור התולעת והעיף את הצינור כדי לערבב את התוכן של הצינור. למנוע להלבנה יתר של העוברים בצינור על ידי התבוננות תמוגה של התולעים תחת מיקרוסקופ ניתוח.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של M9W לצינור החרוט כדי לדלל את תערובת תמוגה כאשר 70% מהתולעים הבוגרות יש ליס.</li>
	<li>צנטריפוגה הצינור ב 450 x גרם במשך 1 דקות. החלף את supernatant עם 10 מ"ל של M9W.</li>
	<li>חזור על שלב 3.5 פעמיים.</li>
	<li>לאחר השלמת שלבי הכביסה, להוסיף 3-5 מ"ל של M9W כדי resuspend את כדורי הביצה. סובב את הצינור למשך הלילה במהירות של 18 סל"ד על סיבוב צינור בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לאחר דגירה לילה, להסיר את הצינור מן המסובב, גלולה זחלי L1 על ידי centrifuging הצינור ב 450 x גרם במשך 1 דקות. לשאוף M9W עד 250 μL נשאר בצינור.</li>
	<li>לנער את הצינור כדי respend הזחלים. מוסיפים שלוש טיפות μL המכילות את הזחלים על מכסה צלחת פטרי. באמצעות מיקרוסקופ מנתח לספור את מספר התולעים בכל טיפה ולקבוע את מספר התולעים ב 1 μL.</li>
</ol>4. הכנת עשיית סמים
הערה: השלבים בבחון זה מוצגים באיור 1.
<ol><li>לגדל 30 מ"ל של E. coli OP50 בצינור חרוט 50 מ"ל ב 37 °C (57 °F) לילה בשייקר מסלולית ב 150 סל"ד.</li>
	<li>ספין בן לילה גדל E. coli OP50 תרבות ב 4,000 x g במשך 10 דקות כדי כדורי התאים. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 3 מ"ל של M9W כדי לרכז את התרבות.</li>
	<li>לפני הכנת פתרונות העבודה לבדיקת התרופה, להוסיף 0.1 מ"ל של (5 מ"ג / מ"ל ב 95% אתנול) כולסטרול לתוך 100 מ"ל של M9W.</li>
	<li>הכן פתרונות עבודה של כל תרופה ניסיונית על ידי דילול כל תרופה פלוס רכב (דימתיל סולפוקסיד; DMSO) ב 4.8 מ"ל M9W בתוספת כולסטרול כדי להשיג את הריכוזים המתאימים. להמיס DMSO ב 4.8 מ"ל של M9W בתוספת כולסטרול כדי להכין את בקרת הרכב.</li>
	<li>הוסף 200 μL של תרבות מרוכזת E. coli OP50 לכל צינור המכיל את בקרת הרכב או סמים וצינורות מערבולת כדי להבטיח שהם מעורבים.</li>
	<li>כדי לבצע את הניסוי, להוסיף 2 מ"ל של כל פתרון סמים עובד או בקרת רכב לכל באר בצלחת תרבית רקמות 12 טוב. בדוק כל ריכוז סמים ובקרת רכב כפול.</li>
	<li>הוסף ~ 100 זחלי L1 לבאר (ראה שלבי תרבות C. elegans סינכרוניים) באמצעות מיקרופיט סטרילי. הגבל את נפח התולעים ל- 10 μL.</li>
	<li>לדגור על הצלחות ב 20 °C (50 °F).</li>
	<li>תוספת בארות עם 50 μL של 10x מרוכז E. coli OP50 ביום 3 של ההסמכה במידת הצורך.</li>
</ol>5. הכנת כרית אגרוז למיקרוסקופיה
<ol><li>הכן 2% w / v פתרון של אגרוז על ידי המסת 0.1 גרם של אגרוז ב 5 מ"ל של מים deionized. מחממים את התוכן במיקרוגל כדי להמיס את האגורוז. ניתן להכין 20 שקופיות מפתרון אגרוז 5 מ"ל.</li>
	<li>מניחים רצועות של סרט מעבדה לאורך שתי שקופיות זכוכית. הקלטת תפעל כמרווחים המגבילים את עובי רפידות האגורוז. לאחר מכן, הנח שקופית זכוכית נקייה שלישית בין השקופיות המודבקות.</li>
	<li>כדי להפוך כרית אגרוז, לזהות 100 μL של אגה מותכת על מרכז המגלשה הנקייה. מניחים עוד מגלשת זכוכית נקייה על גבי האגורוז ולחץ בעדינות כלפי מטה כדי ליצור כרית. הסר את השקופית העליונה כאשר הפנקס התמצק.</li>
</ol>6. התבוננות בפנוטיפ של מואב בזני let-60, let-23 ו-lin-1
הערה: רק תרופות מועמד לדכא את פנוטיפים Muv ב let-23 ו let-60 זנים ייבחנו באמצעות זן lin-1 כדי לקבוע אם העיכוב מתרחשת ברמה של RAS או EGFR.
<ol><li>כאשר מגיע לשלב המתאים של מחזור החיים (3 ימים עבור לזנים let-60 ו let-23, 5 ימים עבור זן lin-1), להסיר את הצלחות מן האינקובטור. ולאסוף את התולעים בצינורות חרוט 15 מ"ל באמצעות פיפטה.</li>
	<li>צנטריפוגות הצינורות ב 450 x g במשך 1 דקות. להסיר M9W מבלי להפריע גלולה תולעת ולהוסיף 5 מ"ל של M9W טרי.</li>
	<li>חזור על שלב 6.2 פעמיים.</li>
	<li>מבלי להפריע לכדור התולעת, הסר את כל ה- M9W הנותרים על ידי שאיפה. לאחר מכן, להוסיף 500 μL של 2 mM נתרן אזיד או 2 mM טטרמיסול הידרוכלוריד. אפשר צינורות לדגור ב RT במשך 15 דקות. 2 mM נתרן אזיד או 2 mM טטרמיסול הידרוכלוריד יהיה למרדים את התולעים להדמיה. אזהרה: הקפד ללבוש ציוד מגן אישי (PPE) בעת טיפול נתרן אזיד. הפתרון חייב להיות מוכן תחת מכסה המנוע הכימי.</li>
	<li>הוסף 10 μL של השעיית תולעת מרדים למרכז כרית אגרוז. מניחים כיסוי #1.5 בעדינות מעל מתלה התולעת. במידת הצורך, לתקן את כיסוי עם קצת לק כדי למנוע התייבשות.</li>
	<li>השתמש במיקרוסקופ DIC כדי לבחון את הזנים let-60(n1046), let-23(sa62) ו- lin-1(sy254). צלם את התולעים בהגדלות של פי 10 ו-20.</li>
	<li>עבור let-60(n1046) ו let-23(sa62), להבקיע את התולעים הבוגרות בהתבסס על נוכחות או היעדר פנוטיפ Muv. בעוד שעבור זן lin-1, לספור את מספר VPCs שאימצו 1° או 2° גורל תא בצד הגחון של זחלי L4 באמצעות מיקרוסקופ DIC ברזולוציה גבוהה.</li>
	<li>לאחר ניקוד המיקרוגרפים עבור כל זן וטיפול תרופתי, בצעו את בדיקתt של התלמיד כדי לקבוע את ההבדלים הסטטיסטיים בין הטיפולים.</li>
</ol>

<ol><li>Marshall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Ras+and+Raf%3A+key+regulatory+proteins+in+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation.</a> Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).</li>
<li>Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+the+Ras-ERK%2FMAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway.</a> Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).</li>
<li>Grandis, J. R., Tweardy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+transforming+growth+factor+alpha+and+epidermal+growth+factor+receptor+messenger+RNA+are+early+markers+of+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).</li>
<li>Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+molecular+pathobiology+in+oral+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review.</a> International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).</li>
<li>Stransky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutational+landscape+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma.</a> Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).</li>
<li>Bos, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ras+oncogenes+in+human+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">ras oncogenes in human cancer: a review.</a> Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).</li>
<li>Downward, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+RAS+signalling+pathways+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+survey+of+Ras+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive survey of Ras mutations in cancer.</a> Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).</li>
<li>Hancock, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins%3A+different+signals+from+different+locations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ras proteins: different signals from different locations.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).</li>
<li>Hancock, J. F., Parton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+plasma+membrane+signalling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ras plasma membrane signalling platforms.</a> Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).</li>
<li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fendiline+inhibits+K-Ras+plasma+membrane+localization+and+blocks+K-Ras+signal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).</li>
<li>Moghal, N., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidermal+growth+factor+system+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).</li>
<li>Sundaram, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RTK%2FRas%2FMAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">RTK/Ras/MAPK signaling.</a> WormBook. , 1-19 (2006).</li>
<li>Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+22+genes+that+affect+the+vulval+cell+lineages+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).</li>
<li>Katz, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+extracellular+domain+activates+LET-23%2C+the+Caenorhabditis+elegans+epidermal+growth+factor+receptor+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).</li>
<li>Hara, M., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+farnesyltransferase+inhibitors+suppress+the+phenotype+resulting+from+an+activated+ras+mutation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).</li>
<li>Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Caenorhabditis+elegans+to+evaluate+inhibitors+of+Ras+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo.</a> Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).</li>
<li>van der Hoeven, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingomyelin+Metabolism+Is+a+Regulator+of+K-Ras+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function.</a> Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).</li>
<li>Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+lin-1+encodes+an+ETS-domain+protein+and+defines+a+branch+of+the+vulval+induction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway.</a> Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+diet+mediates+pathogen+and+stress+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 15 (3), 1008011(2019).</li>
<li>Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+human+microbiome+drug+metabolism+by+gut+bacteria+and+their+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes.</a> Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).</li>
<li>Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+EGF+receptor-mediated+vulva+development+by+the+heterotrimeric+G-protein+G-alpha+q+and+excitable+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans.</a> Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

ההסתה שאנו מתארים באמצעות התולעת היא פשוטה וזולה לזיהוי מעכבים של פונקציית EGFR ו- RAS. C. elegans הוא מודל אטרקטיבי לגילוי סמים כי זה קל לגדול במעבדה בשל מחזור החיים הקצר (3 ימים ב 20 °C (20 °C) ואת היכולת לייצר מספר גדול של זחלים. חשוב מכך, מסלול EGFR-RAS-ERK MAPK נשמר מבחינה אבולוציונית ותפקודית עם יונקים המספקים מערכת מתיחה גנטית כדי לנתח את ההשפעות של מעכבי EGFR ו- RAS. יתר על כן, האופי השקוף של התולעים מאפשר לחוקר לדמיין מבנים נפרדים ולוקליזציה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או פלואורופור אחר הותך לחלבוני...

המסלולים התאיים המסדירים אירועים התפתחותיים בתוך אורגניזמים נשמרים מאוד בקרב כל metazoans. מסלול אחד כזה הוא EGFR-RAS-ERK מיטוגן מופעל חלבון קינאז (MAPK) איתות מפל שהוא מסלול קריטי השולט התפשטות תאים, בידול, הגירה והישרדות1,2. פגמים במסלול איתות זה יכולים להוביל מצבים פתולוגיים או מחלות כגון סרטן. קולטן גורם הגדילה האפידרמלי (EGFR) הראה שהוא בא לידי ביטוי רב בגידולים אנושיים, כולל 50% של קרצינומות תאיקשקשאוראליים, ותורם להתפתחות גידולים ממאירים 3,4,5. בעוד מוטציות בשלושת איזופורמים RAS H-, K- ו- N-RAS הם מניעים עיקריים לשינוי ממאיר בסרטן אנושי מרובה. בין אלה שלושה isoforms RAS, מוטציות oncogenic ב K-RAS הם הנפוצים ביותר6,7,8. כדי ש-EGFR ו-RAS יפעלו, הם חייבים להתאים את קרום הפלזמה (PM). מניעת לוקליזציה של מולקולות אלה לראש הממשלה יכולה לעצור לחלוטין את הפעילות הביולוגית של מסלול איתות זה9,10. מכאן עיכוב של לוקליזציה של חלבונים אלה לראש הממשלה היא אסטרטגיה טיפולית כדי לחסום את איתות במורד הזרם ואת התוצאות השליליות וכתוצאה מכך. באמצעות בדיקת סינון בעלת תוכן גבוה, פנדלין, חוסם תעלות סידן מסוג L, זוהה כמעכב של פעילות K-RAS11. ננו-הכללה של K-RAS לעלון הפנימי של ראש הממשלה מצטמצמת באופן משמעותי בנוכחות פנדילין. יתר על כן, K-RAS מופץ מחדש מקרום הפלזמה לרטיקולום אנדופלסמי (ER), מנגנון גולגי, אנדוזומים וציטוסול. חשוב מכך, התפשטות של קווי תאים סרטניים בלבלב, המעי הגס, הריאות וארירית הרחם המבטאות מוטציה אונקוגנית K-RAS נחסמת על ידי עיכוב של איתות במורד הזרם על ידי פנדלין11. נתונים אלה מציעים פנדלין פונקציות כמו טיפול נגד K-RAS ספציפי שגורם לוקליזציה שגויה של חלבון RAS לראש הממשלה.
אלגנס מנמודה Caenorhabditis נחקר בהרחבה בהקשר של התפתחות. רבים מנתולי האות השולטים בהתפתחות התולעת הם אבולוציוניים ושמורבים מבחינה תפקודית. לדוגמה, ההפעלה המתווכת של EGFR של RAS וההפעלה הבאה של מפל האות ERK MAPK נשמרים בתולעת12. המפל מיוצג על ידי החלבונים הבאים: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 הוא הומולוגי ל RAS, בעוד LET-23 הוא הומולוגי EGFR. בתולעת, מסלול זה מסדיר את התפתחות הפות13. הפות הוא צמצם אפיתל על דופן הגוף הגחון של התולעת המאפשרת להניח ביצים מופרות. היווצרות הפות בתולעת תלויה בחשיפה של תאי המבשר הפותיים (VPC) למעבר צבע של הפעלת מפל האות EGFR-RAS-MAPK. במהלך ההתפתחות הרגילה, VPCs הפרוקסימלי לקבל אותות חזקים מתאי עוגן gonadal להבדיל לתוך 1° ו 2° גורל תאים אשר מעוררים פותפונקציונלית 12. בעוד ש-VPCs דיסטליים מבדילים לגורלי תאים של 3° שמתמזגים לסנכרון ההיפודרמלי ואינם יוצרים פות עקב איתות מדולדל. בהיעדר איתות, כל ה-VPCs מבדילים לגורל תאים של 3° וכתוצאה מכך נוצרים פות. עם זאת, איתות מהווה גורם מוביל להיווצרות פות אחת או יותר שאינה פונקציונלית בשל האינדוקציה של כל ה-VPN להניח גורל תא של 1° ו-2°.
מוטציות הגורמות אינדוקציה פות פגומה או מוגזמת זוהו עבור רבים מהגנים המקודדים חלבונים המייצגים מסלול זה. אינדוקציה פות פגומה גורמת פנוטיפ vulvaless (Vul), בעוד אינדוקציה פות מוגזמת תוצאות פנוטיפ multivulva (Muv) המיוצג על ידי התפתחות של פסאודוטובה חוץ רחמית לא מתפקדת רבים לאורך דופן הגוף הגחון. ה פנוטיפ Muv לידי ביטוי על ידי זן let-60(n1046) נובע רווח של מוטציה פונקציה ב RAS, בעוד בזן let-23(sa62) זה נובע מוטציה מפעילה EGFR14,15. פנוטיפ Muv חזק בזנים מוטנטיים אלה הוכח להיות מוטרד על ידי התערבויות פרמקולוגיות כפי שהוכח על ידי הטיפול של let-60(n1046) תולעים עם מעכב MEK-1 U012616,17. מעניין, הראינו כי R-פנדלין ומעכבים המשפיעים על חילוף החומרים של sphingomyelin לדכא את פנוטיפ Muv בתולעת18. כדי להדגים מעכבים אלה לחסום let-60 איתות ברמה של RAS, זן האפס lin-1 כבר מנוצל17. Lin-1 הוא גורם שעתוק מעכב דמוי Ets המתפקד כמדכא בהתפתחות הפות19. חזרה חזקה של פנוטיפ Muv בתולעים let-60(n1046) ואין השפעה על תולעים ריקות lin-1 מציע כי עכבות אלה מתרחשים ברמה של RAS.
בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש ב- C. elegans כמודל לזיהוי מעכבים של חלבוני RAS ו- EGFR. באמצעות מצודה מבוססת נוזלים, אנו מדגימים את ההשפעות המעכבות של R-fendiline על ידי דיכוי פנוטיפים Muv ב let-60(n1046) ו let-23(sa62) זנים מוטנטיים של C. elegans. הבדיקה הזו מאמתת את השימוש ב- C. elegans ככלי בשלב הראשוני של גילוי תרופות לטיפולים נגד.

<table><tbody><tr><td><חזק>מדיה וכימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז&nbsp;</td><td>מיליפור סיגמא&nbsp;</td><td>A9539-50G</td><td></td></tr><tr><td>בקטו פפטון&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0118-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD דיפקו אגר&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0145-17-0</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco LB מרק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0446-17-3</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>ICN10138201</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>ניסטטין</td><td>אקרוס אורגני</td><td></td><td></td>AC455500050</tr><tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>פישר מדעי</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן pפוספט מונו-בסיסי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>R-פנדילין</td><td></td><td></td><td>מסונתז מסחרית (באיכות פרמצבטית)</td></tr> <tr><td>נתרן אזיד</td><td>Millipore סיגמא&nbsp;</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>8.25% נתרן היפוכלוריט&nbsp;</td><td></td><td></td><td>אקונומיקה</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין סולפט&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>(&מינוס;)-טטרמיזול הידרוכלוריד</td><td>מיליפור סיגמא&nbsp;</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UO126 (מעכב MEK)</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>19-147</td><td></td></tr><tr><td><חזקים>חומרים מתכלים&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטיים&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565-269</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות צנטריפוגה סטריליים חרוטיים מפוליפרופילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-565-271</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות חד פעמיות מפוליסטירן 10 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-574</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות חד פעמיות מפוליסטירן 25 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-200-575</td><td></td></tr><tr><td>מס' 1.5&nbsp; 18 מ"מ X 18 מ"מ תלושי כיסוי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי עם מכסה שקוף (60 x 15 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי עם מכסה שקוף (100X15 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה (75 x 25 מ"מ)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>12- צלחות תרבית רקמות באר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-197-4804</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פריזמה</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td><זני חיידקים חזקים>חזקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli OP50</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><זני תולעים חזקים></חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקים>זנים</חזקים></td><td><חזקים>גנוטיפ</חזקים> </td><td><חזק>טרנסגן</חזק></td><td><חזק>מקור</חזק></td></tr><tr><td>MT2124 &nbsp;</td><td>let-60(n1046) IV.</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>MT7567</td><td>lin-1(sy254) IV.</td><td></td><td>CGC</td></tr><tr><td>PS1839</td><td>let-23(sa62) II.</td><td></td><td>CGC</td></tr></tbody></table>

זיהוי מעכבי egfr ו- ras באמצעות אלגנים של caenorhabditis

Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans

השינויים לוקליזציה קרום פלזמה של קולטן גורם גדילה אפידרמלי (EGFR) ואת המחולל במורד הזרם שלה RAS היו מעורבים במספר מחלות כולל סרטן. הנמטודה C. elegans החיים החופשיים מחזיקה מפל אות EGFR-RAS-ERK MAP אבולוציוני ומשומר מבחינה תפקודית, שהוא מרכזי להתפתחות הפות. רווח של מוטציות פונקציה בהומולוגיה RAS LET-60 ו EGFR הומולוג LET-23 לגרום לדור של פסאודובולבה חוץ רחמית לא מתפקדת גלויה לאורך דופן הגוף הגחון של תולעים אלה. בעבר, פנוטיפ multivulval (Muv) בתולעים אלה הוכח להיות מעוכב על ידי מולקולות כימיות קטנות. כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש בתולעת ב- assay מבוסס נוזל כדי לזהות מעכבים שמבטלים את הפעילות של חלבוני EGFR ו- RAS. באמצעות מטען זה, אנו מראים R-פנדלין, מעכב עקיף של K-RAS, מדכא את פנוטיפ Muv לידי ביטוי let-60(n1046) ו let-23(sa62) תולעים מוטנטיות. הבדיקה היא פשוטה, זולה, אינה גוזלת זמן להתקנה, וניתן להשתמש בה כפלטפורמה ראשונית לגילוי טיפולי נגד נגד.

אנו מדגימים תחילה כי R-פנדלין מסוגל לדכא את פנוטיפ Muv בזן המוטנטי let-60(n1046) בהשוואה לתולעים שטופלו ב- DMSO. הנתונים שלנו מראים כי R-fendiline הוא מסוגל לחסום את פנוטיפ Muv ב let-60(n1046) באופן תלוי מינון(איור 2A,B). עם זאת, אי היפוך של פנוטיפ Muv נצפתה בזן מוטציה null lin-1 בתגובה לריכוזים גוברים של R-fendiline (איור 2B). הנתונים מצביעים על כך בלוקים R-פנדלין מופעל let-60 איתות ברמה של RAS ב C. elega...

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

The changes in the plasma membrane localization of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and its downstream effector RAS have been implicated in ...

ניתן להשתמש בפרוטוקול זה בשלב הראשוני של גילוי תרופות כדי לזהות מעכבים המבטלים את פעילותם של חלבוני EGFR ו-RAS. היתרון העיקרי של בדיקה זו הוא שניתן לדמיין בקלות השפעות מעכבות של טיפולים נגד EGFR ואנטי-RAS ב-C.egelans. התחל באיתור 100 מיקרוליטר של E.coli OP50 שגדל במהלך הלילה במרכז כל צלחת NGM.הניחו לצלחות להתייבש במשך 24 שעות במכסה המנוע הלמינר, ואז אחסנו אותן בכלי פוליסטירן. בעזרת קוטף תולעים סטרילי, אספו 10 עד 12 תולעים בוגרות מצלחת שגדלה בעבר והעבירו אותן לצלחת NGM טרייה עם E.coli OP50. דגרו את הצלחת למשך 24 שעות בחום של 20 מעלות צלזיוס.לאחר 24 שעות, השתמש במכוש תולעים סטרילי כדי להסיר תולעים בוגרות מהצלחות. דגרו על הצלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך כשלושה ימים כדי לאפשר לעוברים להתפתח לתולעים בוגרות גרבידיות. אסוף תולעים בוגרות לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר על ידי שטיפת שתיים עד ארבע צלחות עם M9W.גלולה את התולעים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב-450 פעמים G למשך דקה אחת, ואז שפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התולעת. הכן תמיסת ליזה לתולעים על ידי שילוב של 400 מיקרוליטר של 8.25% נתרן היפוכלוריט ו -100 מיקרוליטר של חמישה נתרן הידרוקסיד רגיל. הוסף תמיסה זו לכדור התולעת והחלק את הצינור לערבוב.שימו לב לליזה של התולעים תחת מיקרוסקופ מנתח כדי למנוע הלבנת יתר של העוברים. כאשר 70%

identification-of-egfr-and-ras-inhibitors-using-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

Neurexins ו neuroligins הם קרום תא עצב הידבקות חלבונים אשר מבצעים תפקידים חיוניים בידול הילוכים הסינפטי ו. Neuroligin מוטנטים לקוי...

הימנעות אוסמוטי ב Caenorhabditis elegans: Synaptic פונקציה של שני גנים, Orthologues של האדם NRXN1 ו NLGN1, כמו מועמדים אוטיזם

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

כמותיים אוטומטי תפוקה גבוהה הגנום כולו RNAi המסכים ג elegans</em

אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף...

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

אנו מתארים שיטות ללמוד היבטים של amylopathies...

<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; מערכת מודל לחקר Amylopathy

בעוד dsRNA ההאכלה בג elegans הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את תפקוד גן, פרוטוקולים הנוכחיים למסכי האכלה בקנה מידה גדולה יביאו ליעילות מציאה משתנה. אנו מתארים פרוטוקול משופר לביצוע מסכי האכלת RNAi בקנה מידה גדולה, כי תוצאות במציאה יעילה ולשעתקו מאוד של ביטוי גנים.

מציאה גן בקנה מידה גדולה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; שימוש בספריות האכלת dsRNA ליצור פנוטיפים הפסד של הפונקציה חזקות

כאן, אנו מציגים עבור בידודו של RNA DNA, חלבונים מדגם זהה, פרוטוקול, במאמץ להפחית את הווריאציה לשפר הפארמצבטית, להקל על פרשנויות.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

כדי לחקור אינטראקציות מלווה מלווה מלווה-מצע, אנו מבצעים מסכי אינטראקציה סינתטית ב elegans Caenorhabditis באמצעות הפרעות RNA בשילוב עם מוטציות קלות או ביטוי יתר של מלווים ולנטר תפקוד לקוי של חלבון ספציפי לרקמות ברמה האורגנית.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

שיטה זו מתארת פרוטוקול להכנת תמצית חלבון בתפוקה גבוהה מדגימות אלגנים של Caenorhabditis ו- co-immunoprecipitation לאחר מכן.

הכנת תמצית חלבון ושיתוף חיסוני מאלגנים של קנורהאביטיס

Caenorhabditis elegans משמשים כמערכת מודל מצוינת עם שיטות חזקות ובעלות נמוכה לסקר את תוחלת החיים, תוחלת החיים והחוסן ללחץ.

סקר שיטות בעלות נמוכה למדידת תוחלת החיים ותוחלת הבריאות ב - Caenorhabditis elegans

למדו לזהות מעכבי EGFR ו-RAS באמצעות Caenorhabditis elegans לגילוי תרופות נגד סרטן. שיטה זו מאפשרת הדמיה פשוטה וחסכונית של השפעות תרפויות על מסלולי מעבר אותות תאיים.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

גלה סרטונים נוספים