Name: הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: למד הדפסה ביולוגית של ספירואידי שד על רשתות אנדותל ליצירת מודלים תלת-ממדיים לסינון תרופות. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים למחקר סרטן ורפואה מותאמת אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי NIH 1R01HL140239-01 ל- AMC. ברצוננו להודות למרכז להדמיית תאים באוניברסיטת דרקסל.

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו להדפסה ביולוגית של ספרואידים בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם לתרבות משותפת עם תאי אנדותל גם בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם. צעדי פרוטוקול קריטיים כוללים היווצרות ראשונית של ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC. יש לנקוט משנה זהירות בהאכלת ספירואידים אפיתל, שכן הם מופרעים בקלות מתמיסת המטריצה. באופן דומה, ספירואידים אפיתל השד חייב להיות מטופלים בזהירות כאשר הם pipetted את הפתרון מטריצה מעורבב לתוך הרשתות. רשתות HUVEC לא צריך להיות מצופה גבוה מדי של צפיפות או עזב במשך יותר מ 16 שעות, כפי שהם יהוו monolayer או ...

מודלים של גידולים במבחנה במבחנה הם כלים חיוניים למחקר מכני של צמיחת סרטן וגרורות. עבור סרטן השד בפרט, תאי אפיתל השד בתרבית Matrigel לארגן לתוך ספרואידים מקוטבים הדומים יותר לארכיטקטורה acinus ממארי in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. 3D תרבית תאי אפיתל השד משפיע גם על תפקוד התא, עם תרביות 3D מראה הבדלים אפנון קולטן אפידרמיס (EGF)8,9; פונקציית אונקוגן, כולל ErbB210; צמיחה ואפופטוזיס איתות11,12; והתנגדותכימותרפית 13,14. תאי אנדותל כלי דם מגיבים באופן דומה באופן שונה לגירויים סביבתיים בתלת מימד לעומת תרבות דו מימדית מסורתית15,16,17,18. עם זאת, רוב ההבנה של אינטראקציות אנדותל ושד כלי הדם אפיתל מגיע תרבות 2D באמצעות בינוני מותנה או Transwell מוסיף, או מודלים 3D שבו שני סוגי התאים מופרדים פיזית19,20,21,22,23. מודלים אלה של תרבות משותפת מספקים תובנה פיזיולוגית מוגבלת, שכן הן תרבות 3D והן מגע תאים הם קריטיים אנדותל כלי הדם – אינטראקציות תא אפיתל השד24,25,26.
מודלים סרטן 3D כבר מפוברק באמצעות מגוון רחב של טכניקות, כולל היווצרות ספירואיד טיפה תלויה, bioprinting, הרכבה מגנטית, ותרבות בתוך הידרוג'לים או על פיגומים מהונדסים5,27,28,29. לאחרונה, מודלים גידול 3D נוצרו עם סוגי תאים מרובים מסודרים במבנים 3D בהתאמה שלהם. בדוגמה אחת של פלטפורמת גידול על שבב, סרטן, אנדותל, תאים סטרומה היו מעורבבים לתוך מטריצה ולאחר מכן מוזרק לתוך שלושת תאי הרקמה המרכזיים במכשיר polydimethylsiloxane (PDMS). תאי הרקמה היו גובלים בשני ערוצים חוץים שייצגו עורק ונוזל. לאחר 5-7 ימים של תרבות, תאי אנדותל יצרו רשת microvascular ותאי סרטן התפשטו כדי ליצור גידולים קטנים ליד כלי הדם. פלטפורמה זו שימשה אז כדי לסנן סמים ושילובי סמים30. פלטפורמות נוספות לגידול על שבב נוצרו כדי לחקור גרורות וסוגי סרטן עם גירויים מכניים ספציפיים (למשל, זן מכני בריאה)31,32. עם זאת, פלטפורמות אלה בדרך כלל אינן כוללות הן כלי דם וסרטן במבנים 3D בהתאמה שלהם.
Biofabrication מראה הבטחה גדולה בקידום 3D במודלים גידולים במבחנה כלי דם, שכן הוא מאפשר שליטה מרחבית הדוקה על מיקום התא. למרות הצמיחה של bioprinting בעשור האחרון, מחקרים מעטים להתמקד במיוחד על גידולים33,34. בדוגמה אחת, הדפסה תלת מימדית של תאי HeLa בהידרוגל ג'לטין/אלגינט/פיברינוגן שימשה ליצירת מודל סרטן צוואר הרחם במבחנה. תאים סרטניים הודפסו ביולוגית כתאים בודדים ולאחר מכן הורשו ליצור ספרואידים, אשר הראו קצב התפשטות גבוה יותר, ביטוי מטאלופרוטאינאז מטריצה מוגברת, ו chemoresistance גבוה יותר מאשר תאים בתרבות 2D35. במחקרים אלה, כמו רבים אחרים36,37, השעיות תאים מנותקים הודפסו ביולוגית, ולאחר מכן תרביות התא סופקו עם רמזים מכניים וביוכימיים הנדרשים כדי לאפשר לתאים ליצור מבנה 3D. עם זאת, הרכבה עצמית תאית עשויה להימשך ימים או שבועות, עשויה לדרוש רמזים סביבתיים מרחביים וטמפורליים מורכבים, או לא להתרחש כאשר שני סוגי תאים הם תרבית משותפת. לדוגמה, תאי אפיתל השד גרמו למוות תאי בתאי אנדותל בתרבית דו-ממדית, ותאי אפיתל שד מנותקים לא נוצרו כדוריות תלת-ממדיות כאשר הודפסו ביולוגית באלגינאט/ג'לטין הידרוג'ל38. אפיתל שד מנותק או תאים סרטניים יצרו ספרואידים בביוינקים מבוססי אלגינט רק כאשר נלכדו בתבניות PDMS עגולות. במקרים אחרים, spheroids נוצרו באמצעות טיפות מושעה בלוחות באר עגולים מצורף אולטרה נמוך ולאחר מכן מעורבב לתוך bioinks מבוסס אלגינט39,40.
כעת אנו מתארים שיטה חלופית 3D רקמה biomanufacturing בפרוטוקול זה. במקום לזרוע תאים מנותקים ולחכות שתאים אלה ייצרו את המבנים תלת-ממדיים, אנו מתארים כיצד ליצור ולהדפיס ביולוגית ספרואידים של גידולים תלת-ממדיים ברשת צינור כלי דם כדי ליצור מודל תרבות-שיתוף גידולים שניתן להשתמש בו כמעט מיד. ניתן לגדל ספרואידים של גידולים במבחנה או להפיקם מרקמות אנושיות (אורגנואידים). באופן דומה, צינורות כלי דם ניתן לגדל או יכול להיגזר שברים microvascular רקמת שומן. Bioinks יכול לנוע בין אלגינט פעיל ביולוגית כדי Matrigel פעיל מאוד ביולוגית41. מאז מודל זה 3D גידול שיתוף תרבות יכול להיווצר עם מגוון רחב של מבני תאים bioinks, זה יכול לשלב סוגי תאים מרובים, מטריצות חוץ תאיות, ומדרגי כימוקין15,42. בעוד בניסוח הנוכחי שלה, רשתות אנדותל לא ניתן לחדור, איטרציות עתידיות יכול לשלב שיטה זו עם microfluids או על שבב מערכות. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל שד תלת מימדי על רשתות אנדותל מאפשרת ביופבריציה מהירה של מודלים של השד האנושי לבדיקות סמים ורפואה מדויקת מותאמת אישית27.

<table><tbody><tr><td>37&deg; חממת C, 5% CO2 ו-95% לחות</td><td>Sanyo</td><td>MCO-20AIC</td><td>דגירה של תאים</td></tr><tr><td>מדפסת ביו תלת מימדית</td><td>בהתאמה אישית</td><td>ללא</td><td>משמש להדפסה ביולוגית</td></tr><tr><td>של שקופיות תא 8 בארות</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>53106-306</td><td>לזריעת ספרואידים</td></tr><tr><td>מחט 25 מד</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>Z192406-100EA</td><td>מחט מזרק הדפסה ביולוגית</td></tr><tr><td>אתנול מוחלט (200 הוכחה)</td> <td>סיגמאסנט לואיס, MO</td><td>E7023-500ML</td><td>קונסטרוקציה מחדש של רכיבי מדיה</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab&prime;),2 שברי עז נגד עכבר IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch, ווסט גרוב, פנסילבניה</td><td>115006020</td><td>בלוק משני - אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (1:200)</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>A-11006</td><td>Seconday נוגדנים-אינסולין בקר אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td></td><td>סיגמא, סנט לואיס, מיזורי</td><td>I-035-0.5ML</td><td>MCF10A תוסף מדיה</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>A2153-500G</td><td>חומר חוסם -אימונופלואורסצנציה</td></tr><tr><td>פלקון 70 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק</td><td>352350</td><td>הסר ספרואידים גדולים או מקובצים</td></tr><tr><td>CellTracker&trade; צבע אדום CMTPX</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>C34552</td><td>צביעה מוקדמת לצינורות HUVEC</td></tr><tr><td>צנטריפוגה קומפקטית</td><td>הרמל- Labnet, אדיסון, NJ</td><td>Z206A</td><td>לצנטריפוגות תאים</td></tr><tr><td>כולרה טוקסין</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>C8052-.5MG</td><td>MCF10A תוסף מדיה</td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 15 מ"ל</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>62406-200</td><td>איסוף והשעיה מחדש של תאים</td></tr><tr><td>הרוזנת II-FL מונה תאים</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>AMQAF1000</td><td>תאי ספירת</td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית (10 מ"ל)</td> <td>VWR, Radnor, PA</td><td>76184-746</td><td>השעיית תאים</td></tr><tr><td>DMEM F:12</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>11320033</td><td>MCF10A מדיה בסיסית</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>10-014-CV</td><td>MDA-MB-231 מדיה בזאלית</td></tr><tr><td>אנדותל בזאלי בינוני-2 (EBM-2)</td> <td>לונזה, דורהאם, NC</td><td>CC-3156</td><td>HUVEC מדיה בזאלית</td></tr><tr><td>מדיום צמיחה אנדותל-2 (EGM-2)</td><td>Lonza, Durham, NC</td><td>CC-3162</td><td>מלווה בערכת כדורים (המכילה גורמי גדילה)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&trade; 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td></td><td>תיוג MDA-MB-231 ספרואידים</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Cytiva, Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>תוסף מדיה HUVEC/MDA-MB-231</td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>16210064</td><td>רכיב תיוג אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>G8898-500G</td><td>רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>62249</td><td>כתמי גרעין אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>16050130</td><td>MCF10A תוסף מדיה</td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון</td><td>סיגמא, סנט לואיס, MO</td><td>H0888-5G</td><td>MCF10A תוסף מדיה</td></tr><tr><td>תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs)</td><td>יישומי תאים, סן דייגו, קליפורניה</td><td>200-05f</td><td>קווי תאי אנדותל</td></tr><tr><td>אינטגרין ואלפא; 6</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>MAB1378</td><td>רכיב תיוג ספרואיד אימונופלואורסצנטי מבחן</td></tr><tr><td>מת חי</td><td>Thermo Fisher, Waltham, MA</td><td>L3224</td><td>בדיקת כתם תאים חיים ומתים לכדאיות התא</td></tr><tr><td>LSM 700 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss, Thornwood, NY</td><td></td><td>משמש להדמיית תאים</td></tr><tr><td>מטריג'ל - גורם גדילה מופחת 10 מ"ג/מ"ל</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>354230</td><td>ספרואיד היווצרות</td></tr><tr><td>תאי MCF10A</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317</td><td>קו תאי שד</td></tr><tr><td>תאי MDA-MB-231 תאי</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td>קו תאי שד</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma, סנט לואיס, MO</td><td>158127-500G</td><td>קיבוע תאים</td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>15140122</td><td>MCF10A / MDA-MB-231 / HUVEC תוסף מדיה</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח 1X (PBS)</td> <td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>7001106</td><td>מאגר שטיפה לתאים לפני טריפסיניזציה</td></tr><tr><td>מאגר פוספט מלח 10X</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>AM9625</td><td>רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>להאריך זהב אנטי-דהייה</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>P36934</td><td>מדיום אימונופלואורסצנטי רכובנט</td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי, EGF</td><td>פפרוטק, רוקי היל, ניו ג'רזי</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A / רכיב מדיית בדיקה</td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמה, סנט לואיס, MO</td><td>S2002-25G</td><td>רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מזרק סטרילי (10 מ"ל)</td> <td>VWR, Radnor, PA</td><td>75846-757</td><td>תהליך הדפסה ביולוגית</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות (10 ס"מ)</td> <td>VWR, Radnor, PA</td><td>25382-166</td><td>תרבית תאים חד שכבתית</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, סנט לואיס, מיזורי</td><td>T8787-250ML</td><td>רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>טריפן כחול 0.4%</td> <td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td></td><td>תוסף נגד תאים</td></tr><tr><td>15250061 טריפסין-EDTA 0.05%</td> <td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td></td><td>ניתוק תאים 25300054</td></tr><tr><td>טווין -20</td><td>תרמו פישר, וולת'אם, MA</td><td>85113</td><td>רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF165)</td><td>Peprotech, Rocky Hill, NJ</td><td>100-20</td><td>תוסף צינור HUVEC</td></tr><tr><td>Volocity 6.3 תוכנת הדמיית תאים</td><td>PerkinElmer, Hopkinton, MA</td><td></td><td>Z מדחס מחסנית</td></tr></tbody></table>

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

Direct Bioprinting of 3D Multicellular Breast Spheroids onto Endothelial Networks

Bioprinting מתגלה ככלי מבטיח לפברק מודלים של סרטן אנושי 3D כי טוב יותר לסכם סימני ההיכר הקריטיים של ארכיטקטורת רקמת vivo. בהדפסה ביולוגית של שחול שכבה אחר שכבה, תאים בודדים מובלטים בביו-ינק יחד עם רמזים מרחביים וטמפורליים מורכבים לקידום הרכבה עצמית של רקמות היררכיות. עם זאת, טכניקה זו biofabrication מסתמך על אינטראקציות מורכבות בין תאים, bioinks ורמזים ביוכימיים וביופיזיים. לכן, הרכבה עצמית עשויה להימשך ימים או אפילו שבועות, עשויה לדרוש bioinks ספציפי, ולא תמיד יכול להתרחש כאשר יש יותר מסוג תא אחד מעורב. לכן פיתחנו טכניקה להדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידים אפיתל שד תלת-ממדיים שנוצרו מראש במגוון ביו-לינקים. ספירואידים אפיתל שד 3D מעוצבים מראש קיימו את הכדאיות שלהם ואת הארכיטקטורה המקוטבת לאחר ההדפסה. בנוסף הדפסנו את הכדורואידים בתלת-ממד על רשתות תאי אנדותל של כלי הדם כדי ליצור מודל של תרבות משותפת. לכן, טכניקת ההדפסה הביולוגית החדשה יוצרת במהירות מודל שד אנושי תלת מימדי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בעלות נמוכה יותר ועם גמישות גבוהה יותר מאשר טכניקות הדפסה ביולוגית מסורתיות. טכניקת ביו-הדפסה רב-תכליתית זו ניתנת להדפסה כדי ליצור מודלים תלת-ממדיים של רקמות אחרות בביו-ינקים נוספים.

תאי אפיתל השד צריך להתארגן עצמית לתוך 3D spheroids לאחר 5-8 ימים של תרבות על פתרון מטריצה במדיום תרבות עם 2% פתרון מטריצה. כדורי אפיתל שאינם גידוליים של שד MCF10A צריכים להופיע עגולים ויש להם מרכז חלול, עם אינגרין α6 מקוטב לקצה החיצוני של הספרואיד(איור 1,inset מראה מרכזים חלולים). תאי אפיתל סרטן השד פולשניים מאוד MDA-MB-231 יוצרים ספרואידים לא סדירים. Spheroids יש להשתמש כאשר הם סביב 100 – 300 מיקרומטר קוטר. כאשר ספרואידים הופכים גדולים מדי להגיע בסמיכות, spheroids יתאחדו יחד כדי ליצור מגהספ...

המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.

Bioprinting is emerging as a promising tool to fabricate 3D human cancer models that better recapitulate critical hallmarks of in vivo tissue ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר הדפסה של מבנים תאיים תלת מימדיים מוכנים מראש כגון ספרואידים אפיתל שד המאפשרים היווצרות מהירה של מודלים רלוונטיים מבחינה ביולוגית ומגוון דיו ביולוגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדפסה ביולוגית של ספרואידים תלת מימדיים של גידול על גבי רשת כלי דם שניתן להשתמש בה כמעט באופן מיידי לכל מחקר ניסיוני. מודלים אלה של רקמות מודפסות ביולוגית בתלת מימד מספקים פלטפורמה מהירה במבחנה הניתנת להרחבה לרפואה מדויקת מותאמת אישית.ניתן ליישם שיטת הדפסה ביולוגית תלת מימדית רב-תכליתית זו על מערכות פיזיולוגיות אחרות שבהן אינטראקציות תלת מימדיות עם כלי הדם חשובות. להיווצרות כדורי אפיתל בשד, הקפיאו תחילה 200 קצות פיפטה מיקרוליטר למשך 30 דקות והניחו תמיסת מטריצה מופחתת גורם גדילה על קרח. כאשר הקצוות קפאו, השתמשו בקצה פיפטה קר קר קרח אחד לכל באר, הוסיפו 30 מיקרוליטר מתמיסת המטריצה הקרה כקרח על הצד ולאורך הפינות של כל באר של מגלשה תאית בת שמונה בארות, והוסיפו טיפה אחרונה למרכז כדי להבטיח ציפוי אחיד.לאחר שכל הבארות מצופות, דגרו את המגלשה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 15 עד 20 דקות. בזמן שהמטריצה עוברת פילמור, השעו מחדש את תאי MCF 10A במדיום הבדיקה MCF 10A בריכוז כפול 10 לחמישה תאים למיליליטר. בתום הדגירה מוסיפים לכל באר 50 מיקרוליטר תאים ו -450 מיקרוליטר של מדיום גידול כדורי MCF 10A ומיד מחזירים את השקופית לחממה.כל ארבעה ימים, הטה את מגלשת החדר לזווית של 45 מעלות כדי לאפשר החלפה של 200 מיקרוליטר של סופרנטנטים במצע גידול ספרואיד טרי לכל באר. להיווצרות רשת HUVEC, הכינו תמיסת מטריצה מצופה שקופית תא שמונה בארות כפי שהודגמה וצבעו מראש צלחת של 10 סנטימטר של HUVECs עם 10 מיקרוליטר של גשש תאים אדומים למשך 30 דקות בחממת תרבית התאים. בתום הדגירה יש לשטוף את תאי האנדותל עם 10 מיליליטר PBS חם לפני הטיפול בהם בשני מיליליטר של 0.05% טריפסין EDTA.לאחר חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני, נטרלו את הטריפסין עם חמישה מיליליטר של גידול אנדותל בינוני 2 והעבירו את התאים לצינור חרוטי של 25 מיליליטר לצנטריפוגה. השעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום בסיסי אנדותל נטול סרום שניים לספירה ודללו את התאים לאחד כפול 10 לריכוז שישה תאים למיליליטר. לאחר מכן הוסף אחת כפול 10 לחמשת ה-HUVECs לכל באר והנח את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך שש שעות.לאחר חמישה עד שמונה ימי תרבית, ספרו את מספר הספרואידים בכל באר בתמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה מייצגת והשתמשו בקצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כאשר 0.5 הסנטימטרים האחרונים של הקצה הוסרו כדי לאסוף בזהירות את כל הספרואידים מכל באר של החלקה של שמונה הבארות לתוך צינור של 50 מיקרוליטר. השהה מחדש את הספרואידים בדיו ביולוגי מתאים ב-100 ספרואידים לכל ריכוז דיו של 100 מיקרוליטר וטען את הספרואידים המאגרים למזרק סטרילי של 10 מיליליטר. ציידו את המזרק במחט סטרילית בגודל 25 והצמידו את המזרק למערכת ההצבה הביולוגית.הסר את המדיום מכל באר של רשת HUVEC והוציא 100 מיקרוליטר של ספרואידים אפיתל שד לכל אחת משש הבארות של מגלשת תא הרשת HUVEC בקצב זרימה של מיליליטר אחד של ספרואידים לדקה. לאחר מכן הוסיפו 400 מיקרוליטר של מדיום גידול כדורי MCF 10A לכל באר והניחו את התרביות המשותפות בחממת תרבית התאים למשך 24 עד 96 שעות. לאחר חמישה עד שמונה ימים של תרבית כפי שהודגם, ספרואידים אפיתל שד MCF 10A שאינם גידוליים אמורים להופיע עגולים עם מרכז חלול עם אינטגרין אלפא-6 מקוטב לקצה החיצוני של הספרואיד.תאי אפיתל של סרטן השד MDA-MB-231 פולשניים מאוד יוצרים ספרואידים לא סדירים שעלולים להראות תאים נודדים החוצה מהספרואידים אם הם נשמרים בתרבית המטריגל זמן רב מדי. לאחר שש עד שמונה שעות של תרבית דלילה ללא סרום כפי שהודגם, ניתן לדמות רשתות HUVEC על ידי ניגודיות פאזה או מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר הדפסה ביולוגית של ספרואיד אפיתל השד על רשתות HUVEC, גם הספרואידים וגם הרשתות צריכים לשמור על המורפולוגיה המקורית שלהם למשך 24 שעות לפחות.הדבר העיקרי שיש לזכור בעת ניסיון פרוטוקול זה הוא לטפל בספרואידים בזהירות לפני ההדפסה כדי למנוע אשכולות. לאחר הדפסה ביולוגית ותרבית משותפת, ניתן למדוד את כדאיות תאי הגידול, התפשטותם, נדידתם ואינטראקציות ביוכימיות אחרות עם רשת האנדותל עם ובלי טיפול תרופתי. הראינו שניתן להתחיל בדיקת תרופות כבר שעתיים לאחר הדפסה ביולוגית של תרבית משותפת ובדקנו תוספת ספרואידים לרשתות האנדותל עם התרופה האנטי-סרטנית פקליטקסל.

direct-bioprinting-3d-multicellular-breast-spheroids-onto-endothelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מסביר את ההדפסה הביולוגית המגנטית התלת-ממדית של תאי סרטן הלבלב והפיברובלסטים בתרבית משותפת. תאי סרטן הלבלב ותאי פיברובלסט פעילים של הלבלב מתורבתים בתרבית משותפת וממוגנטים באמצעות מכלול ננו-חלקיקים תואם ביולוגית, ליצירת ספרואידים, בהשפעת כוחות מגנטיים.

תרביות קו-תרביות ספרואידים תלת-ממדיות מודפסות ביולוגית: שיטה לגידול משותף של תאים סרטניים ופיברובלסטים

מדפסת ביולוגית קרטזית תוכננה ויוצרה כדי לאפשר שקיעה מרובת חומרים בגיאומטריות מדויקות הניתנות לשחזור, תוך מתן אפשרות לשליטה בגורמים סביבתיים. באמצעות המדפסת הביולוגית התלת מימדית, ניתן להדפיס מבנים מורכבים ובני קיימא ולשכפל אותם בקלות.

כדאיות של מבנים ניידים Bioprinted באמצעות מדפסת הקרטזיאני Dispenser שלוש

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

פיתחנו מודל סרטן השד הטרוגנית המורכבת מונצחים הגידול פיברובלסט ותאי נעוץ bioink alginate/ג'לטין bioprintable. המודל recapitulates microenvironment הגידול ויוו ואסטמה ומקילה על היווצרות הגידול multicellular spheroids, מניבים תובנות מנגנוני נהיגה tumorigenesis.

Bioprintable Alginate/ג'לטין הידרוג 3D במבחנה דגם מערכות זירוז היווצרות ספרואיד תא

מוצג כאן הוא פשוט לשימוש, ליבה/פגז, תלת מימדי ביוריטינג הגדרת עבור הייצור צעד אחד של הפיגומים החלול, מתאים הנדסת רקמות של כלי דם ומבנים צינורי אחרים.

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

דשים מהונדסים דורשים רשת כלי דם פונקציונלית משולבת. בפרוטוקול זה, אנו מציגים שיטה לייצור דש רקמה מודפס בתלת-ממד המכיל רשת כלי דם היררכית ואת האנסטומוזות המיקרו-כירורגיות הישירות שלה לעורק עצם הירך של החולדה.

ייצור דשים וסקולריים מהונדסים באמצעות טכנולוגיות הדפסה בתלת-ממד

אנו מציגים פרוטוקול לייצור תפוקה גבוהה של תעלות כלי דם עם גדלים גמישים ודפוסים רצויים על לוח סטנדרטי של שש בארות באמצעות טכנולוגיית הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, המכונה כלי על צלחת (VOP). לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לקדם את הפיתוח של טיפולים להפרעות הקשורות לאנדותל בסיכון.

שיטת הדפסה ביולוגית בתפוקה גבוהה למידול חדירות כלי דם בלוחות סטנדרטיים בעלי שש בארות עם גודל וגמישות דפוס

יש צורך קריטי במודלים תלת מימדיים של סרטן הלוכדים הצלבה הטרו-תאית כדי לחקור גרורות סרטניות. המחקר שלנו מציג את הדור של הטרו-אפיתל סטרומלטי-תאי בסביבה נטולת פיגומים ופיגומים שניתן להשתמש בהם לחקר פלישה והתפלגות מרחבית תאית.

תאי סטרומה הטרו-תאיים בתרביות תלת מימד ללא פיגומים של תאי סרטן אפיתל כדי להניע פלישה

למד הדפסה ביולוגית של ספירואידי שד על רשתות אנדותל ליצירת מודלים תלת-ממדיים לסינון תרופות. שיטה זו מאפשרת יצירה מהירה של מודלים ביולוגיים רלוונטיים למחקר סרטן ורפואה מותאמת אישית.

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

גלה סרטונים נוספים