ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

פפטוגליקומיקס משתמש בספקטרומטריית מסה מתקדמת בשילוב עם ניתוח נתונים ביואינפורמטי רב עוצמה כדי לבחון את הרכב הפפטידוגליקן בפירוט עדין. שימוש באלגוריתמים ביואינפורמטיים מאפשר ניתוח, חילוץ והשוואה של נתוני מפרט המוני על פני אוסף של קבצי נתונים בו זמנית, מפחית את עומס העבודה ומגדיל את הדיוק. להבנת הווריאציות והשינויים המגוונים של פפטידוגליקן יש השלכות על הבנת תהליכים תאיים, כולל גדילה וחלוקה, התחמקות חיסונית של המארח ועמידות אנטי-מיקרוביאלית.

אנו ממליצים להכין ולנתח תת-קבוצה קטנה של דגימות תחילה כדי להכיר את הפרוטוקול ולפעול כפרויקט פיילוט להערכת הפרמטרים הניסיוניים. מכיוון שתוכנת ניתוח נתונים של ספקטרומטריית מסה משתנה לעתים קרובות בהגדרות המשמשות בעת תיאור תכונות ופונקציות, הדגמה חזותית תסייע למשתמשים ביישום פרוטוקול זה על פני פלטפורמות. למיצוי שקיות פפטידוגליקן, השעו מחדש כדורי תאים קפואים בכ-1 עד 10 מנפח התרבית המקורי בנתרן פוספט של 20 מילי-מולרי בארבע מעלות צלזיוס לפני הוספת תרחיף התא טיפה לרתיחה של 8% SDS ב-20 מילי-מולרי נתרן פוספט לנפח סופי של אחד לאחד.

שמרו על רתיחה עדינה במשך 30 דקות עד שלוש שעות תוך ערבוב כדי להבטיח דיסוציאציה מלאה של הממברנה. התערובת המתקבלת צריכה להיות צלולה לחלוטין ללא גושי תאים או צמיגות שנותרו. כאשר התמיסה התקררה לטמפרטורת החדר, אספו את השקיות על ידי אולטרה צנטריפוגה, ולאחר מכן חמש עד שבע כביסות בכ-50 מיליליטר נתרן פוספט בטמפרטורת החדר 20 מילי-מולרי לכל שטיפה עד שלמאגר הכביסה יש ריכוז SDS של כ-0.001% כפי שנקבע על ידי צבע קולורימטרי.

לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את השקיות ב-5 עד 10 מיליליטר של נתרן פוספט בטמפרטורת החדר 20 מילי-מולרי והשלימו את הדגימה ב-50 מיקרוגרם למיליליטר עמילאז, DNase ו-RNase במגנזיום גופרתי של 10 מילי-מולרי למשך שעה אחת עם תסיסה או אגוז ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לעכל את התגובה למשך הלילה עם 100 מיקרוגרם למיליליטר פרונאז בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר לאחר אולטרה צנטריפוגה, הרתיחו את הדגימה למשך שעה אחת ב-25 מיליליטר של 2% SDS ו-20 מילי-מולרי נתרן פוספט בספינת קיטור.

בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימה חמש עד שבע פעמים עם 50 מיליליטר מים מזוקקים כפולים בטמפרטורת החדר כפי שהודגם. כאשר ריכוז ה-SDS מגיע לכ-0.001%, השעו את הגלולה בכמות מספקת של מים מזוקקים כפולים כדי לקבל תרחיף שקיות ולשטוף את המיכל. לאחר אחסון לילה במינוס 80 מעלות צלזיוס, יש לבצע ליופיליזציה של הדגימה הקפואה לפני דילול השקיות ל-10 מיליגרם פפטידוגליקן למיליליטר של ריכוז מים מזוקקים כפול.

לניתוח LC-MS, התחל פרויקט חדש בתוכנת המכשיר והקצה את קבצי הנתונים המתאימים של LC-MS QTOF למצב הניסוי המעניין. הפעל את אשף עיבוד הנתונים חילוץ תכונות רקורסיביות באצווה והגדר את מסנני עיבוד הנתונים כך שיתאימו לפרמטרים של תנאי LC-MS והמכשור כדי לזהות במדויק קבוצה ולאמת שיאי מסה לטעינה המייצגים מורופפטידים בודדים. סקור את התוצאות בסוף חילוץ התכונות.

אם מספר משמעותי של תכונות לא הצליח ליישר קו בקבוצה, התאם את פרמטרי הסינון הרקורסיביים כדי להרחיב או להגביל את חלון הזיהוי לפי הצורך. לאחר מכן ייצא את הנתונים כקובץ החלפה מורכב. לניתוח תכונות ספקטרליות דיפרנציאליות, התחל פרויקט חדש בתוכנת המערכת ופעל לפי ההוראות לייבוא נתונים.

במהלך ניתוח הנתונים, בחר את המשמעות ושינוי הקיפול לניתוח דיפרנציאלי והגדר את נתוני הבסיס לעוצמה החציונית בכל קבצי הנתונים. לאחר השלמת הניתוח, בחן את הניתוחים הגרפיים והסטטיסטיים המתקבלים כדי לזהות מורופפטידים המדגימים שינוי משמעותי בשפע בין תנאי הניסוי שנבדקו. תחת נווט הפרויקט, לחץ לחיצה ימנית על הניתוחים השונים ובחר אפשרות ייצוא כדי לשמור את פרטי התכונה כקובץ tsv.

הקפד לשמור ניתוחים מרובים כדי להשיג את כל הנתונים הרלוונטיים. בתוך תוכנת הניתוח הדיפרנציאלי, תחת פרשנות תוצאות, בחר דפדפן מזהה, הוסף ספרייה של מבני מורופפטיד צפויים, ובחר פרמטרים דומים כפי שהודגמו עבור חילוץ התכונה כדי לייצר ביאור מורופפטיד חזוי עבור כל תכונה שזוהתה. כדי לאשר באופן ידני את ביאור המורופפטיד החזוי, השווה את שיאי יחס המסה למטען של כרומטוגרמה ספקטרומטריית מסה טנדם ליחס המסה למטען החזוי של כל הפיצולים האפשריים של מבנה מורופפטיד ידוע.

השתמש בעורך מולקולרי כדי לצייר את מבנה המורופפטיד החזוי באמצעות כלי פיצול המסה כדי להראות את יחס המסה למטען של שברי ספקטרומטריית המסה כאשר כל קשר נשבר בנפרד או בשילוב, ולאחר מכן השווה את כל הפיצולים האפשריים של מבנה המורופפטיד לכרומטוגרמה של ספקטרומטריית מסה טנדם. כדי לאשר את ביאור המורופפטיד, יש למצוא את שיאי יחס המסה למטען של שברים מרובים בכרומטוגרמה של ספקטרומטריית מסה טנדם עם חלון יישור יחס מסה למטען מינימלי מאוד. כדי להעריך את השינויים הגלובליים בשינויים במורופפטיד, ערוך את קובץ ה-tsv של המורופפטידים בעלי השינוי הגבוה המובהקים סטטיסטית כדי לכלול עמודה אחת עבור כל שינוי במורופפטיד.

אכלס את העמודה הזו עם ייעוד לכל muropeptide עם הערות והעלה את קובץ ה-tsv שהשתנה ל-Perseus. תחת ביאורים שורות, לחץ על ביאורים לשורות באופן קטגורי והוסף קבצי נתונים לכל פרמטר ניסיוני. לאחר מכן, תחת הבדיקה, לחץ על שתי בדיקות לדוגמה כדי לבצע מבחן T של תלמיד ולחץ על 1D כדי לבצע הערות חד-ממדיות.

רגישות גילוי מוגברת של מכונות ספקטרומטריית מסה יחד עם תוכנת זיהוי שיא רבת עוצמה שיפרה את היכולת לבודד, לנטר ולנתח הרכבי חומרים של דגימות מורכבות בפירוט זעיר מאוד. שיוך כל שיא מסה למטען המופק מנתוני ספקטרומטריית המסה עם מורופפטיד מסוים מתאפשר על ידי הצלבה עם מסד נתונים של מבני מורופפטיד ידועים וחזויים. ניתן להשוות את כרומטוגרמה של ספקטרומטריית מסה טנדם של פיצול עבור כל תכונה שחולצה לפרופיל הפיצול של המורופפטיד המוצע באמצעות מסד הנתונים.

ניתן להשתמש בחלקות הר געש כדי להדגיש מורופפטידים המדגימים שינוי מובהק סטטיסטית בכמות גבוהה של שפע בין התנאים שנבדקו. כאשר בוחנים יחד, ניתן לבחון מספר מורופפטידים בעלי אותו שינוי עבור מגמה למצב ניסוי אחד ולהעריך את הקבוצה כולה למשמעות. מעקב אחר שינוי מורופפטיד בדרך זו יכול לזהות פעילות אנזימטית מסוימת המושפעת מפרמטר הניסוי.

בנוסף, חריגים ממגמה זו עשויים לחשוף פעילויות אנזימטיות בעלות ספציפיות מסוימת או תפקוד ביולוגי. הליך זה בוחן שינויים ביוכימיים ושינויים ביולוגיים בפולימרים, ובכך מספק תובנה לגבי הפעילות האנזימטית הפועלת על PG in vivo. בחינת הרכב ה-PG באימות פירוט תסייע בהבנת מבנים תאיים מורכבים שיש לה השלכות על תהליכים פיזיולוגיים קריטיים רבים.