ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם

שיטה זו מאפשרת זיהוי ונתיחה של מקטעי חצוצרות זרע ספציפיים לשלב המאפשר לחקור שלבים ספציפיים מאוד בזרע. ניתן לזהות את השלבים של מחזור האפיתל הזרע בצינורות טריים ולא קבועים, ולכן אנו יכולים לבחור רק את שלבי העניין לניתוחים במורד הזרם. זה דורש תרגול מסוים כדי ללמוד לזהות את השלבים על בסיס דפוסי ההארה שלהם, אבל פרוטוקול זה אמור להבטיח את הצלחתך.

שתדגים את ההליך תהיה אופימי אולוטו, שהיא דוקטורנטית במעבדה שלי. התחל בהנחת עכבר זכר בוגר בן 8 שבועות לפחות במצב שכיבה וחיטוי הבטן הגחונית עם 70% אתנול. השתמש במספריים סטריליים כדי לבצע חתך בצורת V באזור אגן הבטן, והשתמש במלקחיים סטריליים כדי למשוך את כרית השומן האפידידימלית כדי לאתר את האשכים.

השתמש במספריים כדי לנתח את האשכים, והניח את הרקמות בצלחת פטרי סטרילית בגודל 100 מילימטר עם PBS בזמן הקציר. השתמש במספריים עדינים כדי לחתוך חריץ בטוניקה אלבוגינאה, היריעה הסיבית העבה העוטפת את האשכים, והשתמש במלקחיים כדי לקרוע את הטוניקה וכדי לאלץ את הצינוריות החוצה. מניחים את צינורות הזרע ללא המכסה בצלחת פטרי חדשה, ומוסיפים מספיק PBS סטרילי כדי לכסות את תחתית המנה.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים כדי למשוך בעדינות את הצינורות מבלי לפגוע ברקמות. לצורך חיתוך הצינורות, הדביקו את המנה על במת מיקרוסקופ ניתוח והפעילו את התאורה. השתמש במלקחיים עדינים כדי להזיז בזהירות את צרורות הצינורות כדי להכיר את דפוסי ספיגת האור והפיזור של השלבים השונים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים עם קצה מחובר כדי להרים צינורית מעניינת והשתמש במספריים מיקרו-דיסקציה כדי לחתוך קטע באורך מתאים. לאחר חיתוך מקטעי הצינורות הספציפיים לשלב, השתמש בפיפטה כדי לאסוף קטע מעניין בנפח של 10 מיקרוליטר של PBS והנח את הקטע על שקופית מיקרוסקופ. לחץ בזהירות על זכוכית כיסוי בגודל 20 על 20 מילימטר על הצינורית מבלי למעוך את התאים יותר מדי והנח את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.

הנח נייר סינון על קצה זכוכית הכיסוי כדי להקל על התפשטות התאים לשכבה אחת והשתמש במטרה פי 40 כדי לאמת את שלבי התא. לאחר שהתאים יצרו שכבה חד-שכבתית עגולה משני קצוות הצינורית, טבלו את השקופית במיכל של חנקן נוזלי למשך 10 שניות. השתמש באזמל כדי להפוך את הכיסוי מהתאים ולהניח מיד את השקופית באתנול 90% למשך 2 עד 5 דקות.

לאחר מכן, יבש באוויר ואחסן את המגלשה בטמפרטורת החדר עד מספר ימים. לצביעה חיסונית שלמה של צינורות הזרע, השתמש בפיפטה כדי להעביר מקטעים מעניינים לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר של PBS קר כקרח על קרח. לאחר שאפשרת לקטעים לשקוע, הסר בזהירות את ה- PBS.

מוסיפים 10 מיליליטר PBS טרי קר כקרח ומערבבים בהיפוך. הניחו לצינורות להתייצב מספר דקות לפני שתסירו שוב את הסופרנטנט כפי שהודגם. כאשר כל הסופרנטנט הוסר, קבע את הצינוריות ב-5 מיליליטר של פרפורמלדהיד למשך חמש שעות ב-20 עד 30 סיבובים לדקה ב-4 מעלות צלזיוס.

בתום הדגירה, הניחו לצינורות להתייצב מספר דקות לפני שטיפת הדגימה שלוש פעמים ב-PBS טרי ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לכל שטיפה עם סיבוב. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש בפיפטה של 1 מיליליטר כדי להעביר 10 עד 20 מקטעי צינורות קבועים לצינור תחתון עגול של 2 מיליליטר. כאשר הקטעים התייצבו, החלף את הסופרנטנט ב-1 מיליליטר של 2% BSA ו-10% FBS ב-PBSX למשך שעה אחת של דגירה בטמפרטורת החדר ו-20 עד 30 סיבובים לדקה.

בתום הדגירה החוסמת יש לשטוף את הדגימות עם 1 מיליליטר PBSX. לפני סימון הצינוריות ב-250 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני, יש לדלל אותו ב-1%BSA ב-PBSX למשך שעתיים בטמפרטורת החדר ב-20 עד 30 סיבובים לדקה. בתום הדגירה יש לשטוף את הצינורות שלוש פעמים ב-PBSX כפי שהודגם לפני סימון הדגימות ב-250 מיקרוליטר של הנוגדנים המשניים המתאימים למשך שעה, מוגנים מפני אור בטמפרטורת החדר ו-20 עד 30 סיבובים לדקה.

בתום הדגירה, שטפו את הצינוריות שלוש פעמים לפני שרוקנים את הצינוריות על מגלשת מיקרוסקופ בנפח קטן של סופרנטנט. לאחר מכן, השתמש בקצות העמסת ג'ל כדי לסדר את הצינורות לרצועות ליניאריות ולנקז את המאגר העודף. לאחר מכן, הוסף 1 עד 2 טיפות של אמצעי הרכבה לפני הרכבת השקופית עם כיסוי.

תחת תאורה, שלבים 7 עד 8 נראים כהים באופן הומוגני מכיוון שהם מכילים מספר גבוה של זרעונים מוארכים מרוכזים לחלוטין המיושרים על פני השטח האפיקליים של האפיתל. לאחר שחרור זרעונים בוגרים ללומן במהלך הזרע, הצינורית נראית חיוורת מאוד בשלבים 9 עד 10 עקב היעדר זרעונים מוארכים מרוכזים בתוך האפיתל. אזור חיוור זה מלווה באזור הנקודה החלשה, שהמראה הנקודתי שלו מקורו בארגון של זרעונים מוארכים עם כרומטין מרוכז בצרורות.

צרורות אלה הופכים בולטים מאוד באזור הנקודה החזק שלאחר מכן. צרורות זרעונים נודדים לעבר גרעיני תאי סרטולי הממוקמים קרוב ללמינה הבסיסית, מה שבא לידי ביטוי כמראה מפוספס של צינורות שלב 2 עד 5 כאשר הם מוארים. הצרורות מתפזרים לבסוף בשלב 6, וזרעונים מתארכים מתעבים נעים קרוב ללומן כדי להשתחרר מהאפיתל בשלב 8.

ניתן לאמת במדויק את השלב המדויק של קטע הצינורית על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של תכשירי הדלעת. ניתן להשתמש בצביעה חיסונית של תכשירי דלעת בשלבים כדי לחקור את הביטוי והלוקליזציה של חלבונים מעניינים באפיתל הזרע. צביעה שלמה של צינורית זרע משמשת בדרך כלל לחקר סוגי התאים הנמצאים במגע עם קרום הבסיס של אפיתל הזרע, בצד הצינורי או בצד הביניים.

השיטה יכולה לשמש גם לחקר תאים או מבנים הנמצאים עמוק יותר בתוך האפיתל, כגון מחסום הדם-אשך או תאי נבט פוסט-מיוטיים. בנוסף לצביעה חיסונית, אנו יכולים להשתמש במקטעי חצוצרות שלב לניתוחים רבים אחרים במורד הזרם, כולל בדיקות RNA וחלבונים ביוכימיים, ציטומטריית זרימה ותרבית חצוצרות ex vivo. מכיוון ששיטה זו מאפשרת ניתוח מפורט מאוד של הזרע, היא באמת מספקת כלי שימושי לחקר כל התהליכים החשובים הנדרשים לייצור הזרע ולפוריות הגבר.